L-2-氨基丁酸生物合成研究進(jìn)展

潘茍生，鄭仁朝，鄭裕國(guó)

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310014）

L-2-氨基丁酸生物合成研究進(jìn)展

潘茍生，鄭仁朝，鄭裕國(guó)

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310014）

生物法因?yàn)榫哂辛Ⅲw選擇性高、環(huán)境污染少、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，已成為合成L-2-氨基丁酸的重要方法。對(duì)近年來(lái)生物法（包括發(fā)酵法、氨基酰化酶法、氨基酸氧化酶法、酰胺酶法、腈水解酶法、轉(zhuǎn)氨酶法和氨基酸脫氫酶法）合成L-2-氨基丁酸的路線和研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，分析上述工藝中存在的問題并提出建議和對(duì)策，為實(shí)現(xiàn)L-2-氨基丁酸工業(yè)化生產(chǎn)和降低生產(chǎn)成本提供參考。

左乙拉西坦；L-2-氨基丁酸；微生物發(fā)酵；生物催化

L-2-氨基丁酸是一種非天然手性氨基酸，具有抑制人體神經(jīng)信息傳遞、加強(qiáng)葡萄糖磷酸酯酶的活性和促進(jìn)腦細(xì)胞代謝的作用。如圖1所示：L-2-氨基丁酸及其衍生物（S）-2-氨基丁酰胺、（S）-2-氨基丁醇是多個(gè)手性藥物（如抑菌抗結(jié)核藥乙胺丁醇鹽酸鹽［1-2］、新型抗癲癇藥物左乙拉西坦和布瓦西坦等）的關(guān)鍵中間體［3］，在制藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛。隨著左乙拉西坦等藥物專利到期，市場(chǎng)普及程度提高，對(duì)其關(guān)鍵中間體L-2-氨基丁酸的需求量大幅增加。因此尋找一條生產(chǎn)效率高、環(huán)境污染少的L-2-氨基丁酸合成工藝已成為研究重點(diǎn)。目前，L-2-氨基丁酸的合成方法包括化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法包括以L-蛋氨酸為原料在脫硫劑Raney Ni作用下脫去甲硫基生成L-2-氨基丁酸的路線［4］和運(yùn)用手性拆分試劑D-酒石酸等與外消旋2-氨基丁酸形成非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體進(jìn)行拆分得到L-2-氨基丁酸的路線［5］，但是化學(xué)法合成L-2-氨基丁酸反應(yīng)條件苛刻、易生成副產(chǎn)物，同時(shí)大量使用有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染。生物法合成L-2-氨基丁酸具有立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染少等特點(diǎn)，具有廣闊的工業(yè)化開發(fā)前景。

1　L-2　-氨基丁酸生物合成方法

L-2-氨基丁酸的生物合成方法包括發(fā)酵法、氨基酰化酶法、氨基酸氧化酶法、酰胺酶法、腈水解酶法、轉(zhuǎn)氨酶法和氨基酸脫氫酶法等。發(fā)酵法操作簡(jiǎn)單，但是發(fā)酵過(guò)程會(huì)產(chǎn)生與目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-2-氨基丁酸結(jié)構(gòu)類似的副產(chǎn)物丙氨酸等，后續(xù)產(chǎn)物分離提取較困難。酶法工藝具有催化效率高、副產(chǎn)物少等特點(diǎn)，主要包括動(dòng)力學(xué)拆分、動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分和不對(duì)稱合成三種。相比于動(dòng)力學(xué)拆分，其他兩種方法理論轉(zhuǎn)化可達(dá)100%。但是酶法工藝多面臨著輔酶循環(huán)再生效率和酶穩(wěn)定性低、工程放大難等問題。

1.1發(fā)酵法

大部分天然氨基酸都可以通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)得到［6］，如L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸等年產(chǎn)量超過(guò)200多萬(wàn)噸［7］，但是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)非天然氨基酸卻相對(duì)復(fù)雜。Liao等［8-9］以30 g/L葡萄糖為底物，以高產(chǎn)L-蘇氨酸的重組大腸桿菌Escherichia coli ATCC98082發(fā)酵生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，產(chǎn)物濃度達(dá)到5.5 g/L。其合成途徑如圖2所示：大腸桿菌以葡萄糖為原料，首先合成L-蘇氨酸，L-蘇氨酸在異源表達(dá)的蘇氨酸脫氨酶（脫水酶）和經(jīng)過(guò)分子改造的谷氨酸脫氫酶（GDH）雙酶催化下，合成L-2-氨基丁酸。

1.2氨基?；阜?/p>

該法以外消旋N-乙酰-DL-2-氨基丁酸為底物，使用氨基?；覆鸱种苽銵-2-氨基丁酸。例如焦慶才、奚強(qiáng)等用乙酸酐乙?；疍L-2-氨基丁酸，得到N-乙酰-DL-2-氨基丁酸，再用L-氨基?；覆鸱值玫絃-2-氨基丁酸；剩余的N-乙酰-D-2-氨基丁酸經(jīng)消旋化后，再次用于酶拆分，最終得到光學(xué)純L-2-氨基丁酸，收率71.8%，反應(yīng)過(guò)程如圖3所示［10-11］。

1.3氨基酸氧化酶法

徐紅梅等［12］以外消旋DL-2-氨基丁酸為底物，利用固定化D-氨基酸氧化酶選擇性氧化D-2-氨基丁酸，e.e.值達(dá)到99.5%。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)物收率，向體系中添加Pd-C/HCOONH4等化學(xué)還原劑能夠?qū)⒀趸摪边^(guò)程中形成的過(guò)渡態(tài)α-亞氨基酸原位轉(zhuǎn)化為DL-2-氨基丁酸，在D-氨基酸氧化酶的作用下進(jìn)一步拆分，收率可達(dá)到85%，反應(yīng)過(guò)程如圖4所示。

1.4酰胺酶法

Yasukawa等［13］利用來(lái)源于Brevundimonas diminuta TPU 5720的酰胺酶催化（S）-2-氨基丁酰胺水解生成L-2-氨基丁酸。反應(yīng)如圖5所示：2-氨基丁腈首先經(jīng)腈水合酶水合生成外消旋2-氨基丁酰胺，L-酰胺酶催化（S）-2-氨基丁酰胺水解生成L-2-氨基丁酸；剩余的（R）-2-氨基丁酰胺在外消旋酶的作用下再次形成外消旋體，進(jìn)一步拆分后得到光學(xué)純L-2-氨基丁酸，e.e.值大于99%。

1.5腈水解酶法

周海巖等［14］利用產(chǎn)腈水解酶的重組大腸桿菌立體選擇性水解外消旋2-氨基丁腈合成L-2-氨基丁酸（圖6）。在60mmol/L底物濃度下，產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)到5.43 g/L，e.e.值大于99%。

1.6轉(zhuǎn)氨酶法

以2-酮丁酸為底物通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶法合成L-2-氨基丁酸是目前報(bào)道較多的方法，由于2-酮丁酸價(jià)格較高，因此多以L-蘇氨酸為出發(fā)底物，通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶與蘇氨酸脫氨酶（也稱蘇氨酸脫水酶）耦聯(lián)合成L-2-氨基丁酸。

Fotheringham等［15-16］在大腸桿菌中分別表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌的蘇氨酸脫氨酶、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶和來(lái)源于枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶。以蘇氨酸為底物，天冬氨酸為氨基供體，建立了三酶不對(duì)稱催化合成L-2-氨基丁酸的方法（圖7）。L-蘇氨酸首先在蘇氨酸脫氨酶的作用下生成2-酮丁酸，2-酮丁酸在酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下，以L-天冬氨酸為氨基供體，生成產(chǎn)物L(fēng)-2-氨基丁酸和副產(chǎn)物草酰乙酸。草酰乙酸自發(fā)脫羧生成丙酮酸，后者在乙酰乳酸合成酶的作用下生成乙酰乳酸，乙酰乳酸進(jìn)一步自發(fā)脫羧生成3-羥基-2-丁酮，從而促使反應(yīng)朝著產(chǎn)物生成方向進(jìn)行。但該法L-2-氨基丁酸最大得率為54%，因?yàn)榉磻?yīng)中生成的丙酮酸也可以作為氨基受體，導(dǎo)致副產(chǎn)物丙氨酸的形成。由于丙氨酸與產(chǎn)物L(fēng)-2-氨基丁酸性質(zhì)相似，增加了后續(xù)產(chǎn)物分離的難度。2001年，Ager等［17］在此基礎(chǔ)上研究了提高L-2-氨基丁酸產(chǎn)物得率和產(chǎn)物分離純化的方法。在底物濃度為500 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到58.3%，純度大于92%。為了進(jìn)一步消除副產(chǎn)物丙氨酸，Zhu等［18］在三酶催化基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中耦聯(lián)丙氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶，反應(yīng)結(jié)束后，分離純化產(chǎn)物，最終L-2-氨基丁酸的純度大于99%。

Shin等［19］克隆表達(dá)來(lái)自Vibrio fluvialis JS17 的ω-轉(zhuǎn)氨酶，以50mmol/L 2-酮丁酸和70mmol/ L苯甲胺為底物，采用兩相反應(yīng)體系不對(duì)稱合成L-2-氨基丁酸，反應(yīng)5 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到96%，e.e.值大于99%，但反應(yīng)中有機(jī)溶劑的存在會(huì)影響酶的穩(wěn)定性。2012年Malik等［20］以外消旋苯乙胺為氨基供體，以L-蘇氨酸為底物，在ω-轉(zhuǎn)氨酶和蘇氨酸脫氨酶的作用下，同時(shí)拆分苯乙胺生成手性胺和不對(duì)稱合成L-2-氨基丁酸，2.5 h轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%，e.e.值大于99%。2013年P(guān)ark等［21］以異丙胺為氨基供體，L-蘇氨酸為底物（100 mmol/L），在來(lái)源于Ochrobactrum anthropic的ω-轉(zhuǎn)氨酶和蘇氨酸脫氨酶催化下，反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%，e.e.值大于99.9%。異丙胺是一種廉價(jià)的氨基供體，且轉(zhuǎn)氨反應(yīng)后形成的產(chǎn)物丙酮易揮發(fā)，促使反應(yīng)朝著L-2-氨基丁酸合成方向進(jìn)行，這種方法具有工業(yè)化潛力。

1.7氨基酸脫氫酶法

該法以2-酮丁酸為底物，在亮氨酸脫氫酶或纈氨酸脫氫酶的作用下不對(duì)稱合成L-2-氨基丁酸。氨基酸脫氫酶以NADH為輔酶，所以在催化體系中需要耦合輔酶再生體系。該反應(yīng)中的2-酮丁酸價(jià)格昂貴，一般也可以通過(guò)蘇氨酸脫氨酶催化L-蘇氨酸脫氨獲得，蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶三酶催化合成L-2-氨基丁酸的途徑如圖8所示［22-25］。1997年Galkin等［26］利用來(lái)源于Thermoactinomyces intermedius的耐熱的亮氨酸脫氫酶催化2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸，得率為88%，e.e.值大于99%，產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)到36 g/L。2014年Tao等［27］利用來(lái)自Bacillus cereus的高比酶活亮氨酸脫氫酶，通過(guò)優(yōu)化三酶催化條件，在30 L反應(yīng)體系中底物濃度達(dá)到1 mol/L，產(chǎn)物得率97.3%，e.e.值大于99%。脫氫酶法具有較好的工業(yè)化開發(fā)前景，其瓶頸在于如何實(shí)現(xiàn)輔酶的高效再生，降低生產(chǎn)成本。

2　結(jié)論

生物法合成L-2-氨基丁酸具有反應(yīng)條件溫和、過(guò)程高效和立體選擇性嚴(yán)格等優(yōu)勢(shì)，工業(yè)化應(yīng)用前景廣闊；發(fā)酵法體系復(fù)雜、分離純化難度大；而酶催化工藝又面臨酶活力低、穩(wěn)定性差、重復(fù)使用率不高等問題。因此，后續(xù)L-2-氨基丁酸生物合成工藝開發(fā)應(yīng)主要集中在以下兩個(gè)方面：一方面要篩選改造獲得高穩(wěn)定性高催化活力的轉(zhuǎn)氨酶、氨基酸脫氫酶等；另一方面優(yōu)化催化工藝，如通過(guò)使用固定化酶增加反應(yīng)批次，同時(shí)利于產(chǎn)物的分離純化。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Advance in the biosynthesis of L-2-am inobutyrate

PAN Gousheng，ZHENG Renchao，ZHENG Yuguo
（Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Biosynthesis provides an eco-friendly approach for L-2-aminobutyrate due to its high stereoselectivity and mild condition.This review summarized the biosynthetic method of L-2-aminobutyrate such as microbial fermentation，biotransformations with aminoacylase，amino acid oxidase，amidase，nitrilase，transaminase and amino acid dehydrogenase.The advances and the limitations of thesemethodswere assayed.In order to reduce cost of industrial production of L-2-aminobutyrate，suggestions and countermeasureswere also put forward for the existing problems. Keywords:levetiracetam；L-2-aminobutyrate；microbial fermentation；biocatalysis

TQ463

A

1674-2214（2016）03-0182-06

2016-04-05

潘茍生（1991—），男，江西新余人，碩士，研究方向?yàn)樯锎呋?，E-mail：pangoushengzjut@163.com.通信作者：鄭裕國(guó)教授，E-mail：zhengyg@zjut.edu.cn.