綠咖啡豆中綠原酸的分離純化

張由明，章銀軍，沈雪亮

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

綠咖啡豆中綠原酸的分離純化

張由明，章銀軍，沈雪亮

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

對未烘焙綠咖啡豆中綠原酸的分離純化進行深入研究。采用熱水重復(fù)分批浸提法，在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計響應(yīng)面分析法，獲得了綠咖啡豆中綠原酸的最佳提取條件：溫度79.8℃，溶劑pH值2.8，料液比1∶6，提取時間3.0 h，綠原酸的最大提取得率為92.0%。比較了多種不同規(guī)格的樹脂對綠原酸的分離純化效果，最終選用XDA-8大孔樹脂，在優(yōu)化后的最適工藝條件下，綠原酸含量可達70.9%，回收率達85.4%。進一步采用高效液相制備色譜獲得了高純度（95.2%）的綠原酸。所建立的綠原酸制備工藝操作簡便、高效環(huán)保，產(chǎn)品功效明確，具有良好的市場應(yīng)用前景。

綠原酸；綠咖啡豆；提取；純化；樹脂

綠咖啡豆是茜草科植物咖啡樹的種子，含有豐富的活性物質(zhì)［1］，其中綠原酸及其同系物是咖啡豆主要的多酚類活性成分，在新鮮咖啡豆中含量占2%～8%［2］。綠原酸是植物體有氧呼吸代謝的產(chǎn)物［3］，具有多種生物活性，如心血管保護作用、抗氧化作用、抗誘變及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫調(diào)節(jié)作用等［4-7］，在醫(yī)藥、化工和食品等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。美國科學(xué)家最新研究認(rèn)為，綠咖啡豆提取物具有良好的減肥、降血壓功能［8-9］，目前以綠咖啡豆提取物為主要成分的多種保健品已大量推向市場。

目前文獻中用于提取綠原酸的底物主要有金銀花［10-12］和杜仲葉［13-15］，而少有從綠咖啡豆中提取綠原酸并進行應(yīng)用性試驗的報道。通過前期對比實驗發(fā)現(xiàn)：采用醇提取工藝需要消耗大量的乙醇；酶法提取常常由于受到提取溫度和pH值的限制，使綠原酸得率偏低；而水提法既克服了消耗乙醇產(chǎn)生的成本問題，又可以通過調(diào)節(jié)溫度和溶劑pH值來提高綠原酸得率。所以實驗是以綠咖啡豆中綠原酸為研究對象，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化水提工藝條件，進一步采用大孔樹脂和高效液相制備色譜分離、純化綠原酸［16-18］，旨在建立一條操作簡單、得率較高、綠色環(huán)保的綠原酸提取分離純化工藝流程，為綠咖啡豆中綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

綠咖啡豆（Coffee arabica）：未經(jīng)烘焙，由浙江天草生物科技有限公司提供。

大孔樹脂：型號分別為D101、XDA-8、LSA-10、LSA-21、HZ-806、HZ-816、HZ-818、AB-8、HPD-850、D4020、NKA-9、DM-130。

1.2方法

1.2.1綠原酸提取工藝

按照下述工藝流程，提取次數(shù)為3次，每次2 h，料液比1∶8（W/V），溫度80℃，pH值為3，分別考察溫度（65、70、75、80、85、90℃）、溶劑pH值（2、3、4、5、6、7）、料液比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）、提取時間（1、2、3、4、5 h）等因素對綠原酸得率的影響。

工藝流程：磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液提取→過濾→合并提取液→稱量體積→液相檢測含量

1.2.2響應(yīng)面法試驗設(shè)計

利用響應(yīng)面法，采用Box-Benhnken模型，對提取條件進行優(yōu)化。以提取得率作為響應(yīng)值，設(shè)計因素及水平見表1。

表1　響應(yīng)面設(shè)計因素及水平

1.2.3綠咖啡豆提取液中綠原酸的純化

1）不同樹脂對綠原酸的靜態(tài)吸附和解析性能比較：選取12種不同規(guī)格的大孔樹脂，預(yù)處理后分別準(zhǔn)確稱取1.0 g于50mL錐形瓶中，分別加入20mL已知綠原酸含量的綠咖啡豆提取液，在25℃、200 r/min的恒溫振蕩器中振蕩24 h，吸附完成后過濾，測定濾液中綠原酸的含量，計算各樹脂的吸附量和吸附率；將靜態(tài)吸附飽和的樹脂放入50 mL錐形瓶中，分別加入70%的乙醇20 mL，同上條件下振蕩24 h，待解析完全后過濾，測定濾液中綠原酸的含量，計算各樹脂的解析量和解析率。每種樹脂進行3次重復(fù)實驗，計算其平均值。

2）大孔樹脂XDA-8對綠原酸的動態(tài)吸附和解析工藝研究：準(zhǔn)確稱取10 g XDA-8大孔樹脂，經(jīng)預(yù)處理后濕法裝入16 mm×300 mm的玻璃層析柱中作為吸附柱，使用前用超純水沖洗至無醇味，動態(tài)上樣吸附，乙醇解析純化綠咖啡豆提取液中的綠原酸，對不同的工藝條件進行優(yōu)化。

1.2.4綠原酸含量測定

1）色譜條件：綠原酸含量的測定采用高效液相色譜法（HPLC）。檢測條件：ODS-C18色譜柱（Welchrom 5μm，4.6mm×250mm）；流動相A：V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=250∶750∶1；流動相B：V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=100∶900∶1；采用梯度洗脫（0～2min，保持溶液B 100%不變；2～25min，溶液B 100%～0%；25～28min，溶液B 0%不變；28～30 min，溶液B 0%～100%；30～35 min，溶液B 100%不變）；柱溫：25℃；進樣：10μL；流速：1mL/ min；檢測波長：327 nm。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品14.4 mg，用50%甲醇稀釋成28.8、57.6、86.4、115.2、144μg/mL梯度濃度標(biāo)樣，HPLC檢測，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程：y=29 570x-190 000。

3）綠原酸提取得率計算：依據(jù)HPLC色譜條件進行檢測，分別檢測綠咖啡豆原料及提取液中綠原酸的含量，按照以下公式計算綠原酸的提取得率。

1.2.5吸附量和解析量計算方法

式中：Q為吸附量（mg/g）；a為吸附率（%）；C0為起始濃度（mg/mL）；Cv為濾液濃度（mg/mL）；V1為溶液體積（mL）；W為樹脂質(zhì)量（g）（此計算方法假設(shè)吸附前后體積不變）；Q2為解析量（mg/g）；C2為解析液濃度（mg/mL）；V2為解析液體積（mL）；b為解析率（%）。

1.2.6高純度綠原酸分離純化

采用ODS-BP-L，SP-120-15柱，以乙腈和0.4%磷酸溶液按體積比12∶88混合成的溶液為流動相，控制流速為4 mL/min，進樣10 mL濃縮液制備高純度綠原酸。分段收集流出液，并液相檢測。

2　結(jié)果與討論

2.1綠原酸提取工藝研究

2.1.1單因素實驗結(jié)果

實驗比較了溫度、溶劑pH、料液比和提取時間對綠原酸提取得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1 （a）可知：由于綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，高溫加熱易氧化分解，所以隨著提取溫度的升高，綠原酸提取得率先升后降；由圖1（b）可知：隨著溶劑pH值的上升，綠原酸的提取得率先升高后降低，這是由于綠原酸本身是一種有機酸，酸性條件有利于綠原酸的提取，而酸性太強會造成綠原酸的酸解；由圖1（c）可知：隨著料液比的比值降低，綠原酸提取得率逐漸達到最大值；由圖1（d）可知：由于綠原酸結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，長時間的高溫會使一部分綠原酸分解。綜合考慮溫度、溶劑pH、料液比和提取時間對綠原酸提取得率的影響，確定進行響應(yīng)面試驗因素提取條件范圍為：提取溫度75～85℃，溶劑pH值2～4，料液比1∶4～1∶8，提取時間2～4 h。

2.1.2響應(yīng)面實驗

運用Design-Expert軟件，對綠咖啡豆中綠原酸提取得率顯著性影響進行響應(yīng)面分析，Box-Behnken設(shè)計試驗結(jié)果見表2，得到綠咖啡豆中綠原酸提取得率（Y）的多元二次回歸模型：Y= 91.76-1.55A-2.48B+0.16C+0.97D-5.67AB+2.39AC-2.41AD-0.27BC+5.10BD+1.94CD-6.06A2-6.33B2-1.37C2-4.83D2（R2=0.9212）

式中：A為提取溫度；B為溶劑pH值；C為料液比；D為提取時間；Y為綠原酸提取得率。

表2　Box-Behnken設(shè)計試驗結(jié)果

實驗結(jié)果的方差及顯著性分析（表3）的結(jié)果表明：A、B、AB、BD、A2、B2、D2因素影響顯著（p＜ 0.05），即提取溫度與pH、pH與提取時間交互作用是影響綠咖啡豆中綠原酸提取的顯著因素。

表3　回歸模型方程的方差分析

利用Box-Behnken試驗得到的回歸模型對應(yīng)的響應(yīng)面及等高線圖可以用于評價試驗因素對綠咖啡豆中綠原酸提取得率影響的兩兩交互作用以及確定各個因素的最佳水平范圍。

圖2表明：固定提取溫度，綠原酸提取得率隨著溶劑pH值的變化先增加后降低，pH過高降低了綠原酸在溶劑中的溶解度，導(dǎo)致提取綠原酸得率降低；固定提取溶劑pH，綠原酸提取得率隨著提取溫度的變化先增加后減小。圖3表明：提取時間延長有利于提高綠原酸提取得率，但由于綠原酸結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，長時間高溫提取會使部分綠原酸結(jié)構(gòu)裂解進而降低綠原酸的提取率。圖2和圖3的等高線圖均呈現(xiàn)橢圓形，說明提取溫度與pH、pH與提取時間的交互作用較強，影響顯著。

根據(jù)所建立的模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得出綠咖啡豆中綠原酸提取得率最高的參數(shù)條件為提取溫度79.8℃，溶劑pH值2.8，料液比1∶6，提取時間3.0 h，在此條件下綠原酸提取得率預(yù)測值為92.0%。為方便試驗將參數(shù)修改為：提取溫度80℃、pH 3、料液比1∶6、提取時間3 h，用于驗證實驗，實測綠原酸提取得率為91.9%，基本與預(yù)測值保持一致。

2.2綠咖啡豆提取液中綠原酸的分離純化

2.2.1不同樹脂對綠原酸的靜態(tài)吸附和解析性能比較

12種不同規(guī)格的大孔樹脂，在同等條件下，經(jīng)過24 h吸附和24 h乙醇解析，過濾后測定濾液中綠原酸的含量，每種樹脂3次重復(fù)實驗，計算各樹脂的吸附量和吸附率平均值，以及對應(yīng)樹脂解析量和解析率的平均值，結(jié)果見表4。

表4　12種大孔樹脂對綠原酸的靜態(tài)吸附和解析性能的比較分析

由表4可知：上述各種大孔樹脂對綠原酸都有一定的吸附量，其中XDA-8、AB-8等樹脂的吸附率較大，XDA-8的吸附率達85.3%，用70%乙醇對大孔吸附樹脂進行解析，XDA-8、LSA-21、D101三種樹脂的解析率均達到95%以上，其中XDA-8的解析率達95.2%，評估12種大孔樹脂吸附和解析性能，XDA-8綜合性能最佳。因此對于綠咖啡豆提取液中的綠原酸純化工藝而言，大孔樹脂XDA-8較為適宜。

2.2.2大孔樹脂XDA-8對綠原酸的動態(tài)吸附和解析工藝研究

用預(yù)處理過的10 g XDA-8樹脂，濕法裝入16 mm×300mm的玻璃層析柱作為吸附柱，使用前用超純水沖洗至無醇味，動態(tài)上樣吸附，乙醇解析純化綠咖啡豆提取液中的綠原酸，對不同的工藝條件進行優(yōu)化，選取上柱液濃度（7、8、9、10、11、12 mg/mL）、上柱流速（1、2、3、4 BV/h）、解析用乙醇濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、解析用乙醇用量（2、3、4、5、6 BV）、解析乙醇流速（1、2、3、4、5 BV/h）等進行考察，結(jié)果如圖4和圖5所示。優(yōu)化后得到最佳動態(tài)吸附和解析工藝條件為：上柱液濃度為10 mg/mL，上樣流速2 BV/h，解析用乙醇濃度為70%，解析用乙醇用量5 BV，解析乙醇流速3 BV/h。

在上述動態(tài)吸附和解析純化綠原酸的最佳工藝條件下，進行了三次重復(fù)驗證實驗，結(jié)果顯示：XDA-8大孔樹脂的吸附量平均達35.5mg/mL，解析率平均可達95.3%，產(chǎn)品含量平均可達70.9%，回收率平均可達85.4%，該工藝重復(fù)穩(wěn)定性好，產(chǎn)品純度和回收率都較高。

2.3高純度綠原酸制備

綠咖啡豆提取液通過XDA-8樹脂分離純化后，純度為70.9%，為了得到高純度綠原酸，將樹脂分離純化后的綠原酸溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用于高效液相制備色譜進樣，結(jié)果如圖6。用高效液相色譜檢測液相分段收集液，120 min處收集的綠原酸溶液純度達到95.2%。

3　結(jié)論

通過對綠咖啡豆中綠原酸提取條件的單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果分析，建立綠原酸提取得率回歸方程，結(jié)果表明提取溫度、溶劑pH值、料液化、提取時間這4個因素都對綠原酸提取得率影響顯著，R2=0.921 2，模型擬合度好。確定出的最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度79.8℃，pH 2.8，料液比1∶6，提取時間3.0 h。修改試驗參數(shù)條件下，實測綠原酸提取得率為91.9%，證明優(yōu)化得實驗條件可行。

XDA-8大孔樹脂對綠咖啡豆提取液中的綠原酸具有良好的吸附性，能較好地分離純化綠原酸，最大吸附量平均可達35.5 mg/mL。最佳動態(tài)吸附和解析工藝條件為上柱液濃度為10mg/mL，上樣流速2 BV/h，解析用乙醇濃度為70%，解析用乙醇用量5 BV，解析乙醇流速3 BV/h，經(jīng)HPLC檢測，綠原酸含量可達70.9%，回收率可達85.4%。XDA-8樹脂吸附解析后，通過液相制備色譜即可得純度為95.2%的綠原酸，冷凍干燥得高純度綠原酸晶體，確為綠原酸純品。

綜上所述，本文建立一條操作簡單、得率較高、綠色環(huán)保的綠原酸提取分離純化工藝流程。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Studies on separation and purification of chlorogenic acid from green coffee beans

ZHANG Youming，ZHANG Yinjun，SHEN Xueliang
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

The separation and purification processes of chlorogenic acid from green coffee beans were studied.On the basis of single-factor experiments，hot water extraction of chlorogenic acid was optimized by response surfacemethodology.The results showed that the chlorogenic acid yield was significantly affected by the four factors，and the optimum extraction conditions were temperature 79.8℃，solvent pH 2.8，solid/liquid ratio 1∶6 and extraction time 3.0 h.Themaximum extraction yield of chlorogenic acid was 92.0%.The experiments on screening of different resins showed that XDA-8 resin had best efficiency in chlorogenic acid separation and purification. Under the optimized conditions，chlorogenic acid content and recovery reached 70.9%and 85.4%，respectively.Preparative high performance liquid chromatography was used to obtain high purity （95.2%）of chlorogenic acid from green coffee bean extract.The established preparation process of chlorogenic acid had the advantages of simple，efficientand environmentally friendly

chlorogenic acid；green coffee beans；extraction；purification；resin

Q946.81

A

1674-2214（2016）03-0140-07

2016-04-21

張由明（1988—），男，河南開封人，碩士，主要從事天然原料提取純化及應(yīng)用方面的研究，E-mail：zyming168 @126.com.通信作者：沈雪亮副教授，E-mail：shenxl_pat@aliyun.com.