代謝工程改造大腸桿菌合成L-異亮氨酸的研究

李燕軍，張海賓，麻杰，張成林，謝希賢，陳寧

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

代謝工程改造大腸桿菌合成L-異亮氨酸的研究

李燕軍1，2，3，張海賓1，麻杰1，張成林1，2，3，謝希賢1，2，3，陳寧1，2，3

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌Escherichia coli THRD為出發(fā)菌株，利用基因重組技術(shù)替換ilvLXGMEDA啟動(dòng)子并過表達(dá)解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilvA和ilvIH，以期獲得L-異亮氨酸生產(chǎn)菌。將ilvLXGMEDA啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc并敲除ilvLXGM后獲得ILE01菌株，于該菌株中分別過表達(dá)解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilvIH及共表達(dá)解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilvA和ilvIH，獲得菌株ILE02和ILE03，其L-異亮氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到1.75 g/L和2.19 g/ L。針對ILE03α-酮丁酸積累量過高的問題，通過改變操縱子中ilvA和ilvIH的順序調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平，獲得菌株ILE04，其L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)2.85 g/L。利用ILE04于5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，L-異亮氨酸產(chǎn)量、發(fā)酵強(qiáng)度及轉(zhuǎn)化率分別為5.23 g/L、0.17 g/（L·h）及4.6%。

L-異亮氨酸；大腸桿菌；反饋抑制；蘇氨酸脫水酶；乙酰羥基酸合成酶

L-異亮氨酸是人和脊椎動(dòng)物的八種必需氨基酸之一，在生命活動(dòng)中具有極其重要的作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。目前主要采用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)L-異亮氨酸，然而該類菌株發(fā)酵周期較長［1］。大腸桿菌具有遺傳背景清晰、技術(shù)操作簡單、代時(shí)短等優(yōu)勢，因而被廣泛應(yīng)用于L-蘇氨酸、L-色氨酸及L-苯丙氨酸等氨基酸的生產(chǎn)［2］。

圖1　L-異亮氨酸代謝調(diào)控機(jī)制

大腸桿菌L-異亮氨酸合成途徑及調(diào)控機(jī)制如圖1所示，L-蘇氨酸經(jīng)5步反應(yīng)后生成L-異亮氨酸，其中ilvA編碼的蘇氨酸脫水酶和ilvIH編碼的乙酰羥基酸合成酶為關(guān)鍵酶（共3個(gè)同工酶，分別由ilvBN、ilvGM及ilvIH編碼）受L-異亮氨酸的反饋?zhàn)瓒艉头答佉种谱饔茫?］。Guillouet等［4］于野生型大腸桿菌和谷棒桿菌中過表達(dá)ilvA，使L-異亮氨酸的產(chǎn)量分別提高50倍和4倍，合成L-賴氨酸的代謝流70%流向L-異亮氨酸合成途徑。Holátko等［5］發(fā)現(xiàn)降低ilvA轉(zhuǎn)錄量可減少L-異亮氨酸產(chǎn)量。Yin等［6］在L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicum JH13-156中串聯(lián)過表達(dá)解除反饋抑制的ilvA和ilvBN，使得L-異亮氨酸產(chǎn)量提高131.7%。

課題組保藏的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌Escherichia coli THRD于5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵28 h可產(chǎn)L-蘇氨酸130 g/L以上，因此該菌株經(jīng)代謝工程改造具有合成L-異亮氨酸的潛力［7］。本文采用基因重組技術(shù)將THRD ilvLXGMEDA啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc并敲除ilvLXGM，在此基礎(chǔ)上通過過表達(dá)解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilvA和ilvIH，以期獲得L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒及引物

本文所用菌株、質(zhì)粒及引物分別見表1、表2和表3。

表1　菌株

表2　質(zhì)粒

接上表

表3　引物

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L，固體培養(yǎng)基需添加瓊脂條20 g/ L，pH 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

斜面培養(yǎng)基：蔗糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂條20 g/ L，pH 7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，酵母粉10 g/L，胰蛋白胨6 g/L，（NH4）2SO42 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4· H2O 10 mg/L，維生素B族（VB1、VB3、VB5、VB7、VB12）溶液1mg/L，pH 7.0～7.2，115℃滅菌15min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉2 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 50 mg/L，MnSO4·H2O 50 mg/L，B族維生素（VB1、VB3、VB5、VB7、VB12）0.8mg/L，玉米漿20 mL/L，pH 7.0～7.2，115℃滅菌20min。

1.2方法

1.2.1菌株ILE01構(gòu)建

根據(jù)Genbank中E.coli MG1655的ilvLXGMEDA序列，采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該操縱子啟動(dòng)子替換片段的引物（表3）。分別利用ilv-1和ilv-2、ilv-3和ilv-4、ilv-5和ilv-6、ilv-7和ilv-8擴(kuò)增啟動(dòng)子上游同源臂、質(zhì)粒pKD3中氯霉素抗性基因盒、啟動(dòng)子Ptrc以及下游同源臂。將啟動(dòng)子上游同源臂與氯霉素抗性基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物以等摩爾比混合作為重疊PCR模板，利用引物ilv-1和ilv-4擴(kuò)增獲得二者重疊片段，同理獲得啟動(dòng)子Ptrc與下游同源臂重疊片段。采用相同方法，利用引物ilv-1和ilv-8獲得上游同源臂、氯霉素抗性基因盒、啟動(dòng)子Ptrc以及下游同源臂重疊片段ilvPtrc。構(gòu)建過程如圖2所示。

圖2　ilvLXGMEDA操縱子啟動(dòng)子替換片段ilvPtrc的構(gòu)建示意圖

將純化后的ilvPtrc片段電轉(zhuǎn)化至含有pKD46的E.coli THRD的感受態(tài)細(xì)胞，于LB液體培養(yǎng)基中37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h后，全部涂布至含氯霉素（30μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單菌落利用引物ilv-1和ilv-8進(jìn)行PCR。將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化至驗(yàn)證為陽性的轉(zhuǎn)化子感受態(tài)中，經(jīng)復(fù)蘇后涂布至含氨芐青霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上并于37℃倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單菌落利用引物ilv-1和ilv-8進(jìn)行PCR。將陽性轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中，42℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜后，在LB固體培養(yǎng)基上劃線。挑取單菌落分別接種于LB固體培養(yǎng)基或含氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，選擇在前者生長而后者不生長的菌落，再次進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的菌株命名為ILE01。構(gòu)建過程如圖3所示。

圖3　ILE01構(gòu)建示意圖

1.2.2重組質(zhì)粒pWSK-IH、pWSK-AIH和pWSK

IHA及菌株ILE02、ILE03和ILE04的構(gòu)建

根據(jù)Genbank中E.coli MG1655蘇氨酸脫水酶編碼基因ilvA和乙酰羥基酸合成酶III編碼基因ilvIH的序列，用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物，其中引物ilvA-2（1 339thC→T，1 341stG→T，1 351stC→G，1 352ndT→C）、ilvA-3（1 339thG→A，1 341stC→A，1 351stG→C，1 352ndA→G）、ilvIH-2（1 768thG→A，1 777thC→T）及ilvIH-3 （1 768thC→T，1 777thG→A）含突變位點(diǎn)［8］。以THRD基因組為模板，分別利用ilvIH-1和ilvIH-2 及ilvIH-3和ilvIH-4擴(kuò)增ilvIH基因上下游片段，將二者以等摩爾比混合作為重疊PCR模板，利用引物ilvIH-1和ilvIH-4擴(kuò)增并回收后經(jīng)Pst I和Xho I雙酶切連接至經(jīng)相同酶切的pWSK29質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pWSK-IH。

以THRD基因組為模板，分別利用ilvA-1和ilvA-2及ilvA-3和ilvA-4擴(kuò)增ilvA基因上下游片段，將二者以等摩爾比混合作為重疊PCR模板，利用引物ilvA-1和ilvA-4擴(kuò)增并回收后經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切連接至經(jīng)相同酶切的pWSK-IH質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pWSK-AIH。分別利用引物ilvIH-5和ilvIH-6及ilvA-5和ilvA-6擴(kuò)增獲得ilvIH和ilvA，經(jīng)回收、酶切后依次連接至pWSK29，獲得重組質(zhì)粒pWSK-IHA。分別將pWSK-IH、pWSK-AIH和pWSK-IHA電轉(zhuǎn)化至ILE01，獲得ILE02、ILE03及ILE04。

1.2.3實(shí)時(shí)定量RT-PCR

根據(jù)ilvA、ilvD和ilvE及E.coli MG1655 16S rDNA（rrnb，內(nèi)參）基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物（表3）。利用Trizol提取菌體總RNA并用primeScriptTMRT試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量RT-PCR試劑盒及Realtime PCR儀測定基因轉(zhuǎn)錄水平（反應(yīng)程序?yàn)榈谝徊剑?5℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步：95℃變性5 s，60℃退火和延伸共34 s，40個(gè)循環(huán)）。采用ΔΔCT相對定量法計(jì)算被試基因的轉(zhuǎn)錄量［9］。

1.2.4發(fā)酵條件

搖瓶發(fā)酵：將ILE01、ILE02、ILE03和ILE04菌株經(jīng)斜面活化后接種至含30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，32℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為4～6時(shí)，以10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至含30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，32℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。用氨水調(diào)節(jié)pH維持在6.7～7.0。發(fā)酵周期為28 h，期間補(bǔ)加濃度為60%的葡萄糖。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：將LE04接種于斜面培養(yǎng)基上，并于37℃下培養(yǎng)14～18 h，取適量無菌去離子水清洗斜面制備成菌懸液，然后全部接種至裝有1.5 L種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。培養(yǎng)溫度36℃，自動(dòng)流加氨水控制pH約7.0，培養(yǎng)至OD600為12～14 h時(shí)，按13%（體積比）比例保留種子培養(yǎng)物并加入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度控制在37℃，控制pH約7.0，溶氧控制在30%～40%，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡時(shí)，以一定脈沖速度流加800 g/L葡萄糖溶液。菌體OD600為20時(shí)，添加終濃度0.1mmol/L的IPTG。

第六，封樁。截樁完成后，在保持千斤頂荷載穩(wěn)定不變的情況下將樁、梁預(yù)留鋼筋采用鋼套筒接駁器進(jìn)行連接，澆筑微膨脹混凝土封樁。

1.2.5分析方法

菌體生物量以菌體干重計(jì)，根據(jù)公式（菌體干重=0.37×OD600）計(jì)算菌體生物量。

葡萄糖濃度采用SBA-40C生物傳感儀測定。

采用高效液相色譜儀測定氨基酸及α-酮基丁酸濃度，氨基酸檢測條件為：Agilent C18（150 mm×4.6mm，5μm），采用乙腈和磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫，柱溫39℃，流動(dòng)相流速1 mL/min，檢測波長276 nm；α-酮基丁酸檢測條件為：Aminex HPX-87H column（300 mm×7.8 mm，5 μm），流動(dòng)相5mmol/LH2SO4，流速0.5mL/min，柱溫30℃，檢測波長215 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1ilvLXGMEDA啟動(dòng)子替換對菌株ILE01

ilvEDA轉(zhuǎn)錄水平及其L-蘇氨酸代謝的影響

在大腸桿菌THRD基因組中，ilvLXGMEDA為一個(gè)操縱子，其中ilvL為弱化子，對下游基因具有弱化作用。此外，ilvGM基因中ilvG基因發(fā)生堿基缺失突變，導(dǎo)致ilvGM基因編碼的乙酰羥基酸合成酶無活性［8，10］。因此，替換ilvLXGMEDA操縱子啟動(dòng)子時(shí)，同時(shí)將ilvLXGM敲除，以期達(dá)到強(qiáng)化ilvEDA基因轉(zhuǎn)錄的目的。

M：Mark；1：上游同源臂；2：氯霉素抗性片段；3：trc啟動(dòng)子；4：下游同源臂；5：上游同源臂和氯霉素抗性基因盒重疊片段；6：trc啟動(dòng)子和下游同源臂重疊片段；7：啟動(dòng)子替換四段重疊片段；8：以出發(fā)菌株基因組為模板；9：以第一次重組菌株基因組為模板；10：以菌株ILE01基因組為模板

將ilvPtrc電轉(zhuǎn)化至含pKD46質(zhì)粒的E.coli THRD，經(jīng)篩選后挑取單菌落利用引物ilv-1和ilv-8進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2 109 bp（即第一次重組菌株，出發(fā)菌株產(chǎn)物大小為3 000 bp，圖4），表明ilvPtrc成功整合至基因組中。將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到上述菌株中，經(jīng)篩選后挑取單菌落利用引物ilv-1和ilv-8進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物分子量為1 179 bp，表明啟動(dòng)子替換成功同時(shí)ilvLXGM被敲除。

為了驗(yàn)證啟動(dòng)子的替換對其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的影響，分別測定出發(fā)菌株THRD和ILE01 ilvA、ilvD及ilvE的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明ILE01上述3基因的轉(zhuǎn)錄水平分別較出發(fā)菌株提高10.2倍、15.9倍和8.1倍，說明Ptrc啟動(dòng)子的替換有助于上述基因轉(zhuǎn)錄水平的提高。

對ILE01進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察替換ilvLXGMEDA啟動(dòng)子對其產(chǎn)酸特性的影響，以轉(zhuǎn)化有pWSK29的THRD為對照。結(jié)果如表4所示：ILE01的L-蘇氨酸積累量顯著降低（由25.7 g/L降低至21.5 g/L），α-酮丁酸積累1.21 g/L，但未檢測到L-異亮氨酸生成。表明增強(qiáng)ilvEDA轉(zhuǎn)錄水平可使L-蘇氨酸代謝為α-酮丁酸，但可能由于乙酰羥基酸合成酶水平不足導(dǎo)致其難以進(jìn)一步代謝。

2.2過表達(dá)ilvIH對異亮氨酸產(chǎn)量的影響

大腸桿菌共有3個(gè)乙酰羥基酸合成酶，分別由ilvBN、ilvGM及ilvIH編碼，如前所屬ilvGM因堿基缺失突變而無活性，ilvIH對α-酮丁酸的親和力優(yōu)于ilvBN，故選擇ilvIH進(jìn)行過表達(dá)。

利用重疊PCR手段擴(kuò)增獲得ilvIH突變體，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)獲得的突變體與預(yù)期一致（1 768thG→A，1 777thC→T），即獲得解除反饋抑制的ilvIH。將其連接至pWSK29，經(jīng)Pst I及Pst I和Xho I酶切后，分別獲得大小約為7 000、5 000及2 000 bp的條帶，與預(yù)期一致（分別為7 653、5 453和2 219 bp，圖5），表明ilvIH成功連接至pWSK29，將其命名為pWSK-IH。

將pWSK-IH轉(zhuǎn)化至ILE01后，經(jīng)篩選、菌落PCR驗(yàn)證后獲得ILE02，對其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察過表達(dá)解除反饋抑制的ilvIH對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響，以轉(zhuǎn)化有pWSK29的THRD為對照。結(jié)果如表4所示：ILE02 L-蘇氨酸的積累量顯著降低（由21.5 g/L降低至10.7 g/L），L-異亮氨酸的產(chǎn)量為1.75 g/L，α-酮丁酸積累量亦顯著降低（0.49 g/L）。

2.3共表達(dá)ilvA和ilvIH對異亮氨酸產(chǎn)量的影響

在大腸桿菌中ilvA表達(dá)產(chǎn)物蘇氨酸脫水酶受L-異亮氨酸的反饋抑制作用，而THRD的ilvA未發(fā)生突變，即該菌株蘇氨酸脫水酶受L-異亮氨酸的反饋抑制作用未被解除，因此于ILE01中共過表達(dá)解除反饋抑制的ilvA和ilvIH考察其對異亮氨酸產(chǎn)量的影響。

利用重疊PCR手段擴(kuò)增獲得ilvA突變體，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)獲得的突變體序列與預(yù)期一致（1 339thC→T，1 341stG→T，1 351stC→G，1 352ndT→C），即獲得解除反饋抑制的ilvA。將其連接至pWSK-IH，經(jīng)Xba I及Xba I和BamH I酶切后，分別獲得大小約為9 000、7 000及1 500 bp的條帶，與預(yù)期一致（分別為9 198、7 653和1 545 bp，圖5），表明ilvA成功連接至pWSK-IH，即獲得含人工操縱子ilvAIH的重組質(zhì)粒，將其命名為pWSK-AIH。

將pWSK-IH轉(zhuǎn)化至ILE01后，經(jīng)篩選、菌落PCR驗(yàn)證后獲得ILE03，對其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表4所示：ILE03的L-蘇氨酸積累量大幅度降低（0.29 g/L），L-異亮氨酸的產(chǎn)量為2.19 g/ L，較ILE02提高25%。然而α-酮丁酸積累量卻有所升高（1.47 g/L），暗示α-酮丁酸進(jìn)一步代謝的流量不足致使其積累，其原因可能是ilvA的表達(dá)強(qiáng)度高于ilvIH。

因此，改變?nèi)斯げ倏v子中ilvA和ilvIH的順序，即將ilvIH置于ilvA上游，獲得重組質(zhì)粒pWSK-IHA，將其轉(zhuǎn)化至ILE01后，經(jīng)篩選、菌落PCR驗(yàn)證后獲得ILE04并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表4所示：ILE04的L-異亮氨酸的產(chǎn)量為2.85 g/L，較ILE02提高30.1%，且α-酮丁酸積累量降低至0.48 g/L。

圖5　質(zhì)粒pWSK-IH和pWSK-AIH酶切驗(yàn)證圖譜

表4　不同菌株L-蘇氨酸、α-酮丁酸及L-異亮氨酸合成量

2.4菌株ILE04發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將菌株ILE04于5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察其產(chǎn)酸特性。結(jié)果如圖6所示：菌株于14 h時(shí)生物量最高，達(dá)21.01 g/L（細(xì)胞干重），隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，22 h后生物量降低；L-異亮氨酸于4 h時(shí)開始合成，10 h后合成速率升高，16 h后合成速率下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)其濃度達(dá)5.23 g/L，單位菌體產(chǎn)量和發(fā)酵強(qiáng)度分別為0.25 g/g（細(xì)胞干重）和0.17 g/（L·h），轉(zhuǎn)化率為4.6%。

圖6　菌株ILE04發(fā)酵過程曲線

表5　菌株ILE04主要發(fā)酵參數(shù)

3　結(jié)論

本文以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌THRD為研究對象，采用代謝工程原理和技術(shù)，通過替換ilvLXGMEDA啟動(dòng)子、過表達(dá)解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilvA和ilvIH，實(shí)現(xiàn)L-蘇氨酸代謝途徑的延伸，獲得能夠過量積累L-異亮氨酸的菌株ILE04。該菌株于5 L發(fā)酵罐中L-異亮氨酸產(chǎn)量、發(fā)酵強(qiáng)度及轉(zhuǎn)化率分別為5.23 g/L、0.17 g/（L·h）及4.6%。本文可為L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的代謝工程改造提供參考。

［1］MORBACH S，SAHM H，EGGELING L.L-isoleucine production with Corynebacterium glutamicum：Further flux increase and limitation of export［J］.Applied and environmentalmicrobiology，1996，62（12）：4345-4351.

［2］PARK JH，JANGY S，LEE JW，etal.Escherichia coli wasanew platform strain for theenhanced production of L-valineby systems metabolic engineering［J］.Biotechnology and bioengineering，2011，108（5）：1140-1147.

［3］PARK JH，LEE SY.Fermentative production of branched chain amino acids：a focus on metabolic engineering［J］.Applied microbiology and biotechnology，2010，85（3）：491-506.

［4］GUILLOUET S，RODAL A A，AN G H，et al.Expression of the Escherichia coli catabolic threonine dehydratase in Corynebacterium glutamicum and its effect on isoleucine production［J］.Applied and environmentmicrobiology，1999，65 （7）：3100-3107.

［5］HOLATKO J，ELISAKOVA V，PROUZA M，et al.Metabolic engineering of the L-valine biosynthesis pathway in Corynebacterium glutamicum using promoter activity modulation ［J］.Journal of biotechnology，2009，139（3）：203-210.

［6］YIN Lianghong，HU Xiaoqing，XU Daqing，et al.Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acidsynthaseincreaseL-isoleucineproduction in Corynebacterium glutamicum［J］.Metabolic engineering，2012，14（5）：542-550.

［7］XIE Xixian，LIANG Yuan，LIU Hongliang，et al.Modification of glycolysis and its effecton production of threonine in Escherichia coli［J］.Journal of industrial microbiology and biotechnology，2014，41（6）：1007-1015.

［8］PARK J H，OH J E，LEE K H，et al.Rational design of Escherichia coli for L-isoleucine production.［J］.Acs synthetic biology，2012，1（11）：532-540.

［9］LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［10］HASHIGUCHIK，TAKESADA H，SUZUKIE，etal.Construction of an L-isoleucine overproducing strain of Escherichia coli K-12［J］.Bioscience biotechnology and biochemistry，1999，63（4）：672-679.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Study on metabolic engineering of Escherichia coli for L-isoleucine production

LIYanjun1，2，3，ZHANG Haibin1，MA Jie1，ZHANG Chenglin1，2，3，XIE Xixian1，2，3，CHEN Ning1，2，3
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.National and Local United Engineering Lab ofMetabolic Control Fermentation Technology，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Engineering Lab of Efficientand Green Amino Acid Manufacture，Tianjin 300457，China）

L-threonine-producing strain Escherichia coli THRD was used as starting strain to construct an L-isoleucine producing strain via metabolic engineering.Native promoter of ilvLXGMEDA was replaced with strong promoter Ptrc，resulting in ILE01.In order to relieve feedback inhibition，overexpression of ilvIH and ilvA together with ilvIH in ILE01 resulted in ILE02 and ILE03，of which L-isoleucine production was 1.75 g/L and 2.19 g/L，respectively.To reduceα-keto butyric acid accumulation in ILE03，ilvA and ilvIH transcription level was regulated via the change of the genes position in the artificial operon to obtain ILE04 and the L-isoleucine production of ILE04 was 2.85 g/L.Fermentation was performed in 5-L fermentator with ILE04，in which L-isoleucine production，productivity and conversion were 5.23 g/L，0.17 g/（L·h）and 4.6%，respectively.

L-isoleucine；Escherichia coli；feedback inhibition；threonine dehydratase；acetohydroxy acid synthase

TQ922

A

1674-2214（2016）03-0133-07

2016-05-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31300069）；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510057063）；天津市科技特派員項(xiàng)目（15JCTPJC62800）

李燕軍（1983—），男，山西呂梁人，講師，博士，研究方向?yàn)楣劝彼岚魲U菌利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸及其衍生物，E-mail：yili@tust.edu.cn.