葡萄籽蛋白脫色試驗(yàn)研究

年賀鳳，朱桂花，韋萌萌，馬帥，黃梅（北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧夏銀川750021）

葡萄籽蛋白脫色試驗(yàn)研究

年賀鳳，朱桂花*，韋萌萌，馬帥，黃梅
（北方民族大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧夏銀川750021）

以寧夏葡萄籽為原料，采用堿溶酸沉淀法提取的葡萄籽粗蛋白呈紫褐色，對(duì)其脫色方法進(jìn)行研究。通過(guò)比較活性炭及雙氧水的脫色效果，確定了以雙氧水為脫色劑的試驗(yàn)方法。結(jié)果表明，脫色時(shí)白度和產(chǎn)率的控制條件相互制約，需綜合考慮實(shí)際需求選擇脫色條件。經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化并綜合考慮白度和產(chǎn)率兩項(xiàng)指標(biāo)，當(dāng)固液比為1∶25（g/mL）時(shí)，確定pH8.0、雙氧水用量15 mL、脫色溫度55℃、脫色時(shí)間40 min為最適脫色條件，該條件下脫色蛋白產(chǎn)率為78.21%，白度為14.71。

葡萄籽；蛋白；脫色；白度

我國(guó)是葡萄生產(chǎn)大國(guó)，每年的產(chǎn)量約有500多萬(wàn)t，葡萄釀酒、果汁加工過(guò)程中產(chǎn)生的下腳料主要是葡萄皮和葡萄籽，其中葡萄籽約占鮮果的4%～7%產(chǎn)量可觀。目前，曾經(jīng)作為廢棄物的葡萄籽受到廣泛關(guān)注，葡萄籽油、葡萄籽原花青素的提取和應(yīng)用已逐步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，市場(chǎng)上相關(guān)的高附加值產(chǎn)品層出不窮。葡萄籽榨油后的餅粕及提取原花青素后剩余物中含有12%～16%蛋白，其中包含谷氧酸、甘氨酸、丙氨酸等18種氨基酸，人體必需的8種氨基酸俱全，而擷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸含量都相當(dāng)于大豆蛋白中的含量，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，極具開(kāi)發(fā)潛力［1-2］。葡萄籽及其餅粕中的蛋白主要作為動(dòng)物飼料得以簡(jiǎn)單利用，且相關(guān)研究主要集中在蛋白的提取方面［3-5］，相信隨著對(duì)葡萄籽蛋白研究的不斷深入，這種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源將在食品、保健、特種飼料等方面大有作為，市場(chǎng)潛力巨大。

葡萄籽中含有大量色素，通過(guò)預(yù)處理后提取出的粗蛋白呈現(xiàn)褐色，有必要進(jìn)行脫色以利于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和利用。目前，實(shí)驗(yàn)室中對(duì)植物蛋白脫色常用的方法包括有機(jī)溶劑脫色法、活性炭脫色法、雙氧水脫色法［6］。有機(jī)溶劑脫色法是利用蛋白質(zhì)及脂類等雜質(zhì)在溶劑中的溶解度不同實(shí)現(xiàn)脫色，肖海峻［7］等以無(wú)水乙醇為浸提劑對(duì)苜蓿葉蛋白脫色脫腥工藝參數(shù)進(jìn)行了研究，但需要3級(jí)浸提才有理想的效果，過(guò)程較繁瑣?；钚蕴勘砻娴奈⒖捉Y(jié)構(gòu)使其對(duì)多數(shù)有機(jī)物質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附能力，陸晨［8］研究了活性炭對(duì)茶渣中蛋白的脫色性能，脫色率達(dá)90%時(shí)蛋白質(zhì)損失率超過(guò)60%，說(shuō)明活性炭對(duì)茶渣蛋白有較強(qiáng)的吸附作用。雙氧水是一種無(wú)色透明的液體氧化劑，可使植物粗蛋白中的有色物質(zhì)氧化分解，脫色效果明顯而且自身無(wú)殘留，安全性較高。羅倉(cāng)學(xué)［9］比較了次氯酸鈉、亞硫酸鈉、雙氧水3種不同的脫色劑對(duì)甘薯糖蛋白粗提物的脫色效果，表明雙氧水的脫色性能更優(yōu)。葡萄籽蛋白的脫色研究鮮有報(bào)道，本研究從實(shí)際應(yīng)用及安全性出發(fā)，比較了活性炭與雙氧水對(duì)葡萄籽粗蛋白的脫色效果，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了脫色試驗(yàn)條件，為葡萄籽蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

葡萄籽：寧夏紅釀酒廠；氫氧化鈉、濃鹽酸、石油醚、濃硫酸、硼酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅-溴甲酚氯指示劑：均為分析純?cè)噭?。粉末狀活性炭?00目～300目）、30%雙氧水：工業(yè)食品級(jí)。

1.2儀器設(shè)備

KA-1000離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；78-1磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA-1004N型電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司；SF-130型高速中藥粉碎機(jī)：長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠；101FAB-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海電光儀器儀表有限公司；WSB-1白度儀：上海昕瑞儀器儀表有限公司；半微量凱式定氮儀：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1葡萄籽粗蛋白的提取

葡萄籽粉碎并過(guò)60目篩，用石油醚以1∶2（g/mL）的料液比浸泡24 h進(jìn)行脫脂。脫脂葡萄籽粉與0.10 mol/L NaOH溶液以1∶25（g/mL）的料液比混合，于40℃水浴攪拌加熱30 min，冷卻至室溫離心分離，取上清液加入4 mol/L HCl溶液等電點(diǎn)沉淀。抽濾，取濾渣，置于50℃烘箱中5 h。干燥后研缽粉碎，得葡萄籽蛋白粗品，以脫脂葡萄籽為基準(zhǔn)計(jì)算產(chǎn)率，測(cè)定蛋白含量。

1.3.2蛋白含量測(cè)定

采用GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定葡萄籽蛋白含量。

1.3.3葡萄籽粗蛋白脫色效果檢測(cè)

葡萄籽粗蛋白及脫色蛋白經(jīng)干燥、研磨后測(cè)定白度。

1.3.4活性炭及雙氧水脫色效果比較試驗(yàn)

1.3.4.1活性炭脫色

向三角瓶中加入4.00 g葡萄籽粗蛋白及0.10 mol/L NaOH溶液，料液比為1∶25（g/mL），混合攪拌使蛋白質(zhì)溶解，加入活性炭粉末置于水浴中攪拌加熱30 min，趁熱抽濾，濾液冷卻至室溫后滴加4 mol/L HCl溶液至等電點(diǎn)，抽濾后的濾渣置于50℃烘箱中干燥5 h，研缽粉碎得脫色葡萄籽蛋白，以粗蛋白為基準(zhǔn)計(jì)算產(chǎn)率，測(cè)定白度及蛋白含量。

1.3.4.2雙氧水脫色

向三角瓶中加入4.00g葡萄籽粗蛋白及0.10mol/L NaOH溶液，料液比為1∶25（g/mL），混合攪拌使蛋白質(zhì)溶解，加入雙氧水置于水浴中攪拌加熱進(jìn)行脫色，溶液冷卻至室溫后滴加4 mol/L HCl溶液至等電點(diǎn)，抽濾后的濾渣置于50℃烘箱中干燥5 h，研缽粉碎得脫色葡萄籽蛋白，以粗蛋白為基準(zhǔn)計(jì)算產(chǎn)率，測(cè)定白度及蛋白含量。

1.3.5萄籽粗蛋白脫色單因素試驗(yàn)

以溶液pH、脫色劑用量、脫色時(shí)間、脫色溫度為考察因素，以脫色后葡萄籽蛋白的白度及蛋白產(chǎn)率為衡量標(biāo)準(zhǔn)，確定各單因素對(duì)脫色效果的影響規(guī)律。

1.3.5.1溶液pH的影響

在雙氧水用量為20 mL、脫色溫度65℃、脫色時(shí)間40 min的條件下，溶液pH分別為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5時(shí)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)脫色后蛋白白度及產(chǎn)率確定較優(yōu)的pH。

1.3.5.2脫色劑用量的影響

在pH為8.0、脫色溫度65℃、脫色時(shí)間40 min的條件下，雙氧水用量分別為5、10、20、30、40、50、60 mL時(shí)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)脫色后蛋白白度及產(chǎn)率確定較優(yōu)的脫色劑用量。

1.3.5.3脫色溫度的影響

在pH為8.0、雙氧水用量為20 mL、脫色時(shí)間為40 min的條件下，脫色溫度分別為40、50、60、70、80℃時(shí)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)脫色后蛋白白度及產(chǎn)率確定較優(yōu)的脫色時(shí)間。

1.3.5.4脫色時(shí)間的影響

在pH為8.0、雙氧水用量為20 mL、反應(yīng)溫度50℃的條件下，脫色時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min時(shí)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)脫色后蛋白白度及產(chǎn)率確定較優(yōu)的脫色時(shí)間。

1.3.6正交試驗(yàn)

優(yōu)化脫色條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，設(shè)計(jì)的因素水平見(jiàn)表1。

表1　 正交試驗(yàn)因素及水平表Table 1　The factors and levels of the orthogonal test

1.3.7驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)所確定的最優(yōu)脫色條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，以驗(yàn)證脫色方法的穩(wěn)定性及可靠性。

2　結(jié)果與分析

2.1活性炭及雙氧水脫色效果的比較

本試驗(yàn)采用堿溶酸沉法提取的脫脂葡萄籽粗蛋白呈紫褐色，粗蛋白產(chǎn)率48.06%，白度為3.07，凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量為50.47%?；钚蕴考半p氧水因脫色后無(wú)殘留而具有較高的安全性，但二者的脫色原理不同。活性炭比表面積大，通過(guò)物理吸附進(jìn)行脫色，其來(lái)源廣、價(jià)格低，對(duì)有色物質(zhì)的吸附能力在酸性溶液較強(qiáng)［10-11］，但吸附選擇性不高。H2O2是強(qiáng)氧化劑，通過(guò)對(duì)色素分子中的生色基的共軛雙鍵能產(chǎn)生破壞作用而脫色，自身易分解為水和氧氣，對(duì)環(huán)境及樣品無(wú)污染，其氧化能力在堿性條件下更強(qiáng)但穩(wěn)定性較差。本試驗(yàn)采用工業(yè)食品級(jí)活性炭及雙氧水分別進(jìn)行脫色試驗(yàn)，結(jié)果（見(jiàn)表2）表明：活性炭對(duì)葡萄籽粗蛋白吸附性強(qiáng)，脫色的選擇性較差，不適合做脫色劑；雙氧水脫色效果相對(duì)較好，由于葡萄籽蛋白只能在堿性條件下溶解后才可進(jìn)行脫色，雙氧水氧化性增強(qiáng)穩(wěn)定性降低，表現(xiàn)出使用量較大且對(duì)蛋白有一定的破壞作用，因此需進(jìn)一步優(yōu)化脫色條件。

表2　活性炭及雙氧水脫色試驗(yàn)結(jié)果比較Table 2　The result of activated carbon and hydrogen peroxide decolorizing test

2.2不同單因素對(duì)脫色效果的影響

2.2.1pH的影響

pH對(duì)脫色蛋白產(chǎn)率及白度的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　pH對(duì)葡萄籽粗蛋白脫色效果的影響Fig.1　Effect of pH on decolorization efficiency of grape seed crude protein

結(jié)果表明，隨著pH的增大，蛋白產(chǎn)率呈下降趨勢(shì)，白度則先增大后降低，pH為8.0時(shí)白度最大。雙氧水氧化能力隨溶液堿性增大而提高，導(dǎo)致對(duì)蛋白的破壞作用隨pH的升高而增強(qiáng)，使蛋白產(chǎn)率隨之下降，pH大于8.5時(shí)蛋白產(chǎn)率下降尤其明顯。白度的變化則說(shuō)明pH在一定范圍內(nèi)雙氧水以破壞色素為主，但堿性過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致以蛋白的氧化破壞作用為主而產(chǎn)生較多有色產(chǎn)物，從而使白度降低。綜合考慮白度和產(chǎn)率的變化情況，溶液的pH應(yīng)控制在8.0附近。

2.2.2脫色劑用量的影響

脫色劑用量對(duì)脫色蛋白產(chǎn)率及白度的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明，隨著雙氧水用量的增加，蛋白產(chǎn)率呈下降趨勢(shì)，白度則先增大后降低，說(shuō)明雙氧水在脫色時(shí)對(duì)蛋白也造成了破壞。雙氧水用量在10 mL至20 mL之間時(shí)蛋白產(chǎn)率變化不大，之后下降明顯。雙氧水用量在10 mL至40 mL之間時(shí)白度的增加緩慢，用量為40 mL時(shí)白度最大。綜合考慮白度和產(chǎn)率的變化情況，雙氧水用量控制在20 mL左右較為合適。

圖2　脫色劑用量對(duì)脫色蛋白產(chǎn)率及白度的影響Fig.2　Effect of amounts of decolorizing agents on decolorization efficiency of grape seed crude protein

2.2.3脫色溫度的影響

脫色溫度對(duì)脫色蛋白產(chǎn)率及白度的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　溫度對(duì)葡萄籽蛋白脫色效果的影響Fig.3　Effect of different temperature on decolorization efficiency of grape seed crude protein

由圖3可知，隨著脫色溫度的升高，脫色蛋白的白度提高而產(chǎn)率下降。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脫色溫度達(dá)80℃時(shí)溶液稠度明顯增加，而脫色溫度高于60℃時(shí)蛋白產(chǎn)率下降尤為明顯，說(shuō)明溫度的升高在促進(jìn)脫色的同時(shí)對(duì)蛋白的破壞作用也在增強(qiáng)。綜合考慮白度和產(chǎn)率的變化情況，脫色溫度應(yīng)控制在50℃～60℃的范圍內(nèi)。

2.2.4脫色時(shí)間的影響

脫色時(shí)間對(duì)脫色蛋白產(chǎn)率及白度的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　脫色時(shí)間葡萄籽蛋白脫色效果的影響Fig.4　Effect of different time on decolorization efficiency of grape seed crude protein

結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，葡萄籽蛋白的脫色效果逐漸增加，白度提高，脫色蛋白產(chǎn)率下降。脫色時(shí)間40 min以后，隨時(shí)間的增加白度急劇增加的同時(shí)蛋白產(chǎn)率亦急劇下降，說(shuō)明達(dá)到一定脫色時(shí)間時(shí)，雙氧水脫色及對(duì)蛋白的破壞作用幾乎同時(shí)加強(qiáng)，因此在應(yīng)用時(shí)可根據(jù)具體需求控制脫色時(shí)間。本試驗(yàn)綜合考慮白度和產(chǎn)率的變化趨勢(shì)，控制脫色時(shí)間在30 min～40 min可獲得較為穩(wěn)定的產(chǎn)率和白度。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脫色葡萄籽蛋白的白度與其產(chǎn)率基本成反比關(guān)系，但各因素對(duì)二者的影響規(guī)律又有差異，說(shuō)明單因素之間存在著相互影響，為了進(jìn)一步優(yōu)化脫色條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1），試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

白

度

表3　葡萄籽蛋白脫色正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3　Result of decolorization of grape seed crude protein orthogonal test

由表3可知，在正交試驗(yàn)的條件下，各因素對(duì)葡萄籽蛋白脫色產(chǎn)率的影響主次為A＞B＞D＞C，最佳組合為A2B1C3D2；對(duì)脫色蛋白白度的影響主次為B＞C＞D＞A，最佳組合為A3B3C2D3。從各因素極差的相對(duì)大小可以看出：脫色時(shí)溶液pH及雙氧水用量對(duì)產(chǎn)率影響較大，脫色溫度及脫色時(shí)間影響較小；脫色時(shí)雙氧水用量對(duì)白度影響較大，pH影響較小。從二者最佳組合的組成來(lái)看，脫色條件較溫和時(shí)產(chǎn)率較高，脫色條件劇烈時(shí)白度較高，說(shuō)明采用雙氧水對(duì)葡萄籽蛋白進(jìn)行脫色時(shí)白度和產(chǎn)率的控制條件相互制約，需綜合考慮實(shí)際需求選擇脫色條件。本試驗(yàn)綜合考慮白度和產(chǎn)率兩相指標(biāo)，選擇正交試驗(yàn)的第4組方案（A2B1C2D3）為較佳的組合，即pH為8.0、雙氧水用量為15 mL、脫色溫度為55℃、脫色時(shí)間為40 min，此條件下脫色蛋白產(chǎn)率為78.21%，白度為14.71。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

在5個(gè)三角瓶中分別稱取4.00 g葡萄籽粗蛋白，0.10 mol/L的NaOH溶液，料液比為1∶25（g/mL），混合攪拌使蛋白質(zhì)溶解后加入15 mL雙氧水，將溶液pH調(diào)整到8.0，料液比為1∶25（g/mL）置于水浴中55℃攪拌加熱40 min，5次平行試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　 驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果Table 4　Validation test and the result

結(jié)果表明，用雙氧水對(duì)葡萄籽粗蛋白進(jìn)行脫色的蛋白產(chǎn)率及白度平均值分別為77.88%和14.98，變異系數(shù)分別為0.51%和1.7%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較好的重現(xiàn)性，說(shuō)明該方法穩(wěn)定可靠。

2.5結(jié)論

采用堿溶酸沉法提取的葡萄籽粗蛋白呈紫褐色白度為3.07，蛋白含量為50.47%。通過(guò)工業(yè)食品級(jí)活性炭及雙氧水的脫色比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雙氧水脫色效果相對(duì)較好，且條件溫和、操作簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境無(wú)污染，可作為葡萄籽粗蛋白脫色的參考方法。試驗(yàn)表明，脫色時(shí)白度和產(chǎn)率的控制條件相互制約，脫色條件較溫和時(shí)產(chǎn)率高白度低，脫色條件劇烈時(shí)白度較高而產(chǎn)率較低，需綜合考慮實(shí)際需求選擇脫色條件。經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化并綜合考慮白度和產(chǎn)率兩項(xiàng)指標(biāo)，本試驗(yàn)選擇pH8.0、雙氧水用量15 mL、脫色溫度55℃、脫色時(shí)間40 min為最適脫色條件，該條件下脫色蛋白產(chǎn)率為78.21%，白度為14.71。

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Study on Decolorization of Grape-seed Crude Protein

NIAN He-feng，ZHU Gui-hua*，WEI Meng-meng，MA Shuai，HUANG Mei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Grape-seed crude protein which was purple brown in color was extracted from the Ningxia local grape seed used as raw material，by an alkali-solution and acid-isolation method.Herein，the decolorization of crude protein was studied.A bleaching method with H2O2as a kind of decolorant was finally selected through comparing the bleaching effects with active carbon and H2O2.The results showed that in bleaching，the conditions for whiteness and yield were restricting each other.Therefore，the bleaching conditions must be selected by comprehensively considering the actual demands.The optimum bleaching conditions were found by the singlefactor and orthogonal experiments and with the two aspects of whiteness and yield in consideration.The optimum conditions were that the solid-liquid ratio was 1∶25（g/mL），pH was 8.0，the quantity of H2O2was 15 mL，the bleaching time was 40 min，and the bleaching temperature was 55℃.The decolorized grape seed protein with a whiteness of 14.71 was produced under the optimum conditions，and the yield of the decolorized grape seed protein was 78.21%.

grapeseed；protein；decolorization；whiteness

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.004

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（201411407035）

年賀鳳（1993—），女（漢），本科生，制藥工程專業(yè)。

朱桂花（1964—），女（漢），教授，碩士，研究方向：化學(xué)工藝。

2015-08-21