低劑量iAs5+染毒對(duì)兔血清ET-1、sP-選擇素及vWF的影響

胡蓓蓓， 馬　艷， 張　杰， 吳　軍， 鄭玉建

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊　830011)

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低劑量iAs5+染毒對(duì)兔血清ET-1、sP-選擇素及vWF的影響

胡蓓蓓， 馬艷， 張杰， 吳軍， 鄭玉建

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊830011)

目的探討低劑量五價(jià)無(wú)機(jī)砷(iAs5+)染毒對(duì)新西蘭大耳兔血清中ET-1、sP-選擇素及vWF含量的影響。方法健康雄性新西蘭大耳兔42只，隨機(jī)分為對(duì)照組和6個(gè)iAs5+染毒劑量組，染毒組飲水中給予砷酸鈉溶液染毒，所有動(dòng)物自由飲水，進(jìn)食。染毒3個(gè)月，麻醉后處死動(dòng)物，采集動(dòng)物血液、尿液以及各臟器樣本，利用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定血、尿、心臟和肝臟總砷含量，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)測(cè)定血清中ET-1、sP-選擇素及vWF的含量。結(jié)果染毒組的血砷、尿砷和肝臟砷含量均值均高于對(duì)照組，各染毒劑量組血砷和尿砷含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.402，F(xiàn)=9.313，P均<0.05)，肝臟砷和心臟砷含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.763，H=4.284，P均>0.05)；各染毒劑量組ET-1、sP-選擇素含量均高于對(duì)照組，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=31.015，F(xiàn)=70.225，P均<0.05)，ET-1含量與血砷、尿砷含量呈正相關(guān)(r=0.592，r=0.467，P均<0.05)，sP-選擇素含量與血砷、尿砷、肝臟砷含量呈正相關(guān)(r=0.768，r=0.717，r=0.435，P均<0.05)。結(jié)論低劑量亞慢性iAs5+染毒可對(duì)血清中ET-1和sP-選擇素的含量造成一定影響。

砷； 內(nèi)皮素1； 血管性假血友病因子； 可溶性P-選擇素

砷是自然界中存在的一種常見(jiàn)的元素，通過(guò)自然沉降或者人為活動(dòng)，砷及其化合物可出現(xiàn)在空氣、土壤和水等環(huán)境介質(zhì)中。環(huán)境中的砷主要以亞砷酸鹽的形式經(jīng)飲用水途徑進(jìn)入機(jī)體，飲用水砷暴露和砷的不完全甲基化能力會(huì)增加患致命性和非致命性心血管疾病，尤其是心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞在機(jī)體中有很重要的作用，其能介導(dǎo)組織器官中氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳送，血液中有毒金屬含量過(guò)高或長(zhǎng)期暴露于含有有毒金屬的血液中，造成內(nèi)皮受損，可能導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。內(nèi)皮素1(Endothelin-1, ET-1)、血管性假血友病因子(vonWillebrand factor, vWF)以及可溶性P-選擇素(sP-selectin)是比較敏感的內(nèi)皮損傷標(biāo)志物，外周血中ET-1、vWF以及sP-選擇素的含量的變化即可反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)。本研究利用低劑量iAs5+砷染毒兔模型，觀察不同染毒劑量下動(dòng)物臟器系數(shù)、血清ET-1、vWF以及sP-選擇素等指標(biāo)的變化情況，為進(jìn)一步了解低劑量亞慢性砷染毒對(duì)血管內(nèi)皮的損傷作用提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑AA240FS原子吸收分光光度儀(美國(guó)VARIAN公司)，AS-1空心陰極燈(北京有色金屬研究總院)，680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，MP5002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；砷酸鈉(分析純，湖南鳳凰化工試劑廠)，硝酸(北京化工廠)，高氯酸(天津市東方化工廠)，砷標(biāo)準(zhǔn)品(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)，硝酸鎳(北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠)。

1.2染毒方法選用新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的普通級(jí)新西蘭大耳兔42只，雄性，體質(zhì)量為(2.0±0.2)kg。動(dòng)物飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。正式實(shí)驗(yàn)前試飼養(yǎng)觀察1 w，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組和6個(gè)iAs5+染毒組，每組6只，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到兔iAs5+的LD50為20.21 mg/kg，染毒組的iAs5+劑量分別為L(zhǎng)D50的1/960、1/480、1/240、1/120、1/60、1/30，即從染毒劑量組1到劑量組5 iAs5+的染毒劑量分別為0.021、0.042、0.084、0.168、0.337、 0.674 mg/kg。對(duì)照組：自由進(jìn)食，自由飲水。染毒組：自由進(jìn)食，自由飲水染毒，連續(xù)染毒3個(gè)月。

1.3染毒動(dòng)物血砷、尿砷、心臟砷含量的測(cè)定

1.3.1樣品的預(yù)處理取抗凝全血、尿液0.5 mL加入50 mL三角燒瓶中消化。步驟：每個(gè)燒瓶中分別加入混合酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)5 mL，置于電熱板上75℃消化1 h，120℃消化1 h，150℃消化至溶液透明，取下待冷卻后加入高純水5 mL定容，待測(cè)。心臟、肝臟組織勻漿后，分別取0.5 mL勻漿液，進(jìn)行消化，定容后待測(cè)。

1.3.2石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定砷含量利用原子吸收分光光度儀測(cè)定樣本砷含量：配制砷標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μg/L，按照預(yù)先設(shè)定好的程序，上機(jī)測(cè)定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；配制100 μg/mL的硝酸鎳作為基體改進(jìn)劑，各樣本管中加入1 000 μL待測(cè)樣品和50 μL硝酸鎳混勻，上機(jī)測(cè)試，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度值，得到各樣本的砷含量。

1.4血清ET-1、vWF和sP-選擇素含量的測(cè)定染毒3個(gè)月后，麻醉處死動(dòng)物，在腹主動(dòng)脈取2 mL非抗凝血，靜置，2 h內(nèi)離心10 min(3 000 r/min)，分離血清，置于2 mL EP管中，然后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒(上海GOYBIO生物公司)操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中ET-1、vWF和sP-選擇素含量。

2　結(jié)果

2.1iAs5+染毒兔血砷、尿砷、心臟砷、肝臟砷的變化情況經(jīng)方差分析得出，染毒組和對(duì)照組的血砷、尿砷含量的總體均數(shù)不全相等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.402，F(xiàn)=9.313，P均<0.05)，各染毒劑量組的血砷、尿砷含量均值均高于對(duì)照組。兩兩比較結(jié)果顯示，染毒劑量組1的血砷含量與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，染毒劑量組3、劑量組5和劑量組6的尿砷含量與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各染毒劑量組肝臟砷含量均高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.763，P>0.05)；由于方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)，各組間心臟砷含量的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=4.284，P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　iAs5+染毒兔血、尿、心臟和肝臟總砷含量(±s， μg/L)

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05。

2.2iAs5+染毒對(duì)兔血清ET-1、vWF及sP-選擇素含量的影響經(jīng)檢驗(yàn)ET-1和vWF不滿足方差齊，所以采用秩和檢驗(yàn)比較，各染毒劑量組ET-1含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=31.015，P<0.05)，各染毒劑量組ET-1含量均高于對(duì)照組，染毒劑量組4、劑量組5和劑量組6與對(duì)照組ET-1含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，染毒組與對(duì)照組vWF總體均數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=4.185，P>0.05)；經(jīng)方差分析得到，染毒組與對(duì)照組sP-選擇素總體均數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=70.225，P<0.05)，各染毒劑量組sP-選擇素含量均高于對(duì)照組，且隨染毒劑量的增加而升高，除劑量組1外，其余各染毒劑量組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，見(jiàn)表2。

經(jīng)Pearson相關(guān)分析得到，ET-1含量與血砷、尿砷含量呈正相關(guān)(r=0.592，r=0.467，P均<0.05)，sP-選擇素含量與血砷、尿砷、肝臟砷含量呈正相關(guān)(r=0.768，r=0.717，r=0.435，P均<0.05)，見(jiàn)表3。

分組ET-1/(pg/mL)vWF/%sP-選擇素/(ng/mL)對(duì)照組105.023±10.739125.448±12.39420.124±3.216染毒劑量組1109.842±23.136125.806±10.73725.709±7.801染毒劑量組2113.973±20.890125.806±11.25329.894±2.749*染毒劑量組3118.964±13.517134.274±10.49840.603±4.940*染毒劑量組4153.806±6.251*133.871±19.72258.865±7.520*染毒劑量組5148.941±4.091*138.038±21.37969.060±7.878*染毒劑量組6155.180±7.051*147.312±28.81474.734±7.460*

注：與對(duì)照組比較 ,*P<0.05。

3　討論

慢性砷中毒是一個(gè)全球化的衛(wèi)生問(wèn)題，長(zhǎng)期飲水砷暴露可引起慢性砷中毒，導(dǎo)致多器官、系統(tǒng)如肝臟、心臟、血液系統(tǒng)等受損[2]。慢性暴露在飲水砷含量 5～10 μL/L的環(huán)境中都會(huì)造成砷引起的皮膚損傷的發(fā)病率增加[3]。研究發(fā)現(xiàn)，低水平砷暴露與心血管疾病尤其是心臟疾病死亡率之間也存在劑量-反應(yīng)關(guān)系[4]。

表3不同暴露標(biāo)志與血砷、尿砷、心臟砷和肝臟砷的相關(guān)性分析(n=42)

分組ET-1/(pg/mL)vWF/%sP-選擇素/(ng/mL)血砷 0.592* 0.170 0.768*尿砷 0.467* 0.356 0.717*心臟砷-0.214-0.357-0.199肝臟砷 0.186-0.157 0.435*

注：*P<0.05。

砷經(jīng)消化系統(tǒng)部分進(jìn)入血液，分布到全身各組織器官中，然后經(jīng)尿液排出體外。本實(shí)驗(yàn)中，染毒組血砷及尿砷濃度均高于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，砷暴露會(huì)導(dǎo)致各臟器組織中均有砷蓄積，但分布并不均勻，血砷和尿砷含量可在一定程度上反映砷在體內(nèi)的負(fù)荷情況[5-6]。肝臟是砷的代謝場(chǎng)所，本實(shí)驗(yàn)中染毒組肝臟中砷含量均高于對(duì)照組，但染毒組和對(duì)照組肝臟砷含量和心臟砷含量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明低劑量砷在臟器中的蓄積不明顯。

慢性砷中毒可以導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生，而ET-1具有收血管作用，多種心血管疾病的病理生理過(guò)程中均有ET-1的參與[7]。本實(shí)驗(yàn)中染毒組與對(duì)照組ET-1含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高劑量染毒組ET-1含量高于對(duì)照組。心肌缺血可以導(dǎo)致內(nèi)皮素大量釋放，通過(guò)降低血中ET-1濃度，才能有效地阻止內(nèi)皮細(xì)胞損傷的加重[8]。本實(shí)驗(yàn)中染毒組ET-1濃度升高，說(shuō)明染毒動(dòng)物可能出現(xiàn)了心肌缺血的癥狀。ET-1含量與血砷、尿砷含量呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)血砷、尿砷含量升高時(shí)提示血清中ET-1的釋放也會(huì)增加。

sP-選擇素是內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)志物，參與了多種炎癥介質(zhì)的釋放，在炎癥早期發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，sP-選擇素含量會(huì)隨血砷、尿砷、肝臟砷含量的增加而增加，染毒組sP-選擇素含量均高于對(duì)照組，且隨染毒劑量的升高而增加，除最低的染毒劑量組外，其余各染毒組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明染毒組動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞可能出現(xiàn)炎癥損傷，從而導(dǎo)致血清中sP-選擇素升高。

vWF是一種多聚糖蛋白，可由內(nèi)皮細(xì)胞合成，參與血小板的黏附和聚集[11]。由于循環(huán)血漿內(nèi)的vWF大部分來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞，血漿vWF含量的變化通常能反映出內(nèi)皮細(xì)胞功能的狀態(tài)，當(dāng)內(nèi)皮功能損傷時(shí)vWF水平會(huì)有一定升高[12]，通過(guò)血漿中vWF含量來(lái)預(yù)測(cè)未來(lái)發(fā)生缺血性心肌病的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)中染毒組與對(duì)照組vWF含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于低劑量砷暴露對(duì)血清中vWF影響不明顯。

綜上所述，低劑量的iAs5+染毒也能導(dǎo)致血清中ET-1和sP-選擇素的含量升高，并且ET-1和sP-選擇素的含量與血砷、尿砷濃度呈正相關(guān)，ET-1和sP-選擇素可能也可以作為低劑量砷中毒內(nèi)皮損傷的標(biāo)志物。

[1]Chen Y, Wu F, Liu ML, et al. A Prospective study of arsenic exposure, arsenic methylation capacity, and risk of cardiovascular disease in bangladesh[J].Environ Health Perspect,2013,121(7):832-838.

[2]于云江,王菲菲,房吉敦,等.環(huán)境砷污染對(duì)人體健康影響的研究進(jìn)展[J].環(huán)境與健康雜志,2007,24(3):181-183.

[3]Xia YJ, Timothy J, Wade, et al.Well water arsenic exposure, arsenic induced skin-lesions and self-reported morbidity in inner mongolia[J] .Int J Environ Res Public Health,2009,6:1010-1025.

[4]Medrano MA, Boix R, Pastor-Barriuso R, et al. Arsenic in public water supplies and cardiovascular mortality in Spain[J]. Environ Res, 2010,110(5):448-454.

[5]高怡,仇玉蘭,田鳳潔,等.飲水砷暴露大鼠血砷、尿砷和組織砷含量測(cè)定分析[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,4(1):33-36.

[6]馬栓柱,許秀舉,羅綏蘭,等.飲水型砷中毒大鼠尿砷、血砷和毛發(fā)砷含量變化及其相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007,34(1):40-41.

[7]Glowinska B, Urban M, Hryniewicz A, et al. Endotheli-1 plasma concertration in children and adolescents with atherogenic risk factors[J].Kardiol Pol, 2004,61(10):329-338.

[8]陳雪君,雷凡,段薇娜.羥乙基淀粉對(duì)兔缺血-再灌注心肌MPO和ET-1的影響[J].廣西醫(yī)學(xué),2014,36(2):158-161.

[9]劉艷秋,高美華,李紅林,等.糖尿病及糖尿病病發(fā)冠心病患者血清sP-selectin、sE-selectin水平變化及意義[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2015,31(9):1245-1249.

[10]何劍戈,任愛(ài)紅,施懿誠(chéng),等.肝缺血再灌注損傷的機(jī)制及其預(yù)防[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2012,30(3):235-237.

[11]Federici AB. The factor VIII/yon Willebrand factor complex：basic and clinical issues[J].Haematologica,2003,88(6):34-38.

[12]Constans J, Conri C. Circulating markers of endothelial function in cardiovascular diseasc[J].Clin Chem Acta,2006,368(1-2):33-47.

(本文編輯張巧蓮)

Effect on ET-1, sP-selectin and vWF with low-dose pentavalent inorganic arsenic exposure in rabbits

HU Beibei， MA Yan， ZHANG Jie， WU Jun， ZHENG Yujian

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo explore the effects on ET-1, vWF and sP-electin in rabbits′ serum with low-dose pentavalent inorganic arsenic (iAs5+) exposure. Methods42 healthy male New Zealand rabbits were randomly divided into the control group and the exposure group, which were divided into 6 groups from low to high dose, and exposure groups were given sodium arsenate solution in drinking water. All the rabbits ate and drank water freely. After three months, the animals were killed after anesthesia, collected blood, urine and viscera samples. To detect the concentration of arsenic in blood, urine, liver and heart by graphite furnace atomic absorption spectrometry. ET-1, vWF and sP-selectin were determined by ELISA kit. ResultsThe arsenic in blood , urine and liver of exposure groups were higher than those in control group, and the differences of arsenic in blood and urine between each group were statistical significance (F=8.402，F(xiàn)=9.313，P<0.05). There was no significant difference in liver arsenic and heart arsenic (F=1.763，H=4.284，P>0.05). ET-1 and sP-selectin in exposure group were higher than that in control group, and the differences of ET-1 and sP-selectin in each group were statistical significance (H=31.015，F(xiàn)=70.225，P>0.05). There is a positive correlation between the content of ET-1 and the arsenic in blood or urine (r=0.592，r=0.467，P<0.05), and there is also have a positive correlation between the content of sP-selectin and the arsenic in blood, urine or liver (r=0.768，r=0.717，r=0.435，P<0.05). ConclusionLow dose iAs5+exposure have some certain effects on ET-1, sP-selectin in serum.

arsenic； endothelin1； von willebrand factor； sP-Selectin

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260410); 國(guó)家自然科學(xué)基金(81560513)； 教育部博士點(diǎn)基金(20126517110002)

胡蓓蓓(1991-)，女，在讀碩士，研究方向：環(huán)境與健康。

鄭玉建，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師,研究方向：環(huán)境與健康，E-mail：zhyujian6@hotmail.com。

R-33; R34

A

1009-5551(2016)06-0668-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.002

2016-03-12]