鈣調(diào)蛋白鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體載體的構(gòu)建、表達(dá)純化及鑒定

趙美瞇，李　卓，邵冬雪，梁洪玥，晏　珊，封　瑞，孫雪菲，郭　鳳，郝麗英

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽110122）

鈣調(diào)蛋白鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體載體的構(gòu)建、表達(dá)純化及鑒定

趙美瞇，李卓，邵冬雪，梁洪玥，晏珊，封瑞，孫雪菲，郭鳳，郝麗英

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽110122）

目的構(gòu)建鈣調(diào)蛋白3種鎂離子結(jié)合位點(diǎn)突變體的質(zhì)粒載體，并進(jìn)行表達(dá)純化及鑒定，為深入研究鈣調(diào)蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。方法利用鈣調(diào)蛋白cDNA進(jìn)行點(diǎn)突變，制備3種鎂離子結(jié)合位點(diǎn)突變的cDNA。將突變后的cDNA分別插入pGEX-6P-3載體，制備鈣調(diào)蛋白突變體載體質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)大腸桿菌，并誘導(dǎo)GST融合蛋白表達(dá)。利用Glutathione-Sepharose 4B珠子和PreScission蛋白酶分離純化蛋白。結(jié)果酶切鑒定和DNA測序證實(shí)成功構(gòu)建鈣調(diào)蛋白突變體質(zhì)粒；表達(dá)純化得到的鈣調(diào)蛋白突變體經(jīng)電泳圖鑒定純度較高，濃度約1.0 mg/mL。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了鈣調(diào)蛋白鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，分離純化可獲得較高濃度較高純度的鈣調(diào)蛋白突變體。

鈣調(diào)蛋白；突變體；融合蛋白；pGEX-6P-3

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鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）是一種廣泛存在于生物體的鈣結(jié)合蛋白。它與體內(nèi)多種蛋白相互作用產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)，是生命活動過程中不可缺少的細(xì)胞因子［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)CaM不僅可與經(jīng)典的鈣離子通道蛋白相互作用，而且可與鉀離子通道［3］、鈉離子通道［4］，以及非選擇性陽離子通道［5］直接作用，但其作用機(jī)制有待深入研究。本研究擬構(gòu)建新的CaM突變體，以便進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及其對各種離子通道的調(diào)節(jié)作用。

CaM由148個氨基酸組成，空間結(jié)構(gòu)呈啞鈴型，兩端（N-lobe，C-lobe）各有2個EF-hand結(jié)構(gòu)域，4個EF-hand都可以結(jié)合Ca2+。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中涉及的CaM突變體就是指CaM鈣結(jié)合位點(diǎn)突變體，即CaM的4個EF-hand上某些關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生了突變，使得不能與Ca2+結(jié)合，導(dǎo)致其功能部分或全部喪失［6-7］。一般認(rèn)為Ca2+/CaM復(fù)合物具有重要的生理學(xué)功能，CaM鈣結(jié)合位點(diǎn)突變體被廣泛應(yīng)用于CaM作為Ca2+伴侶蛋白參與各種生物信息調(diào)節(jié)的機(jī)制研究中。

CaM也能結(jié)合Mg2+。CaM上4個EF-hand與Mg2+的解離常數(shù)約為1×10-2～1×10-4/mol，其中N-lobe上第1個EF-hand與Mg2+親和力最高，C-lobe上第2個EF-hand為其次，其余2個位點(diǎn)親和力很弱［8］。目前研究認(rèn)為，Mg2+/CaM復(fù)合物可引起CaM局部構(gòu)象改變，但其功能變化鮮見報(bào)道。為此，本研究設(shè)計(jì)了3個CaM鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體：CaMN（D24N），即點(diǎn)突變CaM的N-lobe上鎂結(jié)合位點(diǎn)；CaMC（D133N），即點(diǎn)突變CaM的C-lobe上鎂結(jié)合位點(diǎn)；以及雙突變體CaMNC（D24N+D133N），即同時突變CaM的N-lobe和C-lobe上鎂結(jié)合位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建鈣調(diào)蛋白3種Mg2+結(jié)合位點(diǎn)突變體的質(zhì)粒載體并進(jìn)行表達(dá)純化及鑒定，為進(jìn)一步揭示Mg2+/CaM復(fù)合物的功能及體內(nèi)生物學(xué)意義奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

pGEX-6P-3/CaMN、pGEX-6P-3/CaMC和pGEX-6P -3/CaMNC鈣調(diào)蛋白鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體的重組質(zhì)粒由武漢金開瑞生物工程有限公司合成提供。Escherichia coli BL21由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；胰化蛋白胨，酵母提取物由Oxoid公司提供；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），氨芐青霉素（ampicillin，AMP），溶菌酶，二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT），月桂酰肌氨酸（N-lauroylsarcosine sodium salt）由Sigma公司提供；Triton X-100，十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）由BIOSHARP公司提供；Glutathione-Sepharose 4B珠子（GS-4B珠子），PreScission蛋白酶由GE Healthcare公司提供；Bradford蛋白濃度測定試劑盒由碧云天公司提供。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建

應(yīng)用點(diǎn)突變試劑盒制備鈣調(diào)蛋白鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體（CaMN、CaMC和CaMNC）編碼序列并克隆至載體pGEX-6P-3。

1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

采用42℃精確熱擊法將上述3種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，得到基因重組BL21大腸桿菌，具體操作參考文獻(xiàn)［9］。

1.4質(zhì)粒提取

第二，突出教學(xué)重點(diǎn)，確保幼兒一日活動的高效性。幼兒園一日活動的內(nèi)容非常豐富，細(xì)節(jié)較多，因此，幼兒園應(yīng)在每一學(xué)期設(shè)置不同的重點(diǎn)，扎實(shí)地展開幼兒的教學(xué)活動。在教學(xué)過程中要注重理論與實(shí)踐之間的結(jié)合，通過案例的示范、研究討論、實(shí)踐與反思等來提高教學(xué)活動的時效性。

采用堿裂解法和硅基質(zhì)膜材料特異性吸附DNA的方法從大腸桿菌中小量提取質(zhì)粒DNA。按照高純度質(zhì)粒小提試劑盒（DP107，北京天根生物工程有限公司）說明書進(jìn)行提取。

1.4.1提取質(zhì)粒的酶切鑒定：該重組質(zhì)粒具有SalⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，選用這2個限制性內(nèi)切酶（NEB公司）進(jìn)行酶切鑒定。反應(yīng)體系：1 μL RE緩沖液，0.25 μL SalⅠ，0.25 μL NotⅠ，1 μL質(zhì)粒DNA，7.5 μL DEPC水，反應(yīng)總體系10μL。37℃培養(yǎng)箱孵育1 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像。

1.4.2提取質(zhì)粒的DNA測序：應(yīng)用雙脫氧終止法進(jìn)行DNA測序，由武漢金開瑞生物工程有限公司完成。

1.5融合蛋白表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌后保留菌種，取適量相對應(yīng)的菌種加入裝有400 mL LB（含AMP 50 μg/mL）培養(yǎng)液的錐形瓶中，利用振蕩水浴鍋在37℃、100 r/min條件下培養(yǎng)13～16 h。當(dāng)A600值達(dá)到0.6～1.0時，加入IPTG至1 mmol/L，繼續(xù)在37℃、110 r/min的條件下振搖培養(yǎng)4 h，誘導(dǎo)CaM突變體的融合蛋白表達(dá)。

1.6蛋白純化

將上述菌液離心后棄上清，用PBS重懸沉淀菌體，加入溶菌酶至0.2 mg/mL，DTT至10 mol/L，冰浴30 min后低溫超聲波破碎細(xì)菌。超聲破碎后菌液低溫高速離心取上清，加入相應(yīng)量的GS-4B珠子，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜。次日清晨，用Tris緩沖液（pH 8.0）清洗后，加入1% PreScission蛋白酶，室溫最大速度旋轉(zhuǎn)酶切蛋白5 h，使得融合蛋白GST與目的蛋白分離。600 r/min離心3 min，上清即為提純的CaM突變體蛋白。部分純化蛋白用于純度鑒定和濃度測定，其余-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1純化蛋白的純度鑒定：利用15% SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白的相對分子量和純度。

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用1%瓊脂糖電泳鑒定插入CaM突變體的pGEX-6P-3載體的質(zhì)粒。質(zhì)粒pGEX-6P-3經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切分別插入3種鈣調(diào)蛋白鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體，即pGEX-6P-3/CaMN、pGEX-6P-3/CaMC和pGEX-6P-3/CaMNC。質(zhì)粒pGEX-6P-3約為4 900 bp，SalⅠ和NotⅠ之間的堿基全長為18 bp，CaM突變體約為467 bp，所以CaM突變體重組質(zhì)粒的長度約5 349 bp。重組質(zhì)粒用SalⅠ和NotⅠ雙酶切后應(yīng)該得到1個大分子量DNA片段（約4 882 bp，pGEX-6P-3載體）和1個小分子量DNA片段（約467 bp，CaM突變體）。電泳結(jié)果顯示，3種CaM突變體重組質(zhì)粒酶切后，在分子量約5 000 bp和500 bp處均有一明顯的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符，表明CaM突變體重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2CaM突變體的DNA測序

為鑒定CaM突變體，測序結(jié)果用GeneTool軟件與野生型CaM［homo sapiens calmodulin 2（phosphorylase kinase，delta），CALM2］比對。CaMN測序結(jié)果顯示：基因序列的第70位堿基由G突變成了A；CaMC測序結(jié)果顯示：基因序列的第397位堿基由G突變成了A；CaMNC測序結(jié)果顯示：基因序列的第70位和第397位堿基同時由G突變成了A，見圖2A。根據(jù)測得的CaM堿基序列及3個堿基決定1個氨基酸的原則，獲得CaM氨基酸順序。CaMN突變體氨基酸序列與野生型相比，第24個氨基酸殘基由D突變成了N；CaMC突變體氨基酸序列與野生型相比，第133個氨基酸殘基由D突變成了N；CaMNC突變體氨基酸序列與野生型相比，第24和第133位氨基酸殘基均由D突變成了N，見圖2B。該結(jié)果與設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)一致，進(jìn)一步表明CaM突變體重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3純化后CaM突變體的純度鑒定

圖1　CaM突變體重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖Fig.1 Enzyme digestion analysis of CaM mutants recombinant plasmids

圖2　CaM突變體測序結(jié)果及相對應(yīng)氨基酸序列圖Fig.2 DNA sequence identification of CaM mutants and their amino acids

CaM由148個氨基酸組成，表觀分子量約為16.7×103。點(diǎn)突變后的3種CaM突變體表觀分子量仍為16.7×103。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示（圖3），在Marker 15×103條帶的稍微偏上處CaM、CaMN、CaMC和CaMNC4個泳道分別出現(xiàn)1條粗蛋白條帶，即分別為CaM及其突變體蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致。電泳結(jié)果顯示附近基本無雜帶，提示純化后CaM突變體的蛋白純度較高。

2.4純化后CaM突變體的濃度測定

采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，將各樣品稀釋4倍后用酶標(biāo)儀在波長595 nm處測得OD595值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算所得純化后CaM突變體（CaMN、CaMC和CaMNC）的蛋白濃度依次為1.0、0.9、1.2 mg/mL。與同一方法提純的野生型CaM的濃度（1.0 mg/mL）無明顯區(qū)別。

圖3　純化后CaM突變體變性凝膠電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of purified CaM and its mutants

3　討論

為深入研究CaM的生物學(xué)功能，了解與其他蛋白的相互作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了蛋白重組技術(shù)；首次設(shè)計(jì)了CaM鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體；應(yīng)用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)GST融合蛋白；采用GS-4B珠子和PreScission蛋白酶分離純化突變體蛋白，為后續(xù)開展體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)等工作提供保障。本實(shí)驗(yàn)選用表達(dá)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)——大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉，可以快速大量地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)表達(dá)載體選用融合表達(dá)載體中的GST（谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）系統(tǒng)。因?yàn)镃aM分子量較小，以融合蛋白形式表達(dá)，可增強(qiáng)mRNA及表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性，并生產(chǎn)出可溶性蛋白；同時采用該表達(dá)載體簡化了蛋白分離純化步驟。

本實(shí)驗(yàn)用pGEX-6P-3/CaMN、pGEX-6P-3/CaMC和pGEX-6P-3/CaMNC重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，可穩(wěn)定地表達(dá)GST-CaM鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體融合蛋白，且表達(dá)突變體的基因性狀穩(wěn)定。GS -4B珠子可穩(wěn)定結(jié)合GST-CaM鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體融合蛋白，經(jīng)PreScission蛋白酶特異性酶切，可獲得較純CaM鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體蛋白。本實(shí)驗(yàn)提取的重組質(zhì)粒，用雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化成功，測序CaM鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體基因正確。分離純化所得蛋白，經(jīng)SDSPAGE電泳鑒定為目的蛋白（CaMN、CaMC和CaMNC），且純度較高；Bradford法測定蛋白濃度較高。以上結(jié)果提示，采用本實(shí)驗(yàn)方法可穩(wěn)定可靠獲得較高純度較高濃度的CaM鎂結(jié)合位點(diǎn)突變體，從而為深入研究CaM突變體的生物學(xué)特性及其功能奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯武玉欣）

Vector Construction，protein Expression，purification and Identification of Calmodulin Mg2+Binding Site Mutants

ZHAO Meimi，LI Zhuo，SHAO Dongxue，LIANG Hongyue，YAN Shan，F(xiàn)ENG Rui，SUN Xuefei，GUO Feng，HAO Liying
（Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To construct plasmid vectors of calmodulin（CaM）Mg2+binding site mutants，and to express，purify and identify the mutant proteins.Methods Three kinds of cDNAs coding for the mutated CaM were cloned into pGEX-6P-3 plasmid vectors.These recombinant plasmids were transfected into Escherichia coli BL21 to express GST fusion proteins of CaM mutants.The fusion proteins were purified with Glutathione-Sepharose 4B beads and PreScission protease.Results Both enzyme digestion analysis and DNA sequence identification proved the successful construction of the CaM mutant plasmids.SDS-PAGE results showed the high purity of each CaM mutant protein.The concentrations of three CaM mutants were around 1.0 mg/mL.Conclusion Prokayotic expression vectors of CaMMg2+binding site mutants were successfully developed，and the eligible CaM mutant proteins were obtained.This study provided an important basis for further study on CaM's biological function.

calmodulin；mutant；fusion protein；pGEX-6P-3

R96

B

0258-4646（2016）05-0394-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.003

國家自然科學(xué)基金（31471091，31500930）；醫(yī)學(xué)電生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（KeyME-2014-03）

趙美瞇（1978-），女，講師，博士.

郝麗英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2015-09-02

網(wǎng)絡(luò)出版時間：