建立一種伴有腎小球和腎小管間質(zhì)損傷的大鼠慢性腎衰竭動(dòng)物模型*

林佳如，茍芳芳，李雪英，朱婷婷，樊均明,,3△

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；3.四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

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·論著·

建立一種伴有腎小球和腎小管間質(zhì)損傷的大鼠慢性腎衰竭動(dòng)物模型*

林佳如1，茍芳芳2，李雪英2，朱婷婷2，樊均明1,2,3△

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；3.四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

目的建立一種伴有腎小球和腎小管間質(zhì)損傷的慢性腎衰竭動(dòng)物模型。方法SD大鼠分為6組：正常組，阿霉素15 mg/kg組(A組)，腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(B組)，阿霉素15 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(C組)，阿霉素10 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(D組)，阿霉素5 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(E組)。進(jìn)行尾靜脈注射阿霉素和灌胃腺嘌呤，分別于14、28 d處死大鼠，并收集尿液、血液及腎臟。結(jié)果正常組和B、E組大鼠存活過14、28 d；E組24 h尿蛋白較B組和正常組明顯增加；E組大鼠血清中血尿素氮(BUN)，血肌酐(Scr)等水平明顯升高；病理切片示B、E組大鼠有不同程度的腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球減少，其病變較余組典型。結(jié)論該方法能夠成功建立伴有腎小球和腎小管間質(zhì)損傷的慢性腎衰竭動(dòng)物模型，但藥物劑量需要進(jìn)一步的研究。

腎功能衰竭，慢性；腎小球；動(dòng)物模型；腺嘌呤；阿霉素

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是各種病因引起的腎臟損害和進(jìn)行性惡化的結(jié)果，是多種慢性腎病的后期階段，表現(xiàn)為毒素潴留、代謝紊亂的癥狀?！读~刀》新近研究表明，從1990年到2013年，我國慢性腎臟疾病(CKD)的病死率大幅增加，上升了147%[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，大于18歲的成年人群中，我國CKD的患病率為10.8%[3-4]。其中，約2.0%的CKD患者會(huì)進(jìn)展至終末期腎病階段，主要通過維持性透析或腎移植來維持生命[5-7]。而CKD的動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)研究中所建立模擬人類CKD表現(xiàn)的動(dòng)物模型，廣泛用于人類CKD的病因、發(fā)病機(jī)制、防治技術(shù)和防治藥物的探索。目前CKD尚無理想的西醫(yī)理論下充分模擬自然病程的人類腎小球和腎小管損傷兼?zhèn)涞膭?dòng)物模型。建立一種理想的CRF動(dòng)物模型，對于研究CRF發(fā)生機(jī)制及探尋各種延緩和阻斷CRF進(jìn)展的新方法，具有重要意義。本研究采用阿霉素加腺嘌呤給藥的方法尋找建立接近臨床實(shí)際、使用廣泛、簡便穩(wěn)定的CRF模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350 kg，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供[批號(hào):SCXK(渝)2012-0005]。將大鼠分為6組：正常組3只，阿霉素15 mg/kg組(A組)6只，腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(B組)6只，阿霉素15 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(C組)6只，阿霉素10 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(D組)6只，阿霉素5 mg/kg+腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1組(E組)6只。動(dòng)物飼喂全價(jià)顆粒料，自由采食和飲水。

1.1.2試劑腺嘌呤購自sigma公司(產(chǎn)品編號(hào)：A8626)；阿霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：H33021980)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予A、C、D、E組共4組分別一次性尾靜脈注射不同劑量的阿霉素；給予B、C、D、E組共4組大鼠腺嘌呤灌胃；正常組大鼠給予同等體積的生理鹽水尾靜脈注射及灌胃。在連續(xù)灌胃5 d后除B組外的造模組進(jìn)行隔天灌胃。

1.2.2標(biāo)本的收集選取每組中的3只大鼠，分別于灌胃后第14、28天處死，處死前1 d將大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液測尿量。水合氯醛麻醉后，右股動(dòng)脈采血。

1.2.3檢測方法

1.2.3.1生化指標(biāo)的測定全自動(dòng)生化分析儀檢測尿蛋白、血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)、血鉀(K+)、血鈣(Ca2+)、血磷(P+)。

1.2.3.2腎常規(guī)病理檢查腎組織經(jīng)固定，包埋，切成3 μm厚石蠟切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)，光鏡下觀察腎小球、腎小管間質(zhì)病理形態(tài)學(xué)改變。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠一般存活狀態(tài)、死亡時(shí)間及病死率比較第1周內(nèi)A、C、D組的老鼠全部死亡。E組大鼠死亡1只。在這1周期間，A、C、D組大鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉，食量下降且活動(dòng)減少，喜蜷縮，足、腹、睪丸出現(xiàn)不同程度的水腫，以睪丸水腫最為明顯，毛發(fā)凌亂，無光澤，且這3組大鼠均有不同程度的便血，尾巴、四肢及耳朵蒼白，尿量減少。其他組大鼠也出現(xiàn)了不同程度的不良反應(yīng)，但均無上述3組明顯。正常組被毛光亮，活潑好動(dòng)，雙目有神，飲食正常，二便正常，無消瘦及腹脹大等癥狀。第2周內(nèi)E組死亡2只，并處死正常組大鼠2只，B組2只，E組1只。B組及E組大鼠出現(xiàn)食量下降且活動(dòng)減少，喜蜷縮，足、腹、睪丸出現(xiàn)輕度的水腫，毛發(fā)凌亂，無光澤，尾巴、四肢及耳朵蒼白，體質(zhì)量下降。第3～4周期間B組2只大鼠死亡。存活的大鼠的癥狀較前2周嚴(yán)重，其中E組怕冷，喜蜷縮更嚴(yán)重。B組和E組大鼠的病死率均為90%，其余造模組由于劑量過大均全部死亡。

2.2大鼠體質(zhì)量的變化情況及腎臟形態(tài)改變各造模組均有不同程度的體質(zhì)量下降，因造模過程中大鼠死亡，僅對最終存活大鼠做統(tǒng)計(jì)分析。2周后各造模組大鼠體質(zhì)量均明顯下降，見表1。正常組腎臟呈蠶豆樣，大小正常，形態(tài)規(guī)整，顏色為紅褐色，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，體積正常無腫大，有光澤；切面皮質(zhì)呈正常紅褐色，髓質(zhì)顏色淺紅，皮髓質(zhì)分界清楚；組織學(xué)未見明顯病理改變。E組及B組肉眼觀大鼠腎體積明顯增大，整個(gè)腎臟呈灰白色；切面皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)分界不清楚。

表1　　大鼠灌胃前后體質(zhì)量的變化±s，kg)

a：P<0.05，與灌胃前比較。

A：正常組腎臟病理；C、E：B組腎臟病理；B、D：E組腎臟病理。A～C：造模后2周腎臟病理；D～E：造模后4周腎臟病理。

圖1腎臟組織病理變化(×10)

2.3大鼠24 h尿蛋白正常組在造模后2、3、4周24 h尿蛋白分別為(11.16±1.47)mg/24 h、(13.5±0.71)mg/24 h、(19.67±4.04)mg/24 h。B組在造模后2周24 h尿蛋白(17.16±3.34)mg/24 h，造模3、4周后大鼠死亡較多，但24 h蛋白尿在造模后3周達(dá)到31 mg/24 h，4周后達(dá)到69 mg/24 h。E組在造模后2周24 h尿蛋白 (12.5±1.7) mg/24 h，造模3、4周后大鼠死亡較多，但24 h蛋白尿在造模后3周達(dá)到104 mg/24 h，4周后達(dá)到241 mg/24 h。與正常組及B組的大鼠比較，E組大鼠在3周、4周末其24 h尿蛋白水平明顯增加，且隨時(shí)間延長24 h尿蛋白定量逐漸增加。

2.4大鼠血液生化指標(biāo)與正常組及B組大鼠比較，E組CRF大鼠模型已經(jīng)基本制備成功，測定CRF比較有代表性的指標(biāo)，如BUN、Scr等明顯升高，K+、Ca2+、P+代謝紊亂，見表2。

表2　　大鼠2周、4周時(shí)血液生化指標(biāo)變化

2.5大鼠腎臟病理改變鏡下各組腎組織HE染色，可以看出造模后2周，與正常組(圖1A)相比，E組(圖1B)可見局部腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)輕度纖維化，腎小球輕度縮??；B組(圖1C)可見腎小管擴(kuò)張明顯，間質(zhì)輕度纖維化，腎小球病變不明顯。造模后4周與正常組相比，E組(圖1D)大鼠腎小管擴(kuò)張，顆粒管型、蛋白管型，腎間質(zhì)纖維化，腎小球明顯縮小，相對減少，上皮細(xì)胞脫落、損傷；B組(圖1E)可見腎小管擴(kuò)張，腎小管間質(zhì)輕度纖維化。

3　討　　論

3.1CRF大鼠模型的建立現(xiàn)在CRF大鼠的造模方法主要有以下3種：(1)腺嘌呤型動(dòng)物模型。腺嘌呤是廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤類藥物。研究表明，腺嘌呤引起腎小管間質(zhì)纖維化的機(jī)制為經(jīng)消化道吸收入血，在肝內(nèi)形成極難溶于水的2,8-二羥基腺嘌呤，并在腎內(nèi)大量沉積形成結(jié)晶，阻塞、壓迫腎小管引起腎小管上皮損傷和腎間質(zhì)肉芽腫性炎癥，晚期出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化。文獻(xiàn)中模型的制備有50～300 mg/kg不同劑量給予大鼠每天連續(xù)灌胃，一般至少4周后Scr、BUN水平明顯升高，此法方法簡便，腎衰現(xiàn)象明顯，成功率相對偏高。但主要是偏向于腎小管間質(zhì)纖維化的研究。(2)阿霉素型動(dòng)物模型。阿霉素是含醌的蒽環(huán)抗生素，可在腎臟內(nèi)代謝還原為半醌型自由基。后者與氧反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng),影響糖蛋白代謝，破壞濾過膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致膜濾過屏障的選擇性變化而引起蛋白尿[8]。阿霉素的注射方式尾靜脈注射1次、2次、多次等，但大多以2次注射為主，劑量4～15 mg/kg。Arioka 等[9]用15 mg/kg誘導(dǎo)出大鼠CRF的動(dòng)物模型。王晨丹等[10]給大鼠尾靜脈分2次注射阿霉素， 第1次注射按6 mg/kg給藥， 第2次注射于1周后按4 mg/kg給藥；大鼠在第11周末可見部分腎小球出現(xiàn)局灶節(jié)段性硬化。該實(shí)驗(yàn)阿霉素建立的CRF動(dòng)物模型病理改變主要以腎小球的硬化為其特點(diǎn)，且時(shí)間較長。(3)手術(shù)誘導(dǎo)CRF模型。運(yùn)用單側(cè)腎切除等物理方法造成大量腎組織破壞，殘余腎單位的功能代償性增強(qiáng)，引起殘余腎單位的高濾過蛋白尿，導(dǎo)致腎小球硬化為主要特點(diǎn)的CRF。薛痕等[11]觀察了單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型中的腎臟病理改變，發(fā)現(xiàn)可以快速建立腎臟細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型。尚小梅等[12]和Xiao等[13]制造大鼠 5/6 腎切除CRF模型，12 周后腎臟病理檢查發(fā)現(xiàn)局灶性腎小球硬化、腎小囊擴(kuò)張、局灶性腎間質(zhì)纖維化。但是手術(shù)建立的模型病死率相對偏高，大鼠感染的危險(xiǎn)增加，且制備模型的周期更長。(4)其他類型造模方式。例如手術(shù)加藥物注射同時(shí)進(jìn)行，徐海山等[14]過單側(cè)腎切除+阿零素(4.0 mg/kg)股靜脈注射8周后可制備慢性進(jìn)展性腎病大鼠模型。但此種類型的大鼠模型病死率相對較高。

3.2創(chuàng)新性建立CRF大鼠模型縱觀國內(nèi)建立CRF大鼠的模型，以阿霉素和腺嘌呤為腎臟病研究的經(jīng)典模型，而本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地將尾靜脈注射阿霉素與腺嘌呤灌胃結(jié)合起來，擬建立一種更加理想的CRF動(dòng)物模型，即是腎小管間質(zhì)纖維化，腎小球硬化的動(dòng)物模型。而在本實(shí)驗(yàn)中由于阿霉素對心臟、肝臟、骨髓等系統(tǒng)具有較強(qiáng)的毒性，而阿霉素是使用的一次性注射，且最大劑量為15 mg/kg，故單次大劑量注射是使本次造模病死率高的原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠的臨床表現(xiàn)較單獨(dú)注射阿霉素或灌胃腺嘌呤更加典型。24 h尿蛋白定量顯示混合藥物組較單獨(dú)使用腺嘌呤或阿霉素腎小球的損害更加嚴(yán)重，E組給藥后第3周尿蛋白大于100 mg/24 h；混合藥物組生化指標(biāo)對腎臟的損害更加嚴(yán)重，并有明顯的高膽固醇血癥及電解質(zhì)代謝紊亂；病理切片方面隨著時(shí)間的增長混合使用藥物的大鼠病變較單獨(dú)注射阿霉素或灌胃腺嘌呤更加典型，并符合CRF的病理改變，且模型大鼠普遍有不同程度的水腫,更接近臨床實(shí)際。

以上研究結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行У亟⒛I小管間質(zhì)纖維化伴有微小病變病理類型及大量蛋白尿的大鼠動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中因?yàn)锳、C、D組SD大鼠死亡較多，存活例數(shù)較少故按照統(tǒng)計(jì)學(xué)原則只能列出數(shù)據(jù)反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能進(jìn)一步做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。而大劑量的阿霉素不能制備此種動(dòng)物模型，應(yīng)該將阿霉素的劑量控制在5 mg/kg左右，在小劑量范圍內(nèi)探索兩種藥物建立CRF大鼠動(dòng)物模型，也可考慮2次尾靜脈注射來改良此方法。此外，阿霉素作用于大鼠的時(shí)間偏短，因此早期腎小球的病理改變主要以微小病變型病理改變?yōu)橹?，需要進(jìn)一步做電鏡觀察其病理改變。

綜上所述，本研究采用阿霉素尾靜脈注射加上腺嘌呤灌胃建立CRF的大鼠動(dòng)物模型基本成功，模型中出現(xiàn)了典型的病理改變、大量蛋白尿，以及各項(xiàng)生化指標(biāo)的異常。但是大鼠死亡較多，且病理切片中腎小球硬化不明顯，可能是阿霉素的劑量及注射方式有待調(diào)整，相應(yīng)的數(shù)據(jù)還有待完善。但是可以初步得出結(jié)論：采用阿霉素尾靜脈注射加上腺嘌呤灌胃建立CRF的大鼠動(dòng)物模型，進(jìn)行多層次地分組注射不同劑量阿霉素，大劑量阿霉素大鼠病死率較高，還需進(jìn)行小范圍劑量的探索研究，探究更準(zhǔn)確的適用于CRF的大鼠動(dòng)物模型。

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Investigation of a novel rat chronic renal failure model with glomerular and tubulointerstitial injury*

LinJiaru1,GouFangfang2,LiXueying2,ZhuTingting2,FanJunming1,2,3△

(1.DepartmentofInternalMedicine,ChengduUniversityofT.C.M,Chengdu,Sichuan610075,China；2.UrologyDepartment,SouthwestMedicalUniversity，Luzhou,Sichuan646000,China；3.LaboratoryofPsychiatry，StateKeyLaboratoryofBiotherapy，SichuanUniversity，Chengdu，Sichuan610041，China)

ObjectiveTo investigate the parameters of the chronic renal failure model with interstitial fibrosis and glomerulosclerosis.MethodsThe rats were divided into six groups,which were normal group,adriamycin group(15 mg/kg adriamycin，Group A),adenine group (200 mg·kg-1·d-1adenine，Group B),high-level adriamycin plus adenine group(15 mg/kg adriamycin+200 mg·kg-1·d-1adenine,Group C),medium-level adriamycin plus adenine group(10 mg/kg adriamycin+200 mg·kg-1·d-1adenine,Group D),and low-level adriamycin plus adenine group(5mg/kg adriamycin+200 mg·kg-1·d-1adenine,Group E).All the rats were underwent the injection of adriamycin via caudal vein and given adenine by gavage.The animals were harvested at 14th,28th,the urine,serum and tissue samples were collected.ResultsOnly the rats of normal group,group B,group E survived at 14th,28th day;the 24 h protein urine of group E were statistically higher than those in normal group and group B;the BUN,SCr in group E rats were statistically increased;the pathological changes such as interstitial fibrosis,glomerulosclerosis in group E and group B were more obvious compared to other groups.ConclusionThis method could establish a successful chronic renal failure with glomerular and tubulointerstitial injury,however,the optimal dosage still need to be investigated.

kidney failure,chronic；kidney glomerulus；animal model;adenine;adriamycin

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.004

四川省科技廳中西醫(yī)結(jié)合腎臟病防治四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)(2011JTD0014)；瀘州市科技基金資助項(xiàng)目(瀘市科2010-128號(hào))。作者簡介：林佳如(1988-)，住院醫(yī)師，在讀博士，主要從事腎內(nèi)科相關(guān)研究?！?/p>

，E-mail:junmingfan@163.com。

R332

A

1671-8348(2016)14-1882-04

2015-11-08

2015-12-27)