ω-3脂肪酸對于大鼠呼吸機相關(guān)性肺損傷的預防作用及機制研究

殷辰俞，嚴　潔

(1.江蘇省太倉市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科　215400；2.江蘇省無錫市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科　214000)

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ω-3脂肪酸對于大鼠呼吸機相關(guān)性肺損傷的預防作用及機制研究

殷辰俞1，嚴潔2△

(1.江蘇省太倉市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科215400；2.江蘇省無錫市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科214000)

目的研究ω-3脂肪酸對呼吸機相關(guān)性肺損傷(VILI)大鼠炎性反應的影響，探討ω-3脂肪酸對于VILI的預防作用及其機制。方法48只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分成對照組(C組)，VILI模型組(M組)，ω-3脂肪酸干預1、2、3、4組(I1組、I2組、I3組、I4組，制模前0.5 h分別靜脈注射ω-3脂肪酸60、120、180、240 mg/kg)。除C組外各組均行機械通氣，3 h后處死大鼠。取肺組織測定肺濕/干重(W/D)比值、肺組織髓過氧化物酶(MPO)水平；收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)測定總蛋白水平；取血測定白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。結(jié)果與M組比較，隨著ω-3脂肪酸用量增加，I1、I2、I3、I4組肺W/D比值下降(P<0.01)；BALF中總蛋白水平、MPO水平、血TNF-α水平逐漸降低(P<0.01)；血IL-10水平升高(P<0.05)。結(jié)論ω-3脂肪酸可通過抗炎、抗氧化應激、減少滲出等機制發(fā)揮對肺的保護作用，還可減輕VILI，其最適劑量范圍為120～180 mg/kg。

脂肪酸類，ω3；肺炎，呼吸機相關(guān)性；炎性反應；氧化應激

重癥患者由于呼吸機的應用，雖然其生命可得以維持，但易發(fā)生醫(yī)源性的肺損傷，即呼吸機相關(guān)性肺損傷(VILI)。VILI是機械通氣一種常見并發(fā)癥，可導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者出現(xiàn)較高的病死率[1]。失控的炎性反應被認為在VILI的發(fā)病過程中起重要作用[2]。因此由炎性反應介導的生物傷目前已成為VILI研究的熱點。ω-3脂肪酸被認為是具有免疫調(diào)理作用的營養(yǎng)素[3]。ω-3脂肪酸對于循環(huán)內(nèi)一些炎癥介質(zhì)的水平具有調(diào)控作用[4]。本實驗通過研究ω-3脂肪酸對呼吸機相關(guān)性肺損傷大鼠炎性反應的影響，探討ω-3脂肪酸對于VILI的預防作用及其機制，同時尋找ω-3脂肪酸對VILI發(fā)揮保護作用的最適劑量，為VILI的發(fā)病機制及藥物防治研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料ω-3魚油脂肪乳注射液購自華瑞制藥有限公司；白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自武漢博士德公司；大鼠髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理方法清潔級雄性SD大鼠48只(蘇州大學實驗動物中心)，體質(zhì)量250～300 g。按隨機數(shù)字表法將大鼠分成6組(n=8)：對照組(C組)、模型組(M組)、ω-3脂肪酸干預組(I1組、I2組、I3組、I4組)。禁食、禁水6 h。腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉2.0 mL，40 min追加0.2 mL。各組均行氣管切開插管，穩(wěn)定30 min。機械通氣前0.5 h時I1組、I2組、I3組、I4組分別于靜脈緩慢注射ω-3脂肪酸60、120、180、240 mg/kg；C組、M組給予等量生理鹽水。C組只行氣管切開，保留自主呼吸；M組、ω-3脂肪酸干預組給予機械通氣3 h，連接至小動物呼吸機(Harvard Inspira公司)，呼吸機參數(shù)：吸氧濃度(FiO2)21%，潮氣量(Vt)30 mL/kg，呼吸頻率(f)40次/分鐘，吸/呼比(I∶E)為1∶2，呼氣末正壓(PEEP)0 cm H2O。

表1　　各組大鼠參數(shù)比較±s)

a：P<0.01，與C組比較；b:P<0.05,c:P<0.01，與M組比較；d:P<0.05，與I1組比較。

1.2.2標本采集及指標檢測

1.2.2.1支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白水平測定通氣3 h后，取股動脈血4 mL，隨后放血處死大鼠。同時迅速開胸結(jié)扎右肺門，用4 ℃生理鹽水4 mL進行支氣管肺泡灌洗2次，收集BALF，離心取上清液置于-70 ℃保存。采用考馬斯亮藍染色法測定BALF中總蛋白水平，操作按照試劑盒說明進行。

1.2.2.2肺濕/干重(W/D)比值測定取右下肺稱濕重(W)，后置于70 ℃恒溫烤箱烘烤至恒重后稱干重(D)，計算肺組織W/D比值。

1.2.2.3肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定取右中肺組織，按試劑盒說明，采用分光光度計法測定MPO值。

1.2.2.4TNF-α、IL-10測定按照試劑盒說明，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血中TNF-α、IL-10值。

2　結(jié)　　果

2.1肺W/D比值變化與C組比較，M組肺W/D比值明顯升高(P<0.01)。與M組比較，I1、I2、I3、I4組肺W/D比值均有所下降(P<0.01)。與I1組相比，I2、I3、I4組肺W/D比值下降更為顯著(P<0.05)。I2、I3、I4各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖1。

2.2BALF中總蛋白水平變化與C組比較，M組BALF中總蛋白水平明顯升高(P<0.01)。與M組比較，I1、I2、I3、I4組BALF中總蛋白水平逐漸降低(P<0.01)。I1、I2、I3各組之間BALF總蛋白水平下降差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。I4組BALF中總蛋白水平雖較I3組有所下降，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖2。

2.3肺組織MPO水平變化與C組比較，M組MPO水平明顯升高(P<0.01)。與M組相比，I1、I2、I3、I4組MPO水平均有所降低(P<0.01)。與I1組比較，I2、I3、I4組MPO下降有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。I2、I3、I4各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖3。

2.4血TNF-α水平變化與C組比較，M組血TNF-α水平明顯升高(P<0.01)。與M組比較，I1、I2、I3、I4組血TNF-α水平逐漸降低(P<0.01)。與I1組相比，I2、I3、I4組血TNF-α水平降低均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。I2、I3、I4各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖4。

圖1　　肺W/D比值變化

圖2　　BALF中總蛋白水平變化

圖3　　肺組織MPO水平變化

圖4　　血TNF-α水平變化

2.5血IL-10水平變化與C組比較，M組血IL-10水平明顯升高(P<0.01)。與M組比較，I1組有所升高(P<0.05)，但I2、I3、I4組血IL-10水平升高更為顯著(P<0.01)。與I1組相比，I2、I3、I4組血IL-10水平升高有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。I2、I3、I4各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖5。

圖5　　血IL-10水平變化

3　討　　論

盡管采取了小潮氣量肺保護性通氣策略，但機械通氣仍可造成醫(yī)源性的肺損傷，即VILI。對于VILI的發(fā)病機制，近年來的研究者更傾向于生物傷學說，即各種生理損傷因素直接損傷肺泡細胞或間接激活上皮細胞、內(nèi)皮細胞及炎癥細胞的細胞信號通路，造成各種細胞因子釋放[5]。生物傷機制十分復雜，目前已成為研究的焦點。

本研究采用大Vt機械通氣復制大鼠VILI模型。實驗結(jié)果顯示，VILI模型復制成功。根據(jù)Borges等[6]應用正電子發(fā)射計算機斷層顯像(PET-CT)研究表明重力依賴區(qū)的萎陷肺泡及過度膨脹的肺組織是VILI時最早的受打擊目標，由于過度的應力刺激使肺泡周期性萎陷及復張，導致肺上皮細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞及肺泡細胞外基質(zhì)過度破壞。VILI還可使肺微血管塌陷、肺泡過度膨脹，這些均可造成呼吸膜結(jié)構(gòu)破壞、肺通透性增加，最終使大量富含蛋白的液體滲出形成肺水腫、肺泡內(nèi)透明膜[7]。本研究中大鼠經(jīng)ω-3魚油脂肪乳干預后，肺W/D比值及BALF中總蛋白水平均有所下降。這可能是由于魚油作為酶作用底物可與花生四烯酸競爭脂氧合酶及環(huán)氧合酶的結(jié)合位點，減少花生四烯酸途徑的代謝產(chǎn)物，影響細胞膜的穩(wěn)定性，維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能完整，減輕毛細血管滲漏[8]。

VILI時中性粒細胞大量游走滲出、呼吸爆發(fā)，造成脂質(zhì)過氧化加劇全身炎性反應，弱化抗氧化防御機制，加重組織損傷[9]。VILI時，MPO可催化生成過量的氧自由基，破壞了氧化/抗氧化平衡，導致了機體的氧化應激損傷。VILI可導致早期的嗜中性肺泡炎，后期則為伴隨單核/巨噬浸潤的淋巴性肺泡炎[10]。肺泡滲出液中的單核/巨噬細胞的浸潤可反映出組織損傷修復的程度，其釋放的趨化因子可誘導成纖維細胞，加重組織病理性修復[11]。本實驗顯示ω-3魚油脂肪乳可明顯下調(diào)肺組織MPO水平。這可能是由于ω-3魚油脂肪乳作為過氧化合物酶體增生物激活受體γ(PPARγ)的配體，可負性調(diào)節(jié)巨噬細胞和單核細胞活性，抑制氧化應激反應[12]。PPARγ作為一類配體活化介導的轉(zhuǎn)錄因子，當其被激活時，可對抗核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)介導的中性粒細胞活化[13]。而且ω-3魚油脂肪乳可抑制黏附分子的表達和內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶的活性，減弱局部的炎性反應損傷[14]。Nakagawa等[15]研究表明ω-3魚油中的二十二碳六烯酸(DHA)有誘導血紅素加氧酶-1(HO-1)表達的能力，進一步防止氧化應激對細胞及組織的損害。

有研究表明ARDS機械通氣患者氣壓傷的發(fā)生率為50%[16]。ARDS患者的肺順應性降低，需較高的通氣壓力才能獲得合適的氧合作用，但這也導致VILI的發(fā)病風險明顯增大。VILI導致的血漿及肺泡內(nèi)的炎癥介質(zhì)水平升高、轉(zhuǎn)錄促炎介質(zhì)的mRNA上調(diào)等均可造成過度的炎性反應[17]。因此對于VILI而言，炎癥介質(zhì)的水平就可作為肺損傷程度的標準。Wu等[18]認為由肺泡過度擴張導致的VILI，肺臟會產(chǎn)生了大量的TNF-α等炎癥介質(zhì)，且在6 h內(nèi)達到高峰，本實驗表明應用ω-3魚油脂肪酸后大鼠血TNF-a水平下降。有研究表明VILI造成的生物性肺損傷與NF-κB途徑導致炎性反應有重要關(guān)聯(lián)[19]。ω-3脂肪酸可通過恢復NF-κB抑制因子的水平，減少NF-κB途徑炎癥因子的產(chǎn)生與釋放[20]。Sabater等[21]研究表明靜脈注射富含ω-3脂肪酸的脂肪乳劑，短期內(nèi)可顯著降低花生四烯酸類細胞因子的釋放，具有免疫調(diào)節(jié)的作用。ω-3脂肪酸還可增強B1淋巴細胞的活性，促進免疫球蛋白M等免疫球蛋白的分泌，以應對可能發(fā)生的二重感染，而且對于全身炎性反應可更好的維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[22]。ω-3脂肪酸還可通過促進IL-10的釋放間接影響巨噬細胞功能，減少一些炎癥介質(zhì)及趨化因子的釋放[23]。Ferguson等[24]研究表明，ω-3脂肪酸具有相對特異的抗炎作用，且呈劑量依賴性，其甚至推薦ω-3脂肪酸用量應超過3 600 mg/d。

綜上所述，本研究表明ω-3脂肪酸可通過抗炎、抗氧化應激、減少滲出等多種途徑減輕VILI。ω-3脂肪酸對VILI大鼠的最適劑量為120～180 mg/kg，在此劑量范圍內(nèi)的ω-3脂肪酸可對肺組織發(fā)揮最大保護作用。

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Preventive effect and the mechanism of omega-3 fatty acids in rats with ventilator induced lung injury

YinChenyu1,YanJie2△

(1.ICU,TaicangFirstPeople′sHospital,Taicang,Jiangsu215400,China;2.ICU,WuxiPeople′sHospital,Wuxi,Jiangsu214000,China)

ObjectiveTo invest the influence of omega-3 fatty acids in inflammatory reaction in rats with ventilator induced lung injury (VILI) and to explore the mechanism of preventive effect of omega-3 fatty acids in VILI.MethodsForty-eight Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into control group (group C),VILI model group (group M),omega-3 fatty acids intervention group 1,2,3,4(group I1,I2,I3,I4,with intravenous injection of omega-3 fatty acids 60,120,180,240 mg/kg respectively,half an hour before models reproduced at 3 hours postdose).All rats except group C were suffered mechanical ventilation,all rats were sacrificed.The lung tissue was collected and the wet-to-dry weight ratio (W/D) and myeloperoxidase (MPO) were determined.Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected and total protein content was evaluated.Blood was collected and interleukin-10 (IL-10),tumor necrosis factor (TNF-α) were measured.ResultsCompared with group M,W/D of lung in group I1,I2,I3,I4 decreased in dose-dependence(P<0.01).The total protein in BALF,activity of MPO and content of TNF-α was gradually reduced in dose-dependence(P<0.01).The content of IL-10 was upgraded(P<0.05).ConclusionOmega-3 fatty acids could protect lung tissue and alleviate VILI through anti-inflammatory,anti-oxidative stress and the decreased of effusion.The best dose of omega-3 fatty acids is 120-180 mg/kg.

fatty acids,omega-3；pneumonia,ventilator-associated；inflammatory reaction;oxidative stress

殷辰俞(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事重癥醫(yī)學研究?！?/p>

，E-mail:yjeast@163.com。

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.008

R563；R363

A

1671-8348(2016)14-1896-04

2015-11-08

2016-01-17)