鱈魚蛋白酶解肽不同分子量組分抗炎活性的比較研究

唐季清,郭珊珊,羅永康,景　浩,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.山東濱州萬(wàn)嘉生物科技有限公司,山東濱州 256600)

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鱈魚蛋白酶解肽不同分子量組分抗炎活性的比較研究

唐季清1,郭珊珊2,羅永康1,景浩1,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.山東濱州萬(wàn)嘉生物科技有限公司,山東濱州 256600)

本研究比較了鱈魚蛋白酶解肽(Cop protein hydrolytic peptide,CPHP)不同分子量組分對(duì)細(xì)胞炎癥因子釋放的抑制作用。鱈魚蛋白經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解制備得到鱈魚蛋白酶解肽(CPHP),并進(jìn)一步超濾得到三個(gè)不同分子量組分CPHP1(>5000 u)、CPHP2(<3000 u)和CPHP3(3000～5000 u)。用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子釋放為模型,分別采用Griess法和ELISA分析NO和TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞炎癥因子的含量。結(jié)果表明,CPHP不同分子量組分對(duì)LPS(500 μg/mL)所致的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制均有顯著保護(hù)作用(p<0.05),其保護(hù)作用隨CPHP不同分子量組分的濃度升高而逐漸增強(qiáng);CPHP和CPHP1的保護(hù)作用強(qiáng)于CPHP2和CPHP3。CPHP不同分子量組分對(duì)LPS(1 μg/mL)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05),其抑制作用隨CPHP不同分子量組分的濃度升高而逐漸增強(qiáng);CPHP和CPHP1的抑制作用強(qiáng)于CPHP2和CPHP3?？傊?CPHP不同分子量組分對(duì)LPS所致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制均有顯著的保護(hù)作用(p<0.05),對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子的釋放均有顯著抑制作用(p<0.05);CPHP和CPHP1的細(xì)胞保護(hù)作用和炎癥因子釋放抑制作用均強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的。

鱈魚酶解肽,RAW264.7細(xì)胞,炎癥因子

近年來研究發(fā)現(xiàn)魚蛋白酶解肽具有較好的生物活性。Liang等[1]將大馬哈魚皮蛋白酶解得到魚皮蛋白酶解肽,通過給大鼠飼喂酶解肽,證實(shí)了酶解肽可以有效減少腫瘤大鼠的死亡,并延長(zhǎng)腫瘤大鼠的存活時(shí)間;Wu等[2]對(duì)鯖魚蛋白酶解得到酶解肽,酶解肽的DPPH自由基清除率和還原能力隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高;且酶解肽與分離純化得到的較小分子量多肽相比,具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

目前已有一些關(guān)于魚蛋白酶解肽抗炎活性的報(bào)道。Sung等[3]報(bào)告用胰蛋白酶和α-凝乳蛋白酶酶解香魚蛋白制備得到酶解肽對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO以及TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放具有抑制作用。Ahn等[4]采用胃蛋白酶酶解三文魚胸鰭蛋白制備得到酶解肽及其1000～2000 u組分,后者對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO以及TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子釋放的抑制作用強(qiáng)于前者。Cheng等[5]采用堿性蛋白酶酶解金槍魚蛋白制備得到酶解肽,并分離純化得到兩條十一肽(1543.8 u和1211.5 u),結(jié)果顯示兩條十一肽對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-2、IFN-γ等炎癥因子釋放的抑制作用均強(qiáng)于酶解肽的。

鱈魚是一種主要分布于北太平洋和北大西洋兩側(cè)寒冷地帶的海洋經(jīng)濟(jì)魚類[6]。鱈魚蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解制得的酶解肽具有促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用[7];經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解制得的酶解肽具有較好的抗氧化活性[8]。王珊珊等[9]從鱈魚骨肉經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的骨膠原酶解肽中分離純化得到兩個(gè)組分BCH1(2000～6000 u)和BCH2(<2000 u)。BCH1和BCH2均可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化,其中BCH2的作用高于BCH1的。目前有關(guān)鱈魚酶解肽抗炎活性的研究未見報(bào)道,而且鱈魚酶解肽不同分子量組分的抗炎活性還有待比較確定。

為了研究比較鱈魚蛋白酶解肽不同分子量組分對(duì)細(xì)胞炎癥因子釋放的抑制活性,本研究采用復(fù)合蛋白酶酶解鱈魚蛋白制備得到鱈魚蛋白酶解肽(CPHP),并進(jìn)一步超濾得到CPHP1(>5000 u)、CPHP2(<3000 u)和CPHP3(3000～5000 u)。用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子釋放作為模型,采用Griess法和ELISA測(cè)定了CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

冷凍鱈魚肉山東濱州萬(wàn)嘉生物科技有限公司;小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7索萊寶生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基美國(guó)Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;胰蛋白酶、脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)美國(guó)Sigma公司;NO檢測(cè)試劑盒、青霉素/鏈霉素溶液(100×)碧云天生物技術(shù)研究所;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)美國(guó)Amresco公司;IL-1β、IL-6、TNF-α定量ELISA檢測(cè)試劑盒美國(guó)Biolegend公司;0.22 μm注射器濾膜美國(guó)Millipore公司;溶液配制采用去離子水。

680型酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Rad公司;PHS-3C+型酸度計(jì)成都市紀(jì)方舟科技有限公司;XB 220A型電子天平德國(guó)Precisa Gravimetrics AG公司;R800001236型孔板振蕩美國(guó)Biocote公司;MCO-15Acv型細(xì)胞培養(yǎng)箱日本Sanyo公司;BSC-1500IIA2-X型生物安全柜中國(guó)Biobase公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1鱈魚蛋白酶解肽的制備鱈魚蛋白酶解及分離純化過程如下:將冷凍鱈魚魚肉解凍,按料液比1∶1.5向魚肉中加水,95 ℃加熱15 min將內(nèi)源酶滅活,攪勻后用復(fù)合蛋白酶50 ℃酶解4 h。將酶解產(chǎn)物于95 ℃加熱15 min將復(fù)合蛋白酶滅活,再經(jīng)5000×g離心15 min。取其上清,得到酶解肽(CPHP)。將CPHP通過5000 u孔徑的中空纖維超濾膜,得到分子質(zhì)量>5000 u酶解肽組分(CPHP1)以及<5000 u的酶解肽組分,再將分子量<5000 u的組分通過3000 u孔徑的中空纖維超濾膜,得到分子量<3000 u的酶解肽組分(CPHP2)和3000～5000 u酶解肽組分(CPHP3)。四種不同分子量組分溶液最后經(jīng)冷凍干燥處理后制成粉末。稱取CPHP不同分子量組分凍干粉末于無(wú)菌離心管中,于生物安全柜中,加入無(wú)菌PBS(pH=7.4)分別配制成1、2和3 mg/mL的CPHP不同分子量組分溶液。

1.2.2RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞在細(xì)培養(yǎng)皿(直徑100 mm)內(nèi)用DMEM10(含10%胎牛血清的DMEM)培養(yǎng),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋孔底面積的90%時(shí),棄去培養(yǎng)液,向培養(yǎng)皿內(nèi)倒入約1 mL胰酶消化液(0.01% EDTA,0.25%胰酶),將培養(yǎng)皿放入37 ℃培養(yǎng)箱,放置15 min,向培養(yǎng)皿中加入5～7 mL DMEM10終止消化,用移液管反復(fù)吹打,顯微鏡下觀察直至形成單顆細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)皿。每2～3 d傳代一次。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的測(cè)定將RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度100 μL接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)基,加入100 μL不同終濃度的CPHP不同分子量組分溶液(0、1、2和3 mg/mL),于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后,棄上清,加入50 μL含LPS的培養(yǎng)基,于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,棄培養(yǎng)基,加入70 μL含0.5 mg/mL MTT的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,小心棄去上清,加入70 μL含0.04 N HCl的異丙醇溶液,震蕩5 min,在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。以對(duì)照組為100%,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率。

1.2.4細(xì)胞炎癥因子的測(cè)定將RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度1 mL接種于24孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)基,加入1 mL不同終濃度的CPHP不同分子量組分溶液(0、1、2和3 mg/mL),于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后,棄上清,加入500 μL含LPS的培養(yǎng)基,于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔吸取200 μL培養(yǎng)液于1.5 mL離心管作為樣品。采用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中NO的濃度,具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下,將NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋至1～100 μmol/L(0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L)。取96孔板,每孔依次加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、50 μL Griess Reagent I和50 μL Griess Reagent II,避光放置5 min,在540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。根據(jù)NaNO2濃度和吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中NO含量。分別采用IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒檢測(cè)樣品中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度,具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。根據(jù)IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度和吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中對(duì)應(yīng)炎癥因子的含量。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。單因素方差分析采用Minitab17.1.0軟件的one way ANOVA程序進(jìn)行分析。均數(shù)間比較利用Turkey檢驗(yàn)分析,顯著性水平設(shè)定為p<0.05。

表1　CPHP不同分子量組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Table 1　Effects of CPHP fractions on RAW264.7 cell growth

表2　CPHP不同分子量組分對(duì)LPS所致的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響Table 2　Effects of CPHP fractions on LPS-induced RAW264.7 cell growth inhibition

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);同行不同大寫字母表示差異顯著(p<0.05);表3～表6同。

2　結(jié)果與分析

2.1CPHP不同分子量組分對(duì)LPS所致的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的保護(hù)作用

2.1.1LPS和CPHP不同分子量組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響LPS在1～100 μg/mL時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響(p>0.05);在200 μg/mL時(shí),LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)開始有顯著抑制作用(p<0.05);在200～1000 μg/mL時(shí),隨著濃度的升高,LPS導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)(圖1)。因?yàn)闈舛葹?00 μg/mL時(shí)LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用為50%左右,所以采用500 μg/mL作為致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的LPS作用濃度。

圖1　LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effects of LPS on RAW264.7 cell growth 注:a～d不同字母表示各組平均值之間 具有顯著差異(p<0.05)。

由表1可知，CPHP不同分子量組分各濃度下(1、2和3 mg/mL)對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)顯著影響(p>0.05)。

2.1.2CPHP不同分子量組分對(duì)LPS所致的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的保護(hù)作用由表2可知，LPS在500 μg/mL時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對(duì)LPS導(dǎo)致的RAW264.7生長(zhǎng)抑制均有顯著的保護(hù)作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對(duì)LPS導(dǎo)致的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)。對(duì)CPHP不同分子量組分的保護(hù)作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的,CPHP2與CPHP3無(wú)顯著性差異(p>0.05);在1 mg/mL時(shí),CPHP與CPHP1無(wú)顯著差異(p>0.05);在2、3 mg/mL時(shí),CPHP1的強(qiáng)于CPHP的?？傊?CPHP不同分子量組分對(duì)LPS所致的細(xì)胞損傷均具有較好的保護(hù)作用,CPHP和CPHP1的保護(hù)作用強(qiáng)于CPHP2和CPHP3。

2.2CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

2.2.1CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響由表3可知，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)NO釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對(duì)LPS誘導(dǎo)NO釋放的抑制作用逐漸增強(qiáng)。對(duì)CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強(qiáng)于CPHP的;在1、2 mg/mL時(shí),CPHP2與CPHP3無(wú)顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時(shí),CPHP3的強(qiáng)于CPHP2的(p<0.05)。總之,CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的。

表3　CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響Table 3　Effects of CPHP fractions on LPS-induced NO release of RAW264.7 cells

表4　CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β釋放的影響Table 4　Effects of CPHP fractions on LPS-induced IL-1β release of RAW264.7 cells

表5　CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-6釋放的影響Table 5　Effects of CPHP fractions on LPS-induced IL-6 release of RAW264.7 cells

2.2.2CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β釋放的影響由表4可知，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-1β釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對(duì)LPS誘導(dǎo)IL-1β釋放的抑制作用逐漸增強(qiáng)。對(duì)CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強(qiáng)于CPHP的;在1、2 mg/mL時(shí),CPHP2與CPHP3無(wú)顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時(shí),CPHP3的強(qiáng)于CPHP2的。總之,CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-1β釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的。

2.2.3CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-6釋放的影響由表5可知，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-6釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IL-6釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對(duì)LPS誘導(dǎo)IL-6釋放的抑制作用逐漸增強(qiáng)。對(duì)CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強(qiáng)于CPHP的;在1、2 mg/mL時(shí),CPHP2與CPHP3無(wú)顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時(shí),CPHP3的強(qiáng)于CPHP2的。總之,CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-6釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的。

2.2.4CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α釋放的影響由表6可知，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對(duì)LPS誘導(dǎo)TNF-α釋放的抑制作用逐漸增強(qiáng)。對(duì)CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強(qiáng)于CPHP的;在1、2 mg/mL時(shí),CPHP2與CPHP3無(wú)顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時(shí),CPHP3的強(qiáng)于CPHP2的。因此,CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強(qiáng)于CPHP2和CPHP3的。

表6　CPHP不同分子量組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF-α釋放的影響Table 6　Effects of CPHP fractions on LPS-induced TNF-α release of RAW264.7 cells

3　討論

LPS等炎性刺激因子可以與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合,激活髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor88,MyD88)信號(hào)通路,最終激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB),導(dǎo)致誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOs)、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2(PGE2)等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和釋放[10]。NO由iNOS催化生成,可進(jìn)一步生成RNS(Reactive nitrogen species)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷[11]。TNF-α有腫瘤細(xì)胞殺傷作用[12],可使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,趨化炎性細(xì)胞,還可通過激活NF-κB通路促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放[13]。IL-1β能促使細(xì)胞粘附因子的合成和釋放,加速單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[14]。IL-6促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞以及NK細(xì)胞的增殖分化[15]。這些細(xì)胞因子在細(xì)胞炎性反應(yīng)和慢性病的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。

Gayle等[16]報(bào)告LPS在80 μg/mL時(shí)作用72 h會(huì)引起胚胎鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO、TNF-α和IL-1β等炎癥因子,并導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。Campo等[17]報(bào)告LPS在50 μg/mL時(shí)作用24 h可抑制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)率至75%,加入1 mg/mL硫酸軟骨素可使細(xì)胞生長(zhǎng)率保持在95%。本實(shí)驗(yàn)中,LPS在500(g/mL時(shí)作用24 h可抑制RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)率至50%。CPHP不同分子量組分在1 mg/mL時(shí),可使RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)率保持在54%～58%。

Ahn等[4]報(bào)道了三文魚酶解肽對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子釋放具有抑制作用,其中1000～2000 u組分的抑制作用強(qiáng)于酶解肽的。De Mejia等[18]報(bào)告大豆多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放有較好的抑制作用,其中5 ku多肽的抑制作用強(qiáng)于8、14 ku多肽的。這些結(jié)果表明酶解肽低分子量組分對(duì)炎癥因子釋放的抑制作用均強(qiáng)于高分子量組分的。然而Park等[19]報(bào)道了紫殼菜蛤蛋白酶解肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放具有抑制作用,且>5 ku組分的抑制作用明顯強(qiáng)于1～5 ku組分的。本研究中CPHP高分子量組分的抑制作用強(qiáng)于低分子量組分的。這與Park等的研究結(jié)果一致。Wu等[2]對(duì)鯖魚蛋白酶解分離純化得到1400、900和200 u三條多肽,通過抗氧化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了1400 u的多肽相較于900 u和200 u的多肽具有更高的DPPH自由基清除率。這個(gè)報(bào)告也與本研究結(jié)果一致,酶解肽高分子量組分的生物活性強(qiáng)于低分子量組分的。

4　結(jié)論

CPHP不同分子量組分對(duì)LPS所致的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制均有保護(hù)作用,對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥因子(NO、IL-1β、IL-6和TNF-α)釋放均有抑制作用。CPHP和CPHP1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用和對(duì)炎癥因子釋放的抑制作用均強(qiáng)于CPHP2和CPHP3。

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Comparison of anti-inflammatory activity of four different molecular fractions of cod protein hydrolytic peptides

TANG Ji-qing1,GUO Shan-shan2,LUO Yong-kang1,JING Hao1,*

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Shandong Wanjia Biological Science and Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)

Effects of four different molecular fractions of cod protein hydrolytic peptides(CPHP)on LPS-induced release of inflammatory cytokines were compared. CPHP was a whole mixture of cod protein hydrolytic peptides hydrolyzed by complex protease. The peptides were further fractionated by ultrafiltration into three fractions of CPHP1(>5000 u),CPHP2(<3000 u)and CPHP3(3000～5000 u). Griess assay and ELISA kits were used to measure the levels of NO and inflammatory cytokines(TNF-α,IL-1βand IL-6),respectively. The results showed that the all CPHP fractions protected RAW264.7 cells from LPS(500 μg/mL)induced cell growth inhibition,in a dose dependent manner,and protective effects of CPHP and CPHP1 were higher than that of CPHP2 and CPHP3. All CPHP fractions inhibited release of NO,IL-1β,IL-6 and TNF-αfrom RAW264.7 cells induced by LPS(1 μg/mL),in a dose dependent manner. The inhibitory effects of CPHP and CPHP1 were higher than that of CPHP2 and CPHP3. In conclusion,all four fractions of CPHP had protective effect against LPS induced cell growth inhibition and release of inflammatory cytokines. The CPHP and CPHP1 had higher activity than that of CPHP2 and CPHP3.

cod protein hydrolytic peptide;RAW264.7 cells;inflammatory cytokines

2016-01-04

唐季清(1989- )，男，博士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品安全，E-mail：qing19890604@sina.cn。

景浩(1957- )，男，教授，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)方面的研究，E-mail：haojing@cau.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2016)14-0344-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.060