2種左旋多巴片劑在Beagle犬體內(nèi)的生物等效性研究

陳雪珊， 滕　亮， 賀鑫韜， 馬桂芝

(新疆醫(yī)科大學(xué)1科學(xué)技術(shù)處， 烏魯木齊　830011； 2第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊　830054；3新疆巴音郭楞蒙古自治州人民醫(yī)院藥學(xué)部， 新疆　庫(kù)爾勒　841000； 4新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊　830011)

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·藥學(xué)研究·

2種左旋多巴片劑在Beagle犬體內(nèi)的生物等效性研究

陳雪珊1， 滕亮2， 賀鑫韜3， 馬桂芝4

(新疆醫(yī)科大學(xué)1科學(xué)技術(shù)處， 烏魯木齊830011；2第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊830054；3新疆巴音郭楞蒙古自治州人民醫(yī)院藥學(xué)部， 新疆庫(kù)爾勒841000；4新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊830011)

目的考察單劑量給藥后左旋多巴微囊漂浮片和美多芭片在Beagle犬體內(nèi)的生物等效性。方法建立可用于測(cè)定beagle犬血漿中左旋多巴含量的高效液相色譜法，以美多芭片為參比制劑，采用雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，采用3P97藥物動(dòng)力學(xué)軟件求算單劑量給藥后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，對(duì)其生物等效性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果建立了符合方法學(xué)要求的測(cè)定Beagle犬血漿中左旋多巴含量的高效液相色譜法。單劑量口服美多芭和左旋多巴微囊漂浮片的主要藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)：tmax分別為(0.73±0.12)、(1.47±0.20) h，Cmax分別為(5.04±0.92)、(2.54±0.68) μg/mL，MRT分別為(1.96±0.21)、(3.41±0.32) h，AUC0-∞分別為(11.33±0.97)、(10.38±1.52) μg·h-1·mL-1。單劑量給藥的微囊漂浮片AUC0-∞與美多芭片AUC0-∞的幾何均值比的90%置信區(qū)間為83.00%～99.90%，Cmax幾何均值比的90%置信區(qū)間為52.10%～64.40%，秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明微囊漂浮片與參比片的tmax有差異。結(jié)論左旋多巴微囊漂浮片具有良好的緩釋特性，單劑量給藥后與參比制劑美多芭片吸收程度生物等效。

左旋多巴； 微囊； 漂浮片； 高效液相色譜法； 生物等效性

帕金森病(Parkinson′s Disease，PD)因具有較高的致殘率導(dǎo)致開(kāi)發(fā)新型抗帕金森病藥物及其新劑型具有顯著的社會(huì)意義和應(yīng)用價(jià)值[1-3]。美國(guó)神經(jīng)協(xié)會(huì)的評(píng)估結(jié)果表明復(fù)方左旋多巴制劑(美多芭等)是抗帕金森病藥物的金標(biāo)準(zhǔn)藥物[4]，但是由于該藥臨床使用方法較為繁瑣，導(dǎo)致其患者順應(yīng)性較差[5-6]。針對(duì)該制劑的缺點(diǎn)，本課題組前期研究已經(jīng)完成了具有體外緩釋特征、可分劑量使用的左旋多巴微囊漂浮片的工藝參數(shù)優(yōu)選[7-9]。為考察其體內(nèi)緩釋特征及參比制劑美多芭的生物等效性，本研究在建立了測(cè)定Beagle犬血漿中左旋多巴藥物濃度的HPLC方法的基礎(chǔ)上，采用單次給藥雙周期交叉試驗(yàn)考察左旋多巴微囊漂浮片與美多芭片劑在Beagle犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)行為，計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，按《藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》中生物等效性判定方法對(duì)其藥物生物等效性進(jìn)行評(píng)價(jià)[10]，為該產(chǎn)品的后續(xù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與儀器

1.1藥品與試劑左旋多巴對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào) 100170-201003)，美多芭片(上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：SH1324，每片含200 mg左旋多巴)，復(fù)方左旋多巴漂浮片(課題組自制，批號(hào)：20130515，每片含100 mg左旋多巴)，多潘立酮片(華東醫(yī)藥西安博華制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)1204019)，甲醇(色譜級(jí)，Sigma公司)，高氯酸(上海桃浦化工廠，批號(hào)：950420)，鹽酸(新疆燒堿廠，批號(hào)：02041950)，磷酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110418)。

1.2儀器LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，BS110S型分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，d=0.01)，DW-86L205型超低溫冰箱(廣州傲雪制冷設(shè)備有限公司)，Exceed-Cd-16A型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠)，KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，LG10-2.4A型高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī))。

1.3動(dòng)物健康雄性beagle犬6只，體質(zhì)量(12±1)kg,由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究部提供并飼養(yǎng)[試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(新)2010-0001]。

2　方法與結(jié)果

2.1體內(nèi)分析方法的建立

2.1.1色譜條件色譜柱：Agilent ODS-1C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%三氟乙酸水溶液(B)梯度洗脫：0～2 min 98% B，2～25 min 98%～82% B，25～40 min 82%～98% B，流速：0.5 mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取左旋多巴對(duì)照品適量，用稀鹽酸(9→1 000 mL)溶解并制備左旋多巴儲(chǔ)備液(200 μg/mL)。分別取儲(chǔ)備液適量依次制備質(zhì)量濃度分別為200、150、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56和0.78 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3血漿樣品預(yù)處理取Beagle犬全血2 mL，低溫(8℃)4 200 r/min離心10 min，分取上層血漿，加入等量6%高氯酸溶液，震搖2 min，10 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后取20 μL進(jìn)行分析。

2.1.4方法專屬性按前述樣品與處理方法對(duì)空白血漿、左旋多巴對(duì)照品、空白血漿加左旋多巴對(duì)照品、實(shí)際血漿樣品進(jìn)行處理后按前述色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明內(nèi)源性物質(zhì)、代謝產(chǎn)物與左旋多巴色譜峰基線分離，對(duì)左旋多巴的測(cè)定無(wú)干擾,見(jiàn)圖1。

2.1.5線性考察分別取空白血漿500 μL 10份，分別精密加入不同質(zhì)量濃度的左旋多巴，使血漿中左旋多巴的質(zhì)量濃度分別為20、15、10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.16和0.078 μg/mL，按前述樣品與處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定。直線回歸結(jié)果表明待測(cè)物峰面積(A)與左旋多巴質(zhì)量濃度(C)存在以下線性關(guān)系：A=36 728.46 C+20.78(r=0.999 9，n=10)。通過(guò)信噪比法確定最低定量下限為(LLOQ)0.078 μg/mL(S/N≥10)。2.1.6精密度試驗(yàn)取空白血漿500 μL，按前述樣品處理方法制備3個(gè)質(zhì)量濃度(0.156、2.5和15 μg/mL)的QC樣品，對(duì)每一濃度進(jìn)行分析(n=5)，連續(xù)測(cè)定5 d，測(cè)定日內(nèi)及日間的精密度，并與制備濃度比較計(jì)算方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果表明分析方法的精密度(RSD)均<15%，符合方法學(xué)要求。

a: 對(duì)照品溶液

b: 空白血漿

c: 空白血漿加左旋多巴對(duì)照品

d: 給予200 mg左旋多巴后1 h取血檢測(cè)結(jié)果

圖1左旋多巴色譜圖

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取空白血漿500 μL，按前述樣品處理方法制備3個(gè)質(zhì)量濃度(0.156、2.5和15 μg/mL)的QC樣品，對(duì)每一濃度進(jìn)行分析(n=5)；分別考察樣品在室溫放置24 h、在-80℃冰箱中冷凍28 d及反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。結(jié)果表明左旋多巴含量均穩(wěn)定。

2.1.8提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)取空白血漿500 μL 15份，按前述樣品處理方法制備3個(gè)質(zhì)量濃度(0.156、2.5和15 μg/mL)的QC樣品(n=5)，分別進(jìn)樣記下待測(cè)物峰面積A1。另取空白血漿500 μL15份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，加入左旋多巴對(duì)照品溶液，制成3個(gè)質(zhì)量濃度(0.156、2.5、15 μg/mL)的未經(jīng)提取的對(duì)照樣品(n=5)，記下待測(cè)物峰面積A2。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用6%高氯酸稀釋制成3個(gè)質(zhì)量濃度(0.156、2.5、15 μg/mL)的左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品(n=5)，分別進(jìn)樣并記下待測(cè)物峰面積為A3。計(jì)算提取回收率(%)與基質(zhì)效應(yīng)(%)。結(jié)果表明，測(cè)定血漿中左旋多巴質(zhì)量濃度分析方法的提取回收率分別為(87.56±5.53)%、(87.56±3.33)%、(93.96±5.35)%，基質(zhì)效應(yīng)分別為(76.74±2.48)%、(104.34±1.66)%、(91.39±5.84)%，均符合方法學(xué)要求。

2.1.9方法的相對(duì)回收率將“2.1.8”項(xiàng)下求得的比值A(chǔ)1代入線性回歸方程計(jì)算所測(cè)得濃度，經(jīng)與加入濃度相比計(jì)算相對(duì)回收率。結(jié)果相對(duì)回收率分別為(108.44±7.40)%、(95.05±2.57)%、(101.98±2.11)%，均符合生物樣品分析方法的要求。

2.2Beagle犬體內(nèi)單次給藥雙周期交叉實(shí)驗(yàn)

2.2.1實(shí)驗(yàn)方法取6只健康雄性Beagle犬，體質(zhì)量11～13 kg，禁食12 h(自由飲水)，雙交叉單劑量分別給予左旋多巴微囊漂浮片2片、美多芭片1片。給藥2 h后飲水，4 h后進(jìn)食，給藥后分別于不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)前肢靜脈采血2 mL于肝素化試管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理樣品并測(cè)定血藥濃度。間隔1 w后，進(jìn)行交叉給藥。左旋多巴微囊漂浮片采血時(shí)間點(diǎn)分別為給藥前和給藥后0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、9.0 h。美多芭片采血時(shí)間點(diǎn)分別為給藥前和給藥后0.167、0.333、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、9.0 h。

2.2.2測(cè)定結(jié)果6只Beagle犬分別單劑量口服左旋多巴微囊漂浮片和參比制劑復(fù)方美多芭片后，定時(shí)取樣測(cè)定血漿中的藥物濃度，平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

2.2.33P97藥代動(dòng)力學(xué)程序計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用3P97藥代動(dòng)力學(xué)程序[11]處理所得數(shù)據(jù)。結(jié)果表明2種左旋多巴片在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行均為單室模型，見(jiàn)表1。

2.2.4應(yīng)用3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)參數(shù)進(jìn)行生物等效性判定對(duì)單劑量口服左旋多巴微囊漂浮片和普通片的lgAUC0-∞、lgCmax進(jìn)行3素方差分析，結(jié)果表明2種制劑間、周期間、個(gè)體間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)及(1～2 a)置信區(qū)間分析，微囊片AUC0-∞與參比制劑AUC0-∞的比值的90%置信區(qū)間為83.00%～99.90%，以80%～125%為等效標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果判定具有2種制劑吸收程度生物等效。Cmax在周期間、個(gè)體間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在制劑間有差異(P<0.05)。進(jìn)一步進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)及(1～2 a)置信區(qū)間分析，微囊片Cmax與參比制劑Cmax的比值的90%置信區(qū)間為52.10%～64.40%，以70%～145%為等效標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果判定2種制劑生物不等效。tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn))差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示微囊片與參比片的tmax有差異，試驗(yàn)周期間、個(gè)體間無(wú)差異。以上結(jié)果提示與參比制劑相比，左旋多巴微囊漂浮片吸收程度生物等效，且具有緩釋特征。

表13P97處理的左旋多巴微囊漂浮片與美多芭片藥學(xué)動(dòng)力參數(shù)

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)美多芭片微囊漂浮片tmax/h0.73±0.121.47±0.20Cmax/(μg/mL)5.04±0.922.54±0.68t1/2/h0.74±0.111.33±0.91t1/2Ka/h0.39±0.080.72±0.20Ke/h-10.94±0.130.53±0.07Ka/h-11.67±0.631.03±0.33V/F/(μg/mL)20.50±1.9539.52±9.17MRT/h1.96±0.213.41±0.32CL/F/(mL/h)19.26±2.1620.64±0.36AUC0-t/(μg·h·mL-1)11.12±0.919.98±1.67AUC0-∞/(μg·h·mL-1)11.33±0.9710.38±1.52

3　討論

本研究在求算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)既采用了3P97藥物動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算，還嘗試采用基于excel2003界面的統(tǒng)計(jì)矩法進(jìn)行計(jì)算[12-13]。采用統(tǒng)計(jì)矩法求算單劑量口服美多芭和左旋多巴微囊漂浮片的主要藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)：tmax分別為(0.79±0.10)、(1.83±0.26)h，Cmax分別為(7.34±0.95)、(4.26±0.54)μg/mL，MRT分別為(2.61±0.18)、(3.99±0.32)h，AUC0-∞分別為(11.33±0.97)、(10.38±1.54)μg·h·mL-1。2種數(shù)據(jù)處理方法均表明與普通片相比，左旋多巴漂浮片的體內(nèi)半衰期明顯延長(zhǎng)，達(dá)峰時(shí)間明顯延遲，血藥峰濃度明顯低于普通片，達(dá)到了緩釋的效果。與DOS界面的3P97藥動(dòng)處理軟件相比，基于excel2003界面的統(tǒng)計(jì)矩法相對(duì)靈活、方便、快捷，統(tǒng)計(jì)過(guò)程更加直觀。

在評(píng)價(jià)生物等效性時(shí)除了采用3P97藥物動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，還根據(jù)生物等效性評(píng)價(jià)的原理和文獻(xiàn)，分別采用excel2003通過(guò)梯形法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[14]和利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明3種方法所得的具體數(shù)值有所不同，但是統(tǒng)計(jì)結(jié)論是一致的，即單劑量給藥的微囊漂浮片AUC0-∞與參比制劑AUC0-∞的幾何均值比的90%置信區(qū)間均在80%～125%內(nèi)，2種制劑吸收程度生物等效，試驗(yàn)制劑與參比制劑的Cmax與tmax均存在差異，表明2種制劑的吸收速度存在差異，提示3種生物等效性評(píng)價(jià)方法有可能互相代替。

數(shù)據(jù)處理結(jié)果表明單劑量給藥后左旋多巴微囊漂浮片在犬體內(nèi)的藥時(shí)曲線符合單室模型，2種制劑在體內(nèi)吸收量相當(dāng)，但微囊漂浮片的Cmax明顯小于參比制劑，tmax明顯大于參比制劑，其原因可能在于微囊漂浮片是將藥物包封于微囊后在與漂浮材料壓制成片劑，藥物的釋放既受漂浮材料的膨脹、溶蝕的影響，又要受藥物透過(guò)微囊壁快慢的影響，因此其吸收過(guò)程變得非常緩慢，但微囊漂浮片在胃腸道中滯留時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致其吸收量并未減少。

綜上所述，體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果提示微囊漂浮片在保證吸收量相等的前提下實(shí)現(xiàn)了緩釋，有助于降低血藥濃度的波動(dòng)度，減少給藥次數(shù)，從而避免多次給藥可能發(fā)生的不良反應(yīng)，提高患者用藥的順應(yīng)性。

[1]Gordon PH, Mehal JM, Holman RC, et al. Parkinson′s disease among American Indians and Alaska natives: a nationwide prevalence study[J]. Mov Disord, 2012, 27(11):1456-1459.

[2]葉迎安,阮志芳.左旋多巴在帕金森病治療中的合理應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志, 2008,11(1):101-103.

[3]曲偉,蒲小平.抗帕金森病新藥研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志, 2008,17(1):21-26.

[4]Navailles S ,Lagiere M,Contini A,et al.Multisite intracerebral microdialysis to study the mechanism of L-DOPA induced dopamine and serotonin release in the parkinsonian brain [J].ACS Chem Neurosci, 2013, 4(5):680-692.

[5]徐娉,張璟.左旋多巴治療帕金森病用藥方法及療效觀察[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2003,23(7):443-444.

[6]蘇雅茹,蔣雨平.左旋多巴的臨床應(yīng)用 [J]. 中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào), 2005, 20(19):12-14.

[7]馬桂芝,滕亮,李文英,等.乳化-溶劑揮發(fā)法制備左旋多巴微囊[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,37(1):47-50,53.

[8]周玲,程煜鳳,李文英,等.左旋多巴微囊漂浮片的處方優(yōu)選[J].中國(guó)藥師,2015,18(8):1295-1299.

[9]馬桂芝,馬亮英,李文英,等.鹽酸芐絲肼固體分散體制備工藝的研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,38(7):862-865.

[10]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄195-199.

[11]李緒春,徐富培,周遠(yuǎn)大.2種奧卡西平片的人體生物等效性研究[J].中國(guó)藥房,2012,23(42):3984-3986.

[12]袁進(jìn),石磊,趙樹(shù)進(jìn).基于Excel求解靜脈注射給藥隔室模型參數(shù)及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[J].中國(guó)藥師,2007,10(2):161-163.

[13]楊星鋼,張國(guó)華,李偉,等.阿昔莫司緩釋片的體外釋放度與犬體內(nèi)吸收相關(guān)性[J].中國(guó)新藥與臨床雜志,2005,24(7):508-511.

[14]梁文權(quán).生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:338-359.

(本文編輯施洋)

Study on bioequivalence of two kinds of Levodopa tablets in Beagle

CHEN Xueshan1, TENG Liang2, HE Xintao3, MA Guizhi4

(1DepartmentofScienceandTechnology，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China;3DepartmentofPharmacy,People′sHospitalofXinjiangBayinguolengMongoliaAutonomousPrefecture,Korla841000,China;4CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo study the pharmacokinetic properties of two kinds of levodopa tablets in Beagle. MethodsThe method of HPLC was established to determine Levodopa in beagle dog plasma. Using two-period randomized crossover design with Madopar as reference preparation, the main pharmacokinetic parameters were calculated by the software 3P97 using the dates in vivo after given a single oral dose of Madopar and Levodopa microcapsules floating tablets. The bioequivalence between Levodopa microcapsules floating tablets and reference preparation was preliminarily evaluated. ResultsThe method of HPLC was established to determine Levodopa in beagle dog plasma which complies with methodology requirements. The main pharmacokinetic parameters were as following respectively: tmaxwere (0.73±0.12) h and (1.47±0.20) h，Cmaxwere (5.04±0.92) μg/mL and (2.54±0.68) μg/mL, MRT were (1.96±0.21) h and (3.41±0.32) h, AUC0-∞were (11.33±0.97) μg·h-1·mL-1and (10.38±1.52) μg·h-1·mL-1, respectively. According to the guideline of pharmaceutical preparations of human bioavailability and bioequivalence test, the 90% confidence intervals for the geometric mean ratio of AUC0-∞and Cmaxvalues for the test and reference preparation were 83.00%～99.90%, 52.10%～64.40%, respectively. According to the results of rank sum test, the tmaxwere different between the test and reference preparation. Conclu-sionThe extent of absorption of Levodopa between the test and reference preparation was bioequivalent. Compared with the reference preparation, the Levodopa microcapsules floating tablets had a good sustained-release property.

Levodopa; Microcapsules; Floating tablets; HPLC; Pharmacokinetics; bioequivalence

烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(G121320003)

陳雪珊(1984-)，女(回族)，碩士，助理研究員，研究方向：新藥研發(fā)，E-mail:chenxueshan2010@sina.com。

馬桂芝，女(回族)，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥民族藥研究，E-mail：maguizhi000@126.com。

R945

A

1009-5551(2016)06-0717-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.012

2015-10-6]