RT-PCR檢測SALL4在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)*

鄭君濤　楊麗娟

(1.威海市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科; 2.威海市婦幼保健院,山東 威?！?64400)

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RT-PCR檢測SALL4在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)*

鄭君濤1楊麗娟2

(1.威海市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科; 2.威海市婦幼保健院,山東 威海264400)

目的研究SALL4與卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的關(guān)系，探討卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生機(jī)制及相關(guān)基因的功能，尋找卵巢生殖細(xì)胞腫瘤早期檢測、診斷的新指標(biāo)。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測40例卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、40例卵巢非生殖細(xì)胞腫瘤中SALL4的表達(dá)，分析SALL4與卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的關(guān)系。結(jié)果SALL4在正常卵巢組織中均無表達(dá)，在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤中的陽性表達(dá)率90.00﹪(36/40)顯著高于卵巢非生殖細(xì)胞腫瘤17.50﹪(7/40),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。結(jié)論SALL4在正常卵巢組織中無表達(dá)，在卵巢非生殖細(xì)胞腫瘤中極低表達(dá)，而在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤中高表達(dá)，提示SALL4可能是一種新的卵巢生殖細(xì)胞腫瘤早期檢測、評估惡性程度及預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物。

卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；婆羅雙樹基因4(SALL4)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，發(fā)病機(jī)制尚未明確，發(fā)病多為年輕女性，且缺乏早期診斷的有效指標(biāo)，晚期治療效果差，嚴(yán)重威脅女性的健康。臨床實(shí)踐中，外科手術(shù)、化療和放療一直是治療卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的主要方法，并對降低死亡率方面取得了一定的進(jìn)展。但因?yàn)槁殉采臣?xì)胞腫瘤缺乏有效的早期檢測指標(biāo)，治療一直沒有突破性的進(jìn)展，且傳統(tǒng)的卵巢腫瘤標(biāo)志物，如CA199、CEA、AFP目前已證實(shí)缺乏特異性，因此，從基因水平上探討卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生機(jī)制及相關(guān)基因的功能，尋找卵巢生殖細(xì)胞腫瘤早期診斷及預(yù)后監(jiān)測的腫瘤標(biāo)志物，將是提高卵巢生殖細(xì)胞腫瘤治療效果，降低其死亡率的關(guān)鍵所在。

婆羅雙樹基因(SAL)是最早克隆自果蠅體內(nèi)，其編碼蛋白具有多個(gè)C2H2型的雙鋅指結(jié)構(gòu)序列，婆羅雙樹基因4(SALL4)是果蠅SAL/Spalt基因的同源異型基因[1-2]。SALL4在人體組織中廣泛分布，且具有高度的保守性，有國外學(xué)者提出SALL4可能是細(xì)胞腫瘤的特異性標(biāo)志物之一，已逐步成為研究熱點(diǎn)[3-4]。本研究通過對所選取的卵巢標(biāo)本采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測定其中的SALL4的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，探討其臨床意義。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本收集選取煙臺(tái)及威海市各級(jí)醫(yī)院婦科2010年8月—2014年2月收治的卵巢生殖細(xì)胞腫瘤標(biāo)本40例(未成熟畸胎瘤18例，無性細(xì)胞瘤12例，卵黃囊瘤10例；中位年齡36歲，年齡28～50歲)，術(shù)前均未接受任何化療、放療，同時(shí)取卵巢非生殖細(xì)胞腫瘤40例(漿液性腫瘤20例，粘液性腫瘤12例，卵泡膜細(xì)胞瘤8例；中位年齡41歲，年齡30～56歲)和正常卵巢組織10例(中位年齡45歲，年齡38～53歲)做為對照,組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤離體后即刻無菌取材，處理后-80℃凍存。所有標(biāo)本臨床資料完整，且均經(jīng)兩家三級(jí)甲等醫(yī)院病理科病理學(xué)確診，所有操作均符合倫理學(xué)規(guī)定。

1.2方法組織總RNA提取→單細(xì)胞懸液的制備→采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)→RNA純度及濃度檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0軟件，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果提取90例組織標(biāo)本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測內(nèi)參照基因GAPDH的表達(dá)，結(jié)果表明所有標(biāo)本內(nèi)參照基因GAPDH均穩(wěn)定表達(dá)，證明RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成功[5]。經(jīng)RT-PCR檢測，10例卵巢正常組織均未擴(kuò)增出293 bp條帶，即不表達(dá)SALL4；7例卵巢非生殖細(xì)胞腫瘤和36例卵巢生殖細(xì)胞腫瘤檢測到293 bp擴(kuò)增條帶，SALL4基因表達(dá)陽性[6]，部分標(biāo)本擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2SALL4在3種卵巢組織中的表達(dá)在正常卵巢組織中無表達(dá)，在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的陽性表達(dá)率為90.00﹪,明顯高于其在卵巢非生殖細(xì)胞腫瘤中的陽性表達(dá)率17.50﹪，差異有顯著性，結(jié)果見表1。

圖1　RT-PCR檢測SALL4表達(dá)

卵巢組織n陽性(﹪)陰性卵巢正常組織卵巢非生殖細(xì)胞腫瘤卵巢生殖細(xì)胞腫瘤1040400(0.00)7(17.5)36(90.00)10334

注：χ2=57.57，P<0.001。

3　討　論

卵巢惡性腫瘤是婦科常見惡性腫瘤之一，起病隱匿，缺乏早期診斷的有效指標(biāo)，生殖細(xì)胞腫瘤惡性程度高，多發(fā)生于年輕女性，且發(fā)病機(jī)制尚未明確，嚴(yán)重影響女性健康。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌因素、遺傳因素、不良的營養(yǎng)和飲食習(xí)慣等是卵巢惡性腫瘤發(fā)病重要的危險(xiǎn)因素[5]。因此探討卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生機(jī)制，尋找卵巢生殖細(xì)胞早期檢測、診斷、評估預(yù)后的新指標(biāo)是目前卵巢生殖細(xì)胞腫瘤研究中的至關(guān)重要的課題和研究熱點(diǎn)。

SALL4是一種新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，定位于人類染色體20q13，包含SALL4A、SALL4B兩種亞型，分別編碼165 KD、95 KD的蛋白，近幾年的研究證實(shí)，SALL4是維持干細(xì)胞功能的調(diào)控基因，在胚胎發(fā)育和遺傳病中所起的作用已被證實(shí)[6]。本研究結(jié)果證實(shí)，SALL4在所選取的卵巢正常組織中均無陽性表達(dá)，參閱報(bào)道，亦有報(bào)道稱SALL4在正常卵巢組織無表達(dá)[7]，與本研究一致。在生殖細(xì)胞腫瘤中的明顯高表達(dá)于非生殖細(xì)胞腫瘤、正常卵巢組織中的表達(dá)形成鮮明對比，這充分提示,SALL4在卵巢生殖細(xì)胞腫瘤中的過度表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長、擴(kuò)散和潛在轉(zhuǎn)移。

雖然SALL4可以作為卵巢生殖細(xì)胞腫瘤的一個(gè)早期檢測指標(biāo)，但探索一種臨床實(shí)用、高效的檢測方法則具有更普遍的意義。因此尋找高靈敏和實(shí)用的檢測方法就至關(guān)重要，可能是下一步的研究重點(diǎn)和方向，將大大提高卵巢生殖細(xì)胞腫瘤早期檢測率及降低死亡率。

[1]Sakaki-Yumoto M,Kobayashi C,Sato A,et al.The murine homolog of SALL4,a causative gene in okihiro syndrome,is essential for embryonic stem cell proliferation,and cooperates with Sall in anorectal,heart,brain and kidney development[J].Development,2006,133(15):3005-3013.

[2]Yang J,Chai L,Gao C,et al.Sall4 is a key regulator of survival and apoptosis in human leukemic cells[J].Blood,2008,112 (3): 805-813.

[3]Naucler P,Ryd W,Totnberg S,et al.Efficacy of HPV DNA testing with cytology triage ang/or repeat HPV DNA testing in primary cervical cancer screening [J].J Natl Cancer Inst,2010,101(2):881-889.

[4]Kobayashi D,Kuribayshi K,Tanaka M,et al.SALL4 is essential for cancer cell proliferation and is overexpressed at early clinical staages in breast cancaer [J].Int J Oncol,2011,38(4):933-939.

[5]Frecer V,Miertus J,Borozdin W,et al.Molecular Modeling of c2h2Zinc Finger Mutation of putative Human Transcription Factor SALL4[J].IEJMD,2004,3: 295-307.

[6]KohlhaseJ,Heinrich M,Schubear L,et al.Okihiro syndrome is caused by SALL4 Mutations[J].Hum Mol Gnent,2002,11:2979-2987.

[7]Al-baradie R,Yamada K,ST Hilaire C,et al.Duane radial ray syndrome (Okihiro syndrome )maps to 20q13 and results from mutations in SALL4,a new member of SAL family[J].Am J Hum Genet,2002,71:1195-1199.

Expression and clinical significance of SALL4 by RT-PCR

ZHENG Jun-tao YANG Li-juan

(Weihai City Central Hospital,Weihai 264400,China)

Objective：To study the relationship between the expression of SALL4 and human ovarian germ cell tumors in order to find out the pathogenesis of carcinogengsis and the role of the cancer associated genes in the level of geng and find out a new index for early diagnosis and prognosis detection of ovarian germ cell tumors.Methods: Reverse Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)method was employed to detect the expression of SALL4 in human germ cell tumors.Results: The positive expression rate of SALL4 in normal ovarian tissues was zero.The positive expression rate of SALL4 in germ cell tumors was 90.00% (36/40),which was higher than that in non-germ cell tumor's 17.50% (7/40)(P<0.01).Conclusion: The expression rate of SALL4 in normal ovarian tissues is zero and in germ cell tumors is low,but the expression of SALL4 in germ cell tumors is higher.So SALL4 maybe a new ovarian germ cell tumors markers that can predict the prognosis of the patients.

ovarian germ cell tumors; SALL4; chain reaction immunohistochemisty

鄭君濤(1982—)，男，山東威海人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤工作。

R737.31

A

1004-7115(2016)05-0491-02

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.05.005

2016-02-27)