骨橋蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶9在子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜中的表達情況及孕激素對其表達的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

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·論著·

·專題研究·

骨橋蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶9在子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜中的表達情況及孕激素對其表達的影響

楊 眉，蔣春樊，哈春芳

目的探究子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)患者內(nèi)膜中骨橋蛋白(OPN)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達情況及二者的相關(guān)性,以及不同劑量孕激素對其表達的影響。方法選取2006—2015年在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院治療的符合納入標準的EMs患者105例，術(shù)前1 d行診刮術(shù)獲得在位內(nèi)膜(EMs在位內(nèi)膜組)，由卵巢囊腫剝除術(shù)或患側(cè)附件切除術(shù)切除組織獲得異位內(nèi)膜(EMs異位內(nèi)膜組)。另選取同期行輸卵管絕育手術(shù)的患者90例作為對照，絕育手術(shù)前1 d行診刮術(shù)獲取子宮內(nèi)膜(正常子宮內(nèi)膜組)。采用免疫組化法檢測3組內(nèi)膜中OPN及MMP-9表達情況，并分析EMs在位內(nèi)膜組、EMs異位內(nèi)膜組OPN與MMP-9的相關(guān)性。2013年1—3月，從105例患者中隨機選取9例患者的在位內(nèi)膜組織進行后續(xù)試驗，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測不同劑量(0、1、10、100、1 000 nmol/L)孕激素干預(yù)后在位內(nèi)膜腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平。結(jié)果免疫組化法染色結(jié)果顯示，正常子宮內(nèi)膜組在位內(nèi)膜DAB染色后腺上皮細胞呈淡黃色，OPN、MMP-9均主要表達于內(nèi)膜腺上皮細胞中；EMs在位內(nèi)膜組DAB染色后腺上皮細胞染色加深，呈棕黃色；EMs異位內(nèi)膜組腺上皮細胞染色進一步加深，呈棕黑色，OPN和MMP-9主要表達于EMs腺上皮細胞中。EMs異位內(nèi)膜組OPN、MMP-9表達情況強于EMs在位內(nèi)膜組、正常子宮內(nèi)膜組(u值分別為7.553、-6.153、-9.754、-10.240，P<0.001)；EMs在位內(nèi)膜組OPN、MMP-9表達情況強于正常子宮內(nèi)膜組(u值分別為7.164，8.816，P<0.001)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，EMs在位內(nèi)膜組、EMs異位內(nèi)膜組中OPN與MMP-9表達水平均呈正相關(guān)(rs值分別為0.657、0.745，P<0.05)。0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素分別干預(yù)EMs腺上皮細胞后，其OPN及MMP-9表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論OPN、MMP-9在EMs患者在位、異位內(nèi)膜中表達均增強，但不同劑量孕激素對EMs患者在位內(nèi)膜腺上皮細胞OPN、MMP-9表達水平影響不明顯。

子宮內(nèi)膜異位癥；骨橋蛋白質(zhì)；基質(zhì)金屬蛋白酶9；孕激素類

楊眉，蔣春樊，哈春芳.骨橋蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶9在子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜中的表達情況及孕激素對其表達的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(24)：2920-2924.[www.chinagp.net]

YANG M,JIANG C F,HA C F.Expression of osteopontin and matrix metalloproteinase 9 in the endometrium of patients with endometriosis and influence of progesterone on their expression[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2920-2924.

不同個體對子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的易感性與遺傳、激素水平及環(huán)境因素有關(guān)[1]，但其具體分子機制尚不明確。骨橋蛋白(OPN)是一種結(jié)合糖蛋白型的整聯(lián)蛋白，其首先在骨基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，而后又發(fā)現(xiàn)其與腫瘤細胞的黏附、抗凋亡及轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究顯示，OPN能夠活化PI 3-K/AKt通路，與avβ3整合素結(jié)合，通過一系列分子相互作用，上調(diào)尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)，從而活化MMP-9，降解細胞外基質(zhì)，進而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[3]。OPN在月經(jīng)周期中晚分泌期的表達水平較高，而在增生期和早分泌期表達水平相對較低[4]。MMP-9則在月經(jīng)周期晚分泌期的表達水平較高[5]。EMs患者子宮內(nèi)膜組織中OPN及其mRNA表達水平及血液中分泌型糖蛋白形式的OPN均較正常人升高[6]。有研究顯示，EMs患者子宮內(nèi)膜組織中MMP-9的表達水平相對較高[7]。OPN及MMP-9的表達水平隨月經(jīng)周期變化,且均在EMs患者子宮內(nèi)膜組織中高表達，從而推論兩者之間可能存在關(guān)聯(lián)，其表達水平可能受雌、孕激素調(diào)節(jié)。本課題組前期已研究了雌激素對OPN及MMP-9表達水平的影響[8]，本研究進一步分析了孕激素對OPN及MMP-9的表達水平的影響，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1納入與排除標準納入標準：(1)Ⅳ期EMs患者(依據(jù)美國生育協(xié)會1985年“修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法”[9])；(2)處于月經(jīng)分泌期；(3)因卵巢巧克力囊腫行卵巢囊腫剝除術(shù)或患側(cè)附件切除術(shù)。排除標準：(1)合并重大內(nèi)科疾??；(2)術(shù)前6個月曾接受激素治療者。

1.2組織來源選取2006—2015年在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院住院治療的符合納入標準的EMs患者105例，術(shù)前1 d行診刮術(shù)(術(shù)前診刮術(shù)是為行內(nèi)膜活檢、排除內(nèi)膜病變決定手術(shù)范圍)獲得在位內(nèi)膜(EMs在位內(nèi)膜組)，由卵巢囊腫剝除術(shù)或患側(cè)附件切除術(shù)切除組織獲得異位內(nèi)膜(EMs異位內(nèi)膜組)。樣本組織經(jīng)兩位病理學(xué)主任醫(yī)師進行HE染色切片復(fù)驗，均再次確診為EMs。另選取同期行輸卵管絕育手術(shù)的患者90例作為正常子宮內(nèi)膜組，均處于月經(jīng)分泌期，術(shù)中排除合并EMs者，絕育手術(shù)前1 d行診刮術(shù)獲取子宮內(nèi)膜。

1.3免疫組化法獲取樣本組織后立即置入4%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片4 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫去二甲苯，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓熱修復(fù)抗原后山羊血清封閉。小鼠抗人OPN及MMP-9單克隆抗體(美國Abcam公司，均為1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜。采用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司兩步法廣譜羊抗小鼠二抗試劑盒(PV-9000，含A液和B液)放大信號，A液和B液分別孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(顯色時間根據(jù)顯微鏡下觀察所見進行調(diào)控，待陽性信號明顯而背景信號未顯現(xiàn)時即停止顯色)；蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。

1.4OPN及MMP-9表達情況判定標準每張切片選取10個不重疊的高倍視野(×400)進行觀察，OPN、MMP-9免疫組化染色陽性的標準為細胞膜或細胞質(zhì)中有棕黃色顆粒，采用半定量積分法進行結(jié)果判定，分別對染色強度和鏡下陽性細胞表達率給予評分：(1)陽性染色強度：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕黑色為3分；(2)陽性細胞表達率：高倍視野下陽性細胞數(shù)占所有細胞數(shù)的比例即為表達率，表達率<5%為0分，表達率5%～24%為1分，表達率25%～50%為2分，表達率>50%為3分。兩者評分之和作為綜合評分：總分0分記為陰性(-)，總分1～2分記為弱陽性(+)，總分3～4分記為陽性(++)，總分5～6分記為強陽性(+++)。

1.5細胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)2013年1—3月，從105例患者中隨機選取9例患者的在位內(nèi)膜組織進行后續(xù)試驗。取出低溫保存的在位內(nèi)膜組織，采用無菌無酚紅Hanks平衡鹽溶液(HBSS)清洗3次，剪成約1 mm3大小，10 ml HBSS(3×)溶解的膠原酶Type Ⅳ在37 ℃消化10 min；500 r/min離心(離心半徑為16 cm)1 min，懸浮的上皮細胞和間質(zhì)細胞經(jīng)離心后分離，去除上清液(主要含懸浮的間質(zhì)細胞)，加入含10%胎牛血清的無酚紅的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)液(含鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 U/ml、氟康唑2 μg/ml)培養(yǎng)腺上皮細胞，分裝在多個直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中。隔日換液直至細胞達到60%融合時，吸去培養(yǎng)液，將細胞置于無胎牛血清的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)液中12 h。將不同培養(yǎng)皿中腺上皮細胞的培養(yǎng)液更換為含不同劑量(0、1、10、100、1000 nmol/L)孕激素的DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)液，并加入活性炭，進一步去除胎牛血清，培養(yǎng)24 h。1.6反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測腺上皮細胞中OPN、MMP-9 mRNA表達水平Trizol裂解細胞,采用紫外分光光度計測量其在260 nm和280 nm處的OD值,并計算RNA的純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配置：總體積20 μl，包括上一步變性處理的RNA溶液12 μl、dNTP混合物 (各10 mM)2 μl、RNA酶抑制劑(10 U/μl)1 μl、5×RT Buffer 4 μl、ReverTra Ace 1 μl。反轉(zhuǎn)錄后進行PCR，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，OPN上游引物為5′-ACAGCCGTGGGAAGGACAGTTA-3′，下游引物為5′-CCTGACTATCAATCACATCGGAATG-3′；MMP-9上游引物為5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，下游引物為5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3；β-actin上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。 擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共循環(huán)40次。結(jié)束前72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。采用2-ΔΔCt法計算OPN、MMP-9 mRNA表達水平。

2　結(jié)果

2.1免疫組化染色結(jié)果正常子宮內(nèi)膜組DAB染色后腺上皮細胞呈淡黃色，OPN、MMP-9均主要表達于內(nèi)膜腺上皮細胞中。EMs在位內(nèi)膜組DAB染色后腺上皮細胞染色加深，呈棕黃色；EMs異位內(nèi)膜組腺上皮細胞染色進一步加深，呈棕黑色，OPN和MMP-9主要表達于EMs腺上皮細胞中(見圖1，本文圖1彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.2OPN、MMP-9在EMs異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜組中表達情況正常子宮內(nèi)膜組、EMs在位內(nèi)膜組、EMs異位內(nèi)膜組OPN、MMP-9表達情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；EMs異位內(nèi)膜組OPN、MMP-9表達情況強于EMs在位內(nèi)膜組、正常子宮內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(u值分別為7.553、-6.153、-9.754、-10.240，P<0.001)；EMs在位內(nèi)膜組OPN、MMP-9表達情況強于正常子宮內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(u值分別為7.164、8.816，P<0.001，見表1)。

2.3EMs在位內(nèi)膜組、EMs異位內(nèi)膜組OPN與MMP-9的相關(guān)性分析Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，EMs在位內(nèi)膜組、EMs異位內(nèi)膜組OPN與MMP-9表達水平均呈正相關(guān)(rs值分別為0.657、0.745，P值分別為0.013、0.018)。

2.4不同劑量孕激素干預(yù)EMs腺上皮細胞后OPN、MMP-9 mRNA表達水平比較0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素干預(yù)EMs腺上皮細胞后，其OPN、MMP-9 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

注：A為正常子宮內(nèi)膜組，B為EMs在位內(nèi)膜組，C為EMs異位內(nèi)膜組

圖1免疫組化法染色結(jié)果

Figure 1Result of immunohistochemical staining

表13組OPN、MMP-6表達情況比較(例)

Table 1Comparsion of expression status of OPN and MMP-9 among the three groups

組別例數(shù) OPN- + +++++ MMP-9- + +++++正常子宮內(nèi)膜組9027362704527180EMs在位內(nèi)膜組10561860213216615EMs異位內(nèi)膜組105061584392469H值12.3514.28P值0.0040.003

注：EMs=子宮內(nèi)膜異位癥，OPN=骨橋蛋白，MMP-9=基質(zhì)金屬蛋白酶9

Table 2Comparsion of the expression levels of OPN and MMP-9 mRNA after intervention of different doses of progesterone in EMs glandular epithelial cells

孕激素(nmol/L)OPNmRNAMMP-9mRNA01.001.0011.05±0.180.93±0.11101.08±0.220.97±0.191001.11±0.120.92±0.2910001.03±0.330.95±0.16F值8.627.38P值0.1010.182

3　討論

EMs是一種婦科常見病，且發(fā)病機制復(fù)雜，可能與甾體激素類藥物、免疫分子、遺傳物質(zhì)、環(huán)境因素等多種生物活性因素相關(guān)[1,10]。子宮內(nèi)膜的分離、接觸、黏附、侵襲等一系列生物行為均在早期EMs的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[11]。部分相關(guān)研究顯示，與惡性腫瘤病理過程密切相關(guān)的蛋白，同樣與EMs密切相關(guān)，如OPN及MMP-9等[12-13]。為進一步闡明EMs的發(fā)病機制，本研究選取了EMs患者的在位、異位內(nèi)膜，并以正常子宮內(nèi)膜作為對照，用免疫組化法檢測內(nèi)膜中OPN及MMP-9表達情況，以明確OPN和MMP-9是否在EMs患者的內(nèi)膜中表達增強，因本課題組前期研究已明確雌激素對OPN及MMP-9表達情況的影響[8]，故本研究擬觀察孕激素對OPN及MMP-9表達情況的影響，旨在為EMs的臨床治療提供分子理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，EMs異位內(nèi)膜組OPN、MMP-9表達情況強于EMs在位內(nèi)膜組、正常子宮內(nèi)膜組，且EMs在位內(nèi)膜組OPN、MMP-9表達情況強于正常子宮內(nèi)膜組；表明OPN及MMP-9在EMs患者在位、異位內(nèi)膜中表達均強于非EMs患者。進一步分析OPN與MMP-9的關(guān)系顯示，EMs患者異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中OPN與MMP-9均呈正相關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[14]。RANGASWAMI等[15]研究結(jié)果顯示，在惡性腫瘤的發(fā)病過程中，OPN與MMP-9可促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成，MMP-9 活化有賴于 OPN的表達增強，而MMP-9的活化加速了腫瘤的擴散。OPN能通過激活細胞內(nèi)一系列分子進行信號傳導(dǎo)，最終活化MMP-9,進而溶解細胞外基質(zhì),導(dǎo)致細胞的異地黏附、侵襲與轉(zhuǎn)移[16-17]。

本研究采用不同劑量孕激素干預(yù)EMs腺上皮細胞發(fā)現(xiàn)，0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素干預(yù)EMs腺上皮細胞后，OPN及MMP-9表達水平間無差異。孕激素調(diào)控OPN的分子機制復(fù)雜，JOHNSON等[18]采用孕激素喂養(yǎng)卵巢切除后的母羊發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞上的孕激素受體上調(diào)，而腺上皮細胞中卻缺乏孕激素受體，接著用受體拮抗劑ZK137,316喂養(yǎng)已經(jīng)進食孕激素的卵巢切除后的母羊發(fā)現(xiàn)，OPN的表達水平明顯下降，推測孕激素對OPN的調(diào)控機制復(fù)雜，其中包括腺上皮細胞孕激素受體下調(diào)，而孕激素對OPN的調(diào)控需有間質(zhì)細胞來源的旁分泌生長因子參與方可發(fā)揮作用。而孕激素調(diào)控MMPs方面的研究較多，M?NCKEDIECK等[19]研究結(jié)果顯示，在人子宮內(nèi)膜中，孕激素通過上調(diào)特定的腫瘤生長因子來調(diào)控細胞間的相互作用及組織的周期性變化，其中起主要作用的是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。TGF-β受體則主要分布在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞上，但本研究采用的是原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞進行體外試驗，排除了子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，故推測孕激素對EMs的抑制作用可能需要子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的存在。

綜上所述，OPN、MMP-9在EMs患者在位、異位內(nèi)膜中表達增強，但不同劑量孕激素對EMs患者在位內(nèi)膜腺上皮細胞OPN、MMP-9表達水平影響不明顯。本研究選取子宮內(nèi)膜腺上皮細胞進行離體試驗，排除了子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，故結(jié)果存在一定局限性。而人體內(nèi)子宮內(nèi)膜腺上皮細胞與間質(zhì)細胞間是否存在復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)與作用，本課題組擬進一步探究。

作者貢獻：楊眉進行試驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；楊眉、蔣春樊進行試驗實施、評估、資料收集；哈春芳進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Expression of Osteopontin and Matrix Metalloproteinase 9 in the Endometrium of Patients With Endometriosis and Influence of Progesterone on Their Expression

YANGMei,JIANGChun-fan,HAChun-fang.

DepartmentofObstetricsandGynecology,XiangyangCentralHospital,AffiliatedHospitalofHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang441021;NingxiaMedicalUntversity,Yinchuan750004,China

HAChun-fang,DepartmentofGynecology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceoftheMinistryofEducation,Yinchuan750004,China;E-mail:hachunfang@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and correlation of osteopontin (OPN) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in the endometrium of patients with endometriosis (EMs),and the influence of different doses of progesterone on their expression.Methods105 patients with EMs,who received treatment in General Hospital of Ningxia Medical University from 2006 to 2015 and met the inclusion criteria,were selected in the study.The eutopic endometrium was got 1 d before surgery by curettage (EMs eutopic endometrium group).The ectopic endometrium was got through oophorocystectomy or tissue adnexectomy (EMs ectopic endometrium group).In addition,90 patients who had underwent sterilization operation of fallopian tube and the endometrium was got through curettage 1 d before sterilization operation (normal endometrium group).Immunohistochemistry was used to detect the expression status of OPN and MMP-9 in the endometrium among the three groups,and the correlation of OPN and MMP-9 between EMs eutopic endometrium group and EMs ectopic endometrium group were also analyzed.The eutopic endometrium of 9 patients were randomly selected from the 105 patients to carry out follow-up experiment,inverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to detect the expression levels of OPN and MMP-9 in the endometrial epithelial cells after progesterone intervention at different doses (0,1,10,100,1 000 nmol/L).ResultsImmunohistochemistry results showed that the color of endometrium epithelial cells in eutopic endometrium after DAB staining in normal endometrium group was light yellow,and OPN and MMP-9 were mainly expressed in endometrium epithelial cells.The staining of endometrium epithelial cells in EMs eutopic endometrium group darkened and presented brown.The staining of endometrium epithelial cells in EMs ectopic endometrium group darkened further and showed brownish black,and OPN and MMP-9 were mainly expressed in EMs epithelial cells.The expression levels of OPN and MMP-9 in EMs ectopic endometrium group were stronger than those in EMs eutopic endometrium group and normal endometrium group (u=7.553,-6.153,-9.754,-10.240,P<0.001);the expression levels of OPN and MMP-9 in EMs eutopic endometrium group was stronger than those in normal endometrium group (u=7.164,8.816,P<0.001).The result of Spearman correlation analysis was shown as follows:the expression levels of OPN and MMP-9 between eutopic and ectopic endometrium group were positively correlated with each other (rs=0.657,0.745,P<0.05).After intervention of progesterone at different doses of 0 nmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L,100 nmol/L,and 1 000 nmol/L,the expression levels of OPN and MMP-9 were not significantly different (P>0.05).ConclusionEnhanced expression of OPN and MMP-9 in eutopic and ectopic endmetrium of patients with EMs was presented,but different doses of progesterone has no significant influence on the expression level of OPN and MMP-9 in the eutopic endometrium epithelial cells of EMs patients.

Endometriosis；Osteopontin；Matrix metalloproteinase 9；Progestins

國家自然科學(xué)基金資助項目(81160078)

441021 湖北省襄陽市中心醫(yī)院 湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(楊眉)，病理科(蔣春樊)；寧夏醫(yī)科大學(xué)(楊眉)；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，生育力保持重點實驗室(哈春芳)

哈春芳，750004寧夏銀川市，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，生育力保持重點實驗室；E-mail：hachunfang@163.com

R 711.71

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.010

2016-03-05；

2016-07-12)