假酸漿多糖的酶法提取及純化工藝的研究

齊欣欣，王　遂

（哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱150025）

假酸漿多糖的酶法提取及純化工藝的研究

齊欣欣，王遂

（哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱150025）

采用正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)，以多糖的提取率作為評價(jià)指標(biāo)，用木瓜蛋白酶法從假酸漿籽中提取假酸漿多糖.確定了木瓜蛋白酶的最佳提取工藝為：酶用量3%，pH=7.5溫度55℃，提取時(shí)間50 min.多糖提取率為6.02%.再將提取的粗多糖經(jīng)脫蛋白、脫色等一系列工藝進(jìn)行純化，確定了假酸漿多糖的最佳純化工藝，在此條件下測得多糖的含量為80.6%，脫蛋白率為77.33%，脫色率為70.2%.關(guān)鍵詞：假酸漿多糖；木瓜蛋白酶；提??；純化

假酸漿籽是假酸漿的種子，而假酸漿是一種中草藥，屬茄科植物.假酸漿主要產(chǎn)于云南、貴州和廣西等地，經(jīng)常生長于田邊、荒地和房屋周圍，有野生的，現(xiàn)在也有人工種植的，其整株草都可以入藥，藥效顯著，可以鎮(zhèn)靜、祛痰、清熱、解毒等，它可治療感冒、精神病、狂犬病、風(fēng)濕痛、疥癬等病癥.假酸漿也是一種食品原料，可以制作涼粉（又稱冰粉），消暑解渴、消炎利尿，是一種夏季的保健食品［1-3］.

多糖對人體具有很高的藥用價(jià)值，經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，按照多糖的來源可以分為三大類：植物、動物和微生物多糖.其中植物多糖是由許多相同或不同的單糖所組成的化合物，這些單糖又是以α-或β-糖苷鍵所組成的.自然界中幾乎所有的植物體中都含有多糖，多糖可以維持生命的種種生理機(jī)能，是一切有機(jī)體必不可少的一種成分.它具有顯著的藥用功效，如抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗炎、抗補(bǔ)體等作用，且毒副作用低，安全性強(qiáng)，近年來其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛［4-6］.用酶法［7-11］從假酸漿籽中提取多糖的工藝還鮮見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法用木瓜蛋白酶法從假酸漿籽中提取多糖，從而確定了木瓜蛋白酶的最佳提取工藝，并對粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步的純化.

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1主要原料

假酸漿籽（宿州市禾豐農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司）.

1.1.2試劑

苯酚、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇、氫氧化鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、無水乙醇、磷酸、酪氨酸、鹽酸、碳酸鈉、福林一酚、三氯乙酸、干酪素、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、木瓜蛋白酶、葡萄糖.

1.1.3實(shí)驗(yàn)主要儀器與設(shè)備

DHG-9925A型電熱恒溫干燥箱（上海西箭儀器有限公司）、R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）、HC-2064型離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、752型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、SHB-B88型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城儀器有限公司）、SHA -C型水浴恒溫振蕩器（上海醫(yī)療器械五廠）、FW -100型高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）、電子天平（上海奔普科學(xué)儀器有限公司）.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取假酸漿多糖的工藝流程

木瓜蛋白酶法提取多糖→濃縮提取液→乙醇沉淀→干燥→假酸漿粗多糖→蒸餾水溶解→木瓜蛋白酶法和Sevag法除蛋白→大孔樹脂脫色→干燥→假酸漿精多糖→蒸餾水溶解→DEAE-纖維素柱層析→濃縮→干燥→假酸漿多糖純品.

1.2.2采用木瓜蛋白酶法提取多糖

1）對木瓜蛋白酶進(jìn)行酶活測定

①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別以酪氨酸質(zhì)量濃度、吸光度為橫縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

②樣品的測定

準(zhǔn)確稱取1 g酶粉用緩沖溶液浸泡，再取濾液稀釋，分別取1 mL濾液于四支試管，一管作對照，其余三管加入一定質(zhì)量濃度酪蛋白，水浴后向?yàn)V液中再加入福林一酚和碳酸鈉溶液顯色，于680 nm下測A680.

根據(jù)酶活計(jì)算公式：（A-A0）×K×V×N/（t× W），測得木瓜蛋白酶活力為14 927 u/g.

2）單因素試驗(yàn)

①酶濃度對假酸漿多糖提取率的影響

圖1　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取1 g假酸漿籽粉末，加入一定量的pH=4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的木瓜蛋白酶，在50℃水浴中震蕩80 min后抽濾，取濾液測量并計(jì)算出多糖提取率，確定最適酶濃度.

②反應(yīng)pH值對假酸漿多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g假酸漿籽粉末，分別加入一定量的pH值為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，再加入3%的木瓜蛋白酶，在50℃水浴中震蕩80 min后抽濾，取濾液測量并計(jì)算出多糖提取率，確定反應(yīng)的最適pH值.

③反應(yīng)溫度對假酸漿多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g假酸漿籽粉末，加入一定量的pH值為6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，加入3%的木瓜蛋白酶，分別在25、35、45、55、65℃水浴震蕩80 min后抽濾，再取濾液測量并計(jì)算出多糖提取率，確定反應(yīng)的最適提取溫度.

④反應(yīng)時(shí)間對假酸漿多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g假酸漿籽粉末，加入一定量的pH值為6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，加入3%的木瓜蛋白酶，分別在55℃水浴中震蕩20、50、80、110、140 min后抽濾，再取濾液測量并計(jì)算出多糖提取率，然后確定反應(yīng)的最適提取時(shí)間.

3）正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，考察木瓜蛋白酶濃度（A）、pH值（B）、反應(yīng)溫度（C）和反應(yīng)時(shí)間（D）四個(gè)因素之間的影響，最終確定了木瓜蛋白酶的最佳提取工藝參數(shù)（見表1）.

表1　木瓜蛋白酶提取法正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3總糖含量的測定

采用苯酚硫酸法［12］測定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，分別以葡萄糖質(zhì)量濃度、吸光度為橫縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示.

1.2.4還原糖含量的測定

采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，分別以葡萄糖質(zhì)量濃度、吸光度為橫縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示.

1.2.5多糖含量及提取率的測定

多糖的質(zhì)量=總糖質(zhì)量-還原糖質(zhì)量

多糖的含量（%）=（多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量）×100%

多糖的提質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=（多糖質(zhì)量/子實(shí)體干重）×100%

圖2　總糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　還原糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.6蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

采用考馬斯亮藍(lán)-G250法［13］測定，以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別以酪氨酸質(zhì)量濃度、吸光度為橫縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示.

圖4　蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.7脫蛋白方法［14-17］

采用木瓜蛋白酶法和Sevag法聯(lián)用：按酶法的最佳提取工藝與Sevag法聯(lián)用對假酸漿粗多糖進(jìn)行脫蛋白，最后確定蛋白的去除率和多糖的保留率.

1.2.8脫色方法［18-19］

采用AB-8型大孔吸附樹脂脫色法

單因素試驗(yàn)

1）大孔樹脂的用量對多糖脫色的影響

配制一定濃度的多糖溶液，向其中加入AB-8型大孔樹脂，樹脂與其質(zhì)量體積比依次為1%、2%、3%、4%、5%，30℃水浴中保溫4 h后離心，然后取上清液測定吸光度，再計(jì)算出脫色率及多糖保留率.重復(fù)3次，取平均值.［20］

2）反應(yīng)的溫度對多糖脫色的影響

在多糖溶液中加入質(zhì)量體積比4%的AB-8型大孔樹脂，分別在20、30、40、50、60℃溫度下脫色4h后離心，然后取上清液測定吸光度，再計(jì)算出脫色率及多糖保留率.重復(fù)3次，取平均值［21］.

3）反應(yīng)的時(shí)間對多糖脫色的影響

多糖溶液中加入質(zhì)量體積比4%的AB-8型大孔樹脂，在30℃下，分別脫色0.5、1.0、1.5、2. 0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后離心，然后取上清液測定吸光度，再計(jì)算出多糖脫色率及多糖保留率.重復(fù)3次，取平均值.

4）正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察樹脂用量A、脫色溫度B和脫色時(shí)間C三個(gè)因素之間的影響，以脫色率為考察指標(biāo)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2.

表2　正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.9多糖的分級

DEAE-纖維素柱層析：將脫蛋白、脫色后的假酸漿粗多糖溶液醇沉后，再配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多糖溶液上DEAE-52（OH型）纖維素柱，分別用0 ～0.8 mol/LNaCl進(jìn)行洗脫，流速0.6 mL/min，以每管5 mL分部收集，苯酚硫酸法顯色.檢測出糖峰，然后合并單一含糖峰位.

2　結(jié)果與分析

2.1木瓜蛋白酶提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，四種考察因素對假酸漿多糖的提取量影響的順序?yàn)椋篊＞D＞A＞B，由正交試驗(yàn)結(jié)果確定的主要影響參數(shù)為A3B3C1D2，也就是最佳提取條件為：酶用量為3%，pH值為7.5，提取溫度為55℃，提取時(shí)間為50 min.在最佳提取條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測得多糖提取率為6.02%.

表3　木瓜蛋白酶提取法正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.2木瓜蛋白酶法和Sevag法聯(lián)用進(jìn)行脫蛋白的結(jié)果與分析

由圖5可知，隨著Sevag的使用次數(shù)增加脫蛋白率遞增，而多糖保留率下降，最佳的方法是酶法最佳工藝和Sevag使用兩次聯(lián)合，此時(shí)脫蛋白率為77.33%，多糖保留率為69.52%.

圖5　假酸漿多糖的酶-Sevag聯(lián)合法脫蛋白

2.3AB-8型大孔吸附樹脂法進(jìn)行脫色的正交試驗(yàn)結(jié)果

由上表4可知，各種因素對假酸漿多糖脫色的影響程度為：脫色溫度＞樹脂用量＞脫色時(shí)間，即最佳試驗(yàn)條件為：A1B3C3.此時(shí)測得的脫色率為70.2%.

表4　AB-8型大孔樹脂法正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

2.4DEAE-纖維素柱層析結(jié)果及分析

由圖6可知，用洗脫劑洗脫假酸漿多糖可得到五個(gè)級分，分別記作PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ、PⅤ.其中PⅣ含量最少，幾乎可以忽略不計(jì)，PⅡ和PⅢ含量較多，為假酸漿多糖的主要組成部分.

圖6　假酸漿多糖的DEAE-纖維素柱層析

3　結(jié)語

在假酸漿多糖的提取中，采用正交實(shí)驗(yàn)法確定了木瓜蛋白酶的最佳提取工藝：酶用量3%、pH值為7.5、提取溫度55℃、提取時(shí)間為50 min，假酸漿多糖的提取率為6.02%.另外，酶法是去除蛋白高效且較溫和的方法，對保持多糖的活性比較有利，只是在酶解時(shí)產(chǎn)生的多肽會游離于水中，降低脫蛋白率；而將酶法與Sevag法聯(lián)用時(shí)，黏附在多糖上的蛋白質(zhì)可以被酶水解游離出來，接著用Sevag法使蛋白質(zhì)沉淀出來，從而達(dá)到脫蛋白的目的.本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶法與Sevag法聯(lián)用的脫蛋白效率達(dá)到77.33%，采用AB-8型大孔樹脂法使多糖脫色率達(dá)到70.2%.經(jīng)過脫蛋白、脫色等工藝假酸漿多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80.6%.

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Extraction of seeds of nicandra physaloides by enzymatic method and its purification

QIXin-xin，WANG Sui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Normal University，Harbin 150025，China）

Nicandra polysaccharide was extracted from the seed of nicandra physaloides by papain method.Using the orthogonal design，the optimalmethod was confirmed，which was as follows：the enzymatic concentration was 3%，the extraction pH was 7.5，the extraction temperature was 55℃，and the extraction time was 50 min.The extraction rate of polysaccharide was 6.02%.Then the treatments of deproteinization，decolorization and so on were carried out for purifying to confirm the optimal purification process of polysaccharide.Under these conditions，the content of polysaccharide reached to 80.6%，the protein removal rate reached to 77.33%，and the decolorization rate reached to 70.2%.

nicandra physaloides；papain；extraction；purification

TQ281

A

1672-0946（2016）02-0220-05

2015-08-10.

齊欣欣（1990-），女，碩士，研究方向：食品分析.