姜黃素抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

冀潤(rùn)利　陳凱　許威

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·論著·

姜黃素抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

冀潤(rùn)利陳凱許威

目的探討姜黃素是否具有抑制體內(nèi)外胰腺癌的作用及其作用機(jī)制。方法不同濃度姜黃素處理胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1 72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，并選擇姜黃素的最佳濃度。經(jīng)最佳濃度姜黃素處理細(xì)胞后采用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AsPC-1早期細(xì)胞凋亡；觀察姜黃素對(duì)AsPC-1細(xì)胞遷移及侵襲的影響。建立胰腺癌原位瘤裸鼠模型，分別用低劑量(20 mg/kg體重)、高劑量(40 mg/kg體重)姜黃素對(duì)胰腺癌原位模型裸鼠進(jìn)行灌胃治療，8周后處死裸鼠，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，免疫組化法檢測(cè)裸鼠腫瘤組織中CD34、NF-κB、MMP-9的表達(dá)。結(jié)果不同濃度姜黃素處理AsPC-1細(xì)胞后呈劑量依賴(lài)性地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，增加細(xì)胞凋亡，以6 μmol/L姜黃素為最佳劑量。6 μmol/L姜黃素處理后，AsPC-1細(xì)胞的遷移覆蓋率從未處理細(xì)胞的70%下降到10%，穿膜細(xì)胞數(shù)從136個(gè)/200倍透視野下降到17個(gè)/200倍視野，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。姜黃素治療裸鼠胰腺癌移植瘤后，移植瘤體積從未治療組的(97.8±15.3)mm3縮小至低劑量組的(44.3±9.7)mm3及高劑量組的(28.1±7.1)mm3；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶數(shù)量從(108.3±6.7)個(gè)下降至(29.5±4.5)個(gè)及(8.9±2.4)個(gè)；瘤組織CD34表達(dá)量從20.5±2.3下降至10.3±1.2及7.9±3.2；MMP-9表達(dá)量從85.2±2.3下降至53.2±1.2及34.2±3.1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論姜黃素能夠抑制體內(nèi)外胰腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移，其作用可能是通過(guò)抑制CD34、MMP-9表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

胰腺腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；姜黃素

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81173393)；Forces Foundation of Logistics University of Chinese People′s Armed Police(WHM201222)；Xiqing Hospital Foundation(xqlx201406)

胰腺癌預(yù)后差主要是由于其早期診斷困難、無(wú)高效的藥物治療及癌細(xì)胞藥物抵抗等因素導(dǎo)致的[1-2]。因此，研究胰腺癌的病理機(jī)制及發(fā)展新的治療藥物至關(guān)重要。姜黃素(curcumin)是從姜科、天南星科根莖中提取的一種化學(xué)成分，其藥理作用已經(jīng)被廣泛研究[3]，目前被證明具有抗炎、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、抗腫瘤等作用[4]。另有研究表明[5]，姜黃素有調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，如NF-κB、Akt、Notch、mTOR及Hedgehog等通路的作用。雖然越來(lái)越多的研究證明姜黃素有抗腫瘤的作用，但其作用機(jī)制尚未清楚。本研究探討姜黃素抗腫瘤的機(jī)制，期待為臨床提供更有力的理論支持。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1來(lái)自天津中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。MTT、AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司。姜黃素購(gòu)自Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成不同濃度。細(xì)胞侵襲小室及基底膜類(lèi)似物(matrigel)購(gòu)于BD公司，CD34、NF-κB和MMP-9抗體均購(gòu)自Sigma公司。雄性BALB/c-nu/nu品系小鼠，體重20～25 g，5～6周齡，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度為(24±2)℃，相對(duì)濕度為40%～60%。飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)：采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AsPC-1細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板，每孔4×103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后分別加入2、3、4、5、6、7、8、9 μmol/L姜黃素，對(duì)照組細(xì)胞加入0.1% DMSO處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入5 mg/ml MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h后加入150 μl DMSO，上酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處的吸光值(A490值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算IC50值。

2．細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AsPC-1細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后加入IC50值的姜黃素濃度繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化離心后，PBS洗兩次，應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按說(shuō)明書(shū)操作。

3．細(xì)胞遷移及侵襲能力檢測(cè)：取AsPC-1細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞90%融合時(shí)用200 μl槍頭尖端緊貼培養(yǎng)孔底部，與底部垂直，在直視下緩慢均勻地推動(dòng)槍頭從培養(yǎng)孔的一側(cè)到另一側(cè)成一直線劃移，PBS洗掉漂浮細(xì)胞后加入IC50值的姜黃素孵育0、20 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移。參照文獻(xiàn)[6]的方法，采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

4．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AsPC-1細(xì)胞2×106個(gè)注射于裸鼠皮下，待其長(zhǎng)成大概1 cm3的瘤塊后取出，剪成1 mm3的組織塊。腹腔麻醉裸鼠后開(kāi)腹，剪開(kāi)胰腺被膜，將組織塊埋于胰尾近脾動(dòng)脈處。共制備27只荷瘤裸鼠，按體重隨機(jī)分成對(duì)照組、低劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組，每組9只。術(shù)后4周，低劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組分別給予20 mg/kg體重及40 mg/kg體重的姜黃素灌胃，每周3次，持續(xù)給藥2周，對(duì)照組裸鼠相應(yīng)用0.1% DMSO 0.2 ml灌胃。術(shù)后8周處死裸鼠，觀察移植瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況，取瘤組織用甲醛固定，石蠟包埋、切片，采用免疫組化法檢測(cè)移植瘤組織CD34、 NF-κB和MMP-9蛋白表達(dá)。以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。在400倍鏡下隨機(jī)選取20個(gè)視野，計(jì)數(shù)各視野CD24陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)及NF-κB、MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞總細(xì)胞數(shù)的百分率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、各組AsPC-1細(xì)胞的增殖抑制率及細(xì)胞凋亡

2、3、4、5、6、7、8、9 μmol/L姜黃素處理72 h后AsPC-1細(xì)胞的增殖抑制率分別為18.9%、38.7%、42.7%、44.9%、55.6%、61.7%、62.5%、67.9%，呈劑量依賴(lài)性地抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，其IC50值為6 μmol/L，故在此后研究中采用6 μmol/L的姜黃素濃度。

2、3、4、5、6、7、8、9 μmol/L姜黃素處理72 h后AsPC-1細(xì)胞的凋亡率分別為6.9%、11.7%、13.5%、18.1%、22.3%、23.1%、25.1%、27.3%，呈劑量依賴(lài)增加細(xì)胞凋亡(圖1)。

圖1　對(duì)照組及3、6 μmol/L姜黃素組的細(xì)胞凋亡(1A、1B：流式細(xì)胞法，1C、1D：熒光顯微鏡下　×400)

二、各組AsPC-1細(xì)胞的遷移及侵襲能力

對(duì)照組細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移，遷移細(xì)胞覆蓋了70%以上的劃痕區(qū)，而6 μmol/L姜黃素組少數(shù)細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移，僅覆蓋約10%的劃痕區(qū)(圖2)。

圖2　不同孵育時(shí)間對(duì)照組(2A)及6 μmol/L姜黃素組(2B)的細(xì)胞遷移(×200)

對(duì)照組、6 μmol/L姜黃素組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為136個(gè)/200倍視野和17個(gè)/200倍視野，6 μmol/L姜黃素組顯著少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.68，P<0.05，圖3)。

三、裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移

裸鼠處死后，對(duì)照組及低、高劑量姜黃素治療組裸鼠胰腺移植瘤的體積分別為(97.8±15.3)mm3、(44.3±9.7)mm3、(28.1±7.1)mm3，治療組顯著小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.89，P<0.05)。胰腺腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位主要是肝、腸壁、腹壁等，腸系膜轉(zhuǎn)移最多，各組裸鼠的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目分別為(108.3±6.7)、(29.5±4.5)、(8.9±2.4)個(gè)，治療組顯著少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.74，P<0.05)。

圖3　對(duì)照組(3A)及6 μmol/L姜黃素組(3B)的穿膜細(xì)胞(×200)

四、胰腺移植瘤組織CD34、NF-κB、MMP-9蛋白表達(dá)

除低劑量姜黃素組移植瘤NF-κB表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異外，兩姜黃素治療組裸鼠移植瘤組織CD34、NF-κB、MMP-9蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

討　　論

胰腺癌是比較嚴(yán)重且愈后不佳的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)。由于胰腺癌早期診斷十分困難且易侵犯周?chē)慕M織器官并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者臨床確診后已經(jīng)失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，即使進(jìn)行了手術(shù)治療，預(yù)后仍不樂(lè)觀，其5年生存率僅為6%，并且大約95%的患者都會(huì)出現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)[7]。

組別只數(shù)CD34陽(yáng)性細(xì)胞NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞百分率MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞百分率對(duì)照組 920.5±2.393.4±0.985.2±2.3低劑量組910.3±1.2a96.4±0.953.2±1.2a高劑量組97.9±3.2a45.6±3.1a34.2±3.1a

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

姜黃素是一種天然植物提取物，具有很多藥理作用，包括抗腫瘤、抗感染、抗氧化以及促進(jìn)傷口愈合等作用，其抗腫瘤的作用機(jī)制在于作用于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄因子、凋亡因子、黏附因子、血管生成調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞信號(hào)分子等。研究證實(shí)，姜黃素對(duì)胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移具有抑制作用，然而姜黃素對(duì)胰腺癌的抗腫瘤作用及其機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，姜黃素呈劑量依賴(lài)性抑制高轉(zhuǎn)移性的胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；能夠抑制AsPC-1細(xì)胞的遷移及侵襲能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素能抑制裸鼠胰腺原位移植瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程，腫瘤轉(zhuǎn)移與細(xì)胞粘附、定向遷移、穿透基底膜、血管生成等因素密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一種依賴(lài)于鋅離子的肽鏈內(nèi)切酶家族，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，幾乎可以降解除多糖以外全部的細(xì)胞外基質(zhì)成分。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)分泌MMPs降解毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞下的基質(zhì)膜和細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原，從而使內(nèi)皮細(xì)胞向外進(jìn)行遷移并增殖，導(dǎo)致新的血管和基底膜的形成，在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)周?chē)M織并進(jìn)入血管和淋巴管發(fā)生遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。MMP-9是MMPs家族中的重要一員，在惡性腫瘤組織中高表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，此外MMP-9還可以調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，抑制腫瘤血管的生成[8-9]。NF-κB 作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及血管生長(zhǎng)等關(guān)系密切，此外NF-κB能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MMP-9基因，從而直接影響MMP-9蛋白表達(dá)[10]。IκBα 的磷酸化是NF-κB活化的關(guān)鍵步驟，姜黃素可通過(guò)下調(diào)IκBα的磷酸化，減少細(xì)胞NF-κB抑制物IκBα蛋白，從而降低NF-κB的活化[11]。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于血管的生成，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了CD34在腫瘤組織中的表達(dá)情況，以反映腫瘤的微血管密度，CD34作為介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的基因之一，在胰腺癌轉(zhuǎn)移中起重要作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，姜黃素能夠抑制胰腺移植瘤組織NF-κB、MMP-9、CD34的表達(dá)，通過(guò)減少基質(zhì)蛋白的降解和抑制血管新生等途徑抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

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(本文編輯：屠振興)

Anti-metastasis effect of curcumin on human pancreatic cancer

JiRunli,ChenKai,XuWei.

SecondDepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China

Correspondingauthor:JiRunli,Emai:tjjrli@126.com

ObjectiveTo investigate whether curcumin could inhibit the metastasis of pancreatic cancer in vitro and in vivo and its mechanism. MethodsPancreatic cancer AsPC-1 cells were treated with different concentrations of curcumin. After 72 hours, cell survival rate were detected by MTT and the appropriate concentration of curcumin was selected. After treated with 6 μmol/L curcumin, early apoptosis of AsPC-1 cells were detected by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry, and the effects of curcumin on the migration and invasion of AsPC-1 cells were observed. After establishment of the orthotopic nude mouse model of pancreatic cancer, the mice were orally treated with low dose (20 mg/kg body weight) and high dose (40 mg/kg body weight) of curcumin respectively. Eight weeks later mice were sacrificed to observe the tumor metastasis, immunohistochemical methods were used to detect the positive expressions of CD34, NF-κB and MMP-9 in the tumor tissue. ResultsCurcumin of different concentrations could inhibit the proliferation of AsPC-1 cells and induce its apoptosis in a dose dependent manner, and 6 μmol/L was the best dose of curcumin. After 6 μmol/L curcumin treatment, the migration coverage of AsPC-1 decreased from 70% to 10%, the number of penetrating cells decreased from 136/ 200x magnification to 17/200x magnification, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). In the nude mouse model of pancreatic cancer, the size of the tumor decreased from (97.8±15.3)mm3to (44.3±9.7)mm3in high dose group and (28.1±7.1)mm3in low dose group, the number of distant metastasis decreased from 108.3±6.7 to 29.5±4.5 and 8.9±2.4, the expression of CD34decreased from 20.5±2.3 to 10.3±1.2 and 7.9±3.2, and the expression of MMP-9 decreased from 85.2±2.3 to 53.2±1.2 and 34.2±3.1, and the difference was statistically significant (P<0.05). ConclusionsCurcumin can inhibit the metastasis of pancreatic cancer both in vitro and in vivo, and its effect may be related to the inhibition of expressions of CD34and MMP-9.

Pancreatic neoplasms;Neoplasm metastasis;Cucurmin

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.004

300162天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院消化二科(冀潤(rùn)利、陳凱、許威)；天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(冀潤(rùn)利)

冀潤(rùn)利，Emai: tjjrli@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(81173393)；武警后勤學(xué)院種子基金面上基金項(xiàng)目(WHM201222)；西青醫(yī)院院級(jí)面上資助項(xiàng)目(xqlx201406)

2015-05-07)