透明質(zhì)酸工業(yè)發(fā)酵染菌分析與處理

宋磊，孟國慶

（菏澤學院生命科學系，山東菏澤274015）

透明質(zhì)酸工業(yè)發(fā)酵染菌分析與處理

宋磊，孟國慶

（菏澤學院生命科學系，山東菏澤274015）

染菌是透明質(zhì)酸工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中最為棘手的問題，同時也是直接影響產(chǎn)品質(zhì)量、提取收率和成本的關(guān)鍵因素。提出了透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌的檢測方法，從染菌時間、類型、范圍三方面探討透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌的原因，并根據(jù)實際生產(chǎn)經(jīng)驗，分別從菌種、空氣、管路配置、系統(tǒng)死角清理、培養(yǎng)基滅菌、車間環(huán)境等方面明確防止發(fā)酵染菌的具體措施，得出了斜面菌種、種子罐、發(fā)酵罐不同時期染菌后的補救措施。

透明質(zhì)酸；發(fā)酵；染菌；預防和處理

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，簡稱HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通過β-1，4和β-1，3糖苷鍵反復交替連接而成的高分子聚合物。由于其獨特的流變學特性、黏彈性、保濕性以及良好的生物相容性，透明質(zhì)酸在化妝品領(lǐng)域、醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的應用［1］。透明質(zhì)酸用于食品還處于起步階段，近年來國內(nèi)外關(guān)于HA口服后吸收、代謝和功效的研究越來越多，大量科學證據(jù)證明了其功效。特別是2008年5月，國家衛(wèi)生部按照《新資源食品管理辦法》的規(guī)定發(fā)布相關(guān)公告，批準透明質(zhì)酸鈉作為一種新資源食品用于保健食品原料，這一公告的發(fā)布必將進一步推動HA在我國保健食品中的應用。

目前，透明質(zhì)酸的獲得主要有兩種方法：從動物組織中提取和利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)。動物組織提取原料來源少、提取成本高、環(huán)境污染大；而微生物發(fā)酵法可以利用微生物大量生產(chǎn)透明質(zhì)酸，工藝簡單且提取成本較低，具有更廣闊的發(fā)展前景，是目前透明質(zhì)酸生產(chǎn)的主要方法。

透明質(zhì)酸發(fā)酵最常用的菌株是營養(yǎng)缺陷型獸疫鏈球菌，屬于兼性厭氧菌，在有氧和無氧情況下都可以生長。在發(fā)酵過程中，鏈球菌的培養(yǎng)溫度、pH、溶氧等條件都非常適宜其他細菌的生長，同時透明質(zhì)酸發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)異常豐富，無任何抑制細菌生長因子的存在，進一步增加透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌的可能性。發(fā)酵染菌對透明質(zhì)酸生產(chǎn)影響很大，輕則影響透明質(zhì)酸發(fā)酵產(chǎn)率，增加提取純化的難度，降低產(chǎn)品的質(zhì)量；重則倒罐，擾亂企業(yè)的正常生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。因此避免染菌是透明質(zhì)酸生產(chǎn)企業(yè)的一項重要工作內(nèi)容。本文結(jié)合實際生產(chǎn)情況，介紹近兩年來山東某生物公司透明質(zhì)酸發(fā)酵過程中染菌判定方法、原因、預防途徑和補救措施。

1　透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌檢測方法

透明質(zhì)酸發(fā)酵周期短，本公司所用菌種為馬疫鏈球菌，發(fā)酵周期一般為18～24 h，雜菌生長速率明顯高于生產(chǎn)菌株。如能及時發(fā)現(xiàn)染菌，根據(jù)本菌株生長特性以及感染雜菌的時間、類型相對應調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)的條件，遏制雜菌生長，就有可能避免倒罐的發(fā)生。因此及時準確的檢測雜菌方法對透明質(zhì)酸發(fā)酵有重要的影響。透明質(zhì)酸發(fā)酵最快速的檢測方法是顯微鏡鏡檢法［2］，如鏡檢判定染菌后應立即相對應調(diào)控培養(yǎng)條件。平板劃線法作為輔助驗證染菌的方法，比鏡檢法能檢出更多的雜菌，但培養(yǎng)周期長（需要過夜），可以為日后染菌原因分析提供一定的依據(jù)。肉湯檢測法主要用于無菌空氣的檢測。

1.1顯微鏡鏡檢法

從發(fā)酵罐無菌取樣后直接涂于載玻片上，置于油鏡下觀察菌種的形態(tài)特征，注意要不斷反復調(diào)整視野的寬度和深度進行仔細觀察，如在一個視野中發(fā)現(xiàn)兩個及以上的游動桿菌應判定為染菌。對于不動桿菌，首先觀察其透明度，如整個菌體透明狀態(tài)不一，可判定為死桿菌，如不能確定，應立即做臺盼藍排斥實驗，判斷是否為死菌，并于半小時后取樣觀察該形態(tài)雜菌數(shù)量有無增加。

1.2平板劃線法

1.2.1平板培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂（瓊脂、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、氯化鈉，pH 6.9～7.1），將其配好后121℃濕熱滅菌25～30min，然后冷卻至45～50℃倒入培養(yǎng)皿，冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)無菌培養(yǎng)24 h，挑出無菌落出現(xiàn)的平板備用。

1.2.2平板劃線

將滅菌后發(fā)酵培養(yǎng)基和待測疑似染菌發(fā)酵液劃線接種于多個平板中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征，具體包括：顏色、透明度、濕潤性、邊緣整齊性、是否隆起、接種針挑起有無拉絲等。如多個平板中均出現(xiàn)同一種或幾種不同于生產(chǎn)菌株的菌落特征的現(xiàn)象可判定為染菌。

1.3肉湯檢驗法

在確保無菌條件下，將無菌空氣引入肉湯培養(yǎng)基中，可連續(xù)通氣，然后置于37℃搖床中培養(yǎng)，如有渾濁現(xiàn)象發(fā)生，則發(fā)酵所用空氣為帶菌空氣，容易造成發(fā)酵染菌。

2　透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌原因分析

2.1根據(jù)染菌類型分析

耐熱性芽孢桿菌：由于透明質(zhì)酸發(fā)酵培養(yǎng)基原料常含有一些固體難溶雜質(zhì)異物，同時會添加一定量的有機硅油消泡劑，因此會導致培養(yǎng)基滅菌不徹底感染耐熱性芽孢桿菌，另外，發(fā)酵罐中常會存在著一些死角也會造成發(fā)酵感染這類雜菌。

無芽孢不耐熱游動桿菌：可能是由于種子帶菌、空氣過濾效率低、除菌不徹底、設(shè)備滲漏和操作問題等引起。

2.2根據(jù)染菌時間分析

由于透明質(zhì)酸發(fā)酵培養(yǎng)基是高糖培養(yǎng)基，因此細菌生長調(diào)整期時間較長，故染菌常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵6 h以后。如染菌發(fā)生在發(fā)酵前期（即發(fā)酵6～10 h），多數(shù)是由于轉(zhuǎn)種管道、補料管道滅菌不徹底，轉(zhuǎn)料過程中操作不當，種子帶雜菌或補料帶雜菌導致；如染菌發(fā)生在中后期（即發(fā)酵12 h以后），多是由于空氣過濾系統(tǒng)不嚴，設(shè)備滲漏，取樣不當造成；發(fā)酵至16 h以后，發(fā)酵液黏度較大，溶氧較低，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)染菌情況。

2.3根據(jù)染菌范圍分析

發(fā)酵罐、種子罐如同時發(fā)現(xiàn)大面積染菌，多是由于原始菌種不純或空氣系統(tǒng)除菌不嚴導致；單個發(fā)酵罐連續(xù)染菌多是由于設(shè)備問題造成的，如設(shè)備存在死角、閥門內(nèi)漏、機械密封不嚴等；而單個發(fā)酵罐偶爾染菌的原因最為復雜［3］，各種染菌的途徑都可能引起。需根據(jù)實際情況，查看生產(chǎn)記錄，逐個檢查分析排除可能存在的問題。

現(xiàn)將山東某生物公司2014年透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌原因統(tǒng)計列表如下（統(tǒng)計包括種子罐、發(fā)酵罐）。

表1　透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌原因

3　透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌預防措施

3.1防止菌種帶菌

3.1.1加強菌種室無菌環(huán)境管理

接種室為局部100級潔凈區(qū)，需嚴格按照GMP有關(guān)潔凈區(qū)規(guī)定進行管理［4］。除此之外，還應當做到每次無菌室使用后用紫外線照射30 min，并用0.1%的新潔爾滅及過氧乙酸等消毒液對環(huán)境及物品消毒。每隔一定時間對無菌室進行甲醛加高錳酸鉀熏蒸。種子固體斜面在培養(yǎng)過程中瓶塞上往往會附著塵埃，而在接種、刮斜面制備菌懸液等無菌操作過程拔瓶塞時，灰塵很容易落進瓶內(nèi)，造成種子帶菌。應當把斜面培養(yǎng)間當作亞無菌區(qū)進行管理，每日堅持用干凈濕抹布擦拭斜面培養(yǎng)間的地面及墻面。在充分消除對培養(yǎng)種子影響的情況下定期用消毒液（如0.1%的新潔爾滅、5%來蘇爾等）對斜面培養(yǎng)間進行消毒，定期用紫外線照射消毒。

3.1.2不斷純化、復壯生產(chǎn)菌種

該廠所用菌種為營養(yǎng)缺陷型鏈球菌，容易回復突變?yōu)楫a(chǎn)透明質(zhì)酸酶菌株，透明質(zhì)酸酶可將透明質(zhì)酸分解，影響透明質(zhì)酸產(chǎn)率。此外生產(chǎn)菌株的純化、復壯可確保無雜菌污染，因此需不斷對生產(chǎn)菌種進行純化、復壯。

3.2防止空氣帶菌

透明質(zhì)酸發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵，在發(fā)酵前期需氧量較少，僅用于滿足菌體生長繁殖需要，在發(fā)酵中后期需通入大量的無菌空氣以刺激夾膜的產(chǎn)生［5］。所以保證空氣無菌對透明質(zhì)酸發(fā)酵有著重要的影響。為避免空氣帶菌可以從以下幾個方面著手：1）嚴格按照空氣過濾系統(tǒng)滅菌操作規(guī)程，定期對無菌空氣系統(tǒng)進行徹底滅菌。過濾器消毒溫度要控制在120～130℃，消毒時間30 min，各個排氣閥全部打開不得留死角，消毒結(jié)束后一定要緩緩通入冷空氣，速度不能太快，否則會造成過濾器損壞，通氣1 h將過濾器吹干［6］。2）在罐體滅菌結(jié)束切入無菌空氣降溫過程中，一定要使無菌空氣的壓力高于種子罐、發(fā)酵罐的罐壓，以防止發(fā)酵液倒流進入空氣過濾系統(tǒng)。3）空氣壓縮機最好使用無油潤螺桿空壓機，防止油水去除不徹底進入過濾器，降低過濾器除菌效率。4）在進入前置高效過濾器之前使用換熱器對無菌空氣進行加熱，進一步降低空氣相對濕度。5）發(fā)酵罐前最好配置二級精細過濾器，進一步增強除菌效果。

3.3完善發(fā)酵車間管道布局、避免死角

管道布局應力求簡單方便、利于操作、不得相互影響。每個罐體應單獨設(shè)有獨立的排氣、排污管路。各種子罐和發(fā)酵罐轉(zhuǎn)種管路最好一一對應，縮短輸送距離。補料管路設(shè)分配站。罐體和有關(guān)管路應有利于蒸汽進行滅菌。對于轉(zhuǎn)種、取樣、補料等操作管路要有單獨的滅菌系統(tǒng)，以便在發(fā)酵罐滅菌后或發(fā)酵過程中單獨進行滅菌。死角是引起發(fā)酵染菌的一個重要因素，以下部位容易存在死角：管路連接焊縫、罐體內(nèi)壁、攪拌槳、溫度計和pH值探頭插座焊縫、罐底積垢、靠罐一閥和法蘭連接、壓力表焊縫等［7］。根據(jù)實際生產(chǎn)需要，單個罐體內(nèi)壁應做拋光鏡面處理，管道焊縫光滑，轉(zhuǎn)彎處應保持一定的弧度，法蘭最好硬接觸密封，定期清除罐內(nèi)的積垢，防止罐底污垢積聚形成死角，溫度計、pH值探頭插座焊接要光滑，不得存在死角。

3.4規(guī)范培養(yǎng)基滅菌流程

培養(yǎng)基滅菌操作不當容易導致滅菌不徹底。在滅菌之前配料過程中應當將結(jié)塊無機鹽、葡萄糖、蛋白胨等原料充分溶解，去除不溶性異物顆粒，添加消泡劑以防泡沫污染雜菌。滅菌開始時，使用夾套預熱，將罐內(nèi)冷空氣及低溫的二次蒸汽排除干凈。當罐溫達到90℃，三路蒸汽同時進入，合理調(diào)整各路的進汽閥，確保各路進汽口的蒸汽有足夠的壓力，滅菌溫度控制在（121±1）℃，保持25min以上的滅菌時間，充分滅菌。滅菌結(jié)束后，立即關(guān)閉所有閥門，及時通入無菌空氣保壓，防止因罐內(nèi)蒸汽冷凝形成負壓而吸氣染菌。

3.5加強車間環(huán)境管理

發(fā)酵生產(chǎn)區(qū)最好有單獨的區(qū)域同其他生產(chǎn)區(qū)隔離；保持發(fā)酵區(qū)的環(huán)境衛(wèi)生，每次接種前30min關(guān)閉車間門窗，用消毒液噴霧消毒；環(huán)境定期用8～10mL/m3甲醛和4～5 g/m3高錳酸鉀熏蒸消毒［8］。

4　透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌后補救措施

4.1茄形瓶固體斜面染菌

如發(fā)現(xiàn)斜面菌種已染菌，則將此批斜面菌種處理掉，重新選用保藏優(yōu)良菌種進行劃線接種。種子罐以及過濾器通氣保壓，待新接種固體斜面菌種具備接種條件后再進行接種。

4.2種子罐染菌

種子罐中如確認發(fā)生染菌，無論發(fā)生在培養(yǎng)前期還是后期，應立即實罐滅菌后排放。否則極易導致發(fā)酵罐倒罐，造成更大的損失。染菌后的罐體用甲醛等化學物質(zhì)處理，再用蒸汽對附屬設(shè)備進行滅菌。再次投料之前，認真分析原因，徹底清洗罐體以及附件，同時進行嚴密程度檢查，以防滲漏雜菌，造成連續(xù)污染。

4.3發(fā)酵罐染菌

4.3.1發(fā)酵前期染菌

發(fā)酵前期要做到勤取樣、多觀察，如發(fā)現(xiàn)染菌，應將通氣量調(diào)至0.1m3/h以下或停止通氣，使pH自行下降至6.0以下，經(jīng)上述處理1～3 h后觀察菌種以及雜菌生長情況，如雜菌生長受到抑制，生產(chǎn)菌株成為優(yōu)勢菌，將pH重新調(diào)回7.0，逐漸增大通氣量，待黏度達到一定程度之后，可完全調(diào)回通氣量；反之，如經(jīng)處理后雜菌生長未能受到抑制，而生產(chǎn)菌株也未能成為優(yōu)勢菌，應立即實罐滅菌，滅菌后操作步驟參照種子罐滅菌后操作步驟進行。此外，由于透明質(zhì)酸發(fā)酵培養(yǎng)基是高糖培養(yǎng)基，葡萄糖和其他原料是分開滅菌的，因染菌再次實罐滅菌后，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分會受到嚴重破壞，顏色類似深咖啡色，重新接入的菌種生長慢、產(chǎn)率低、質(zhì)量差，因此發(fā)酵前期如嚴重染菌應實罐滅菌后排放。

4.3.2發(fā)酵中后期染菌

發(fā)酵中后期染菌可適當調(diào)低通氣量，降低轉(zhuǎn)速，抑制雜菌生長，待殘?zhí)堑陀?0 g/L，發(fā)酵液黏度達到6 000 mPa·s以上，可提前放罐，勿等殘?zhí)撬o幾時放罐，以免雜菌裂解，給后續(xù)提取純化帶來更大困難。如發(fā)酵液粘度低于4000mPa·s，且雜菌數(shù)量較大時則應倒罐，隨后對空罐進行徹底滅菌與清理。

5　結(jié)論

以山東某生物公司2014—2015年實際生產(chǎn)情況為例（見表2），2014年該公司開始生產(chǎn)透明質(zhì)酸，由于前期經(jīng)驗少，未能對透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌進行系統(tǒng)防治，染菌率達到了5.5%。期間不斷總結(jié)經(jīng)驗教訓，2015年該公司采用文中所述的染菌防治方法，透明質(zhì)酸發(fā)酵染菌率降至1%，單罐平均產(chǎn)量提高3.2 kg，年產(chǎn)量提高超1.5 t，由此產(chǎn)生的經(jīng)濟效益超400萬元。

表2　透明質(zhì)酸發(fā)酵系統(tǒng)防治染菌前后對比表

染菌對透明質(zhì)酸發(fā)酵十分不利，防止染菌是透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)工作中的重中之重。生產(chǎn)技術(shù)人員應當高度重視，嚴格按照崗位SOP操作，把控生產(chǎn)每一環(huán)節(jié)、每一細節(jié)，做好常規(guī)檢查和防治工作，善于發(fā)現(xiàn)和總結(jié)，設(shè)法防止染菌的發(fā)生。當然隨著透明質(zhì)酸發(fā)酵生產(chǎn)實踐經(jīng)驗的累積，以及現(xiàn)代先進發(fā)酵相關(guān)設(shè)備的改進，新工藝、新技術(shù)的應用，相信透明質(zhì)酸的發(fā)酵染菌率會大大降低，發(fā)酵水平也會越來越高。

［1］凌沛學.透明質(zhì)酸［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

［2］儲炬，李友榮.現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2002.

［3］郝常明，趙建峰，黃雪菊.生物發(fā)酵染菌問題的探討［J］.醫(yī)藥工程設(shè)計，2007，28（2）：11-15.

［4］熊宗貴.發(fā)酵工藝原理［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001.

［5］SHAH M V，BADLE S S，RAMACHANDRAN K B.Hyaluronic acid production and molecular weight improvement by redirection of carbon flux towards its biosynthesis pathway［J］.Biochemical engineering journal，2013，80（22）：53-60.

［6］吳劍波.微生物制藥［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2002.

［7］劉利.L-賴氨酸發(fā)酵過程染菌的途徑和分析［J］.糧食與食品工業(yè)，2014，21（4）：66-69.

［8］黃雪菊，郝常明.阿維菌素發(fā)酵染菌問題的探討［J］.農(nóng)藥，2007，46（10）：659-662.

（責任編輯：朱小惠）

Analysis and processing of bacterial contam ination during the industrial production of hyaluronic acid

SONG Lei，MENG Guoqing
（Departmentof Life Science，Heze University，Heze 274015，China）

Bacterial-infection is one of themost serious problems in the industrial fermentation of hyaluronic acid，and also a key factor that directly affects the quality，yield and cost of hyaluronic acid.This paper proposed the detectionmethods for bacterial contamination during hyaluronic acid fermentation.The causes of bacterial contamination were also discussed in view of time，type and range.Based on the actual production experiences，the ways to prevent infection were ascertained from preparation of strain，air purification，ductwork deployment，systematic dead angle cleaning，medium disinfection and workshop conditions.Meanwhile，the adjustment measures were summarized in different infected period such as strain，seed potand yeastiness.

hyaluronic acid；fermentation；bacterial contamination；prevention and treatment

TQ920

A

1674-2214（2016）03-0161-04

2016-04-15

山東省科技計劃項目（2011GSF12114）

宋磊（1986—），男，安徽臨泉人，助教，碩士，研究方向為微生物應用技術(shù)，E-mail：hzxysl007@163.com.