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      MG132對SH-SY5Y細胞Aβ水平的影響*

      2016-08-24 09:53:10孫利利楊艷茹張繼國秦樹存
      中國病理生理雜志 2016年7期
      關(guān)鍵詞:蛋白酶體泛素空白對照

      王 浩, 孫利利, 于 楊, 楊艷茹, 馬 健, 陳 偉, 張繼國△, 秦樹存

      (1泰山醫(yī)學院藥學院,山東泰安271016;2山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室,泰山醫(yī)學院動脈粥樣硬化研究所,山東泰安271000)

      MG132對SH-SY5Y細胞Aβ水平的影響*

      王 浩1, 孫利利1, 于 楊2, 楊艷茹1, 馬 健1, 陳 偉1, 張繼國1△, 秦樹存2

      (1泰山醫(yī)學院藥學院,山東泰安271016;2山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室,泰山醫(yī)學院動脈粥樣硬化研究所,山東泰安271000)

      目的:觀察蛋白酶體抑制劑MG132誘導SH-SY5Y細胞凋亡及調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)生成的作用,并對其機制進行探討。方法:培養(yǎng)SH-SY5Y細胞,MG132對細胞進行處理,濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L,24 h后檢測各項指標。MTT法檢測細胞活力;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡; ELISA法檢測細胞Aβ1-40和Aβ1-42水平;Western blot檢測淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)、β-分泌酶(BACE1)、早老蛋白1(presenilins 1,PS1)、早老蛋白2(presenilins 2,PS2)、nicastrin(NCT)和 α-分泌酶(ADAM10)蛋白表達。結(jié)果:經(jīng)MG132處理后,細胞活力明顯下降,誘導細胞凋亡,隨劑量增加凋亡率分別為36.97%、46.20%、50.50%;細胞Aβ1-42和Aβ1-40蛋白水平明顯上升;APP及Aβ代謝相關(guān)蛋白PS1、PS2和BACE1表達均出現(xiàn)劑量依賴性的增加,而ADAM10表達呈劑量依賴性降低;NCT水平變化不明顯。結(jié)論:MG132能誘導神經(jīng)細胞凋亡,通過影響Aβ生成途徑關(guān)鍵蛋白而促進Aβ的產(chǎn)生,說明蛋白酶體活性下降可通過調(diào)節(jié)Aβ途徑參與阿爾茨海默病的發(fā)生。

      阿爾茨海默病;泛素-蛋白酶體系統(tǒng);MG132;β-淀粉樣蛋白;細胞凋亡

      阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,隨著社會人口老齡化加劇,發(fā)病率逐年增高,其發(fā)病機制尚不明確,也缺乏有效的治療措施[1]。而淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為,β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)是AD發(fā)病的關(guān)鍵分子[2]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是真核細胞重要的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng),具有調(diào)控特定蛋白質(zhì)和去除錯誤折疊或其它不正常折疊蛋白質(zhì)的重要功能,近年研究發(fā)現(xiàn),UPS可能調(diào)節(jié)Aβ代謝,進而在AD發(fā)病過程起著重要作用[3-4],但其確切的作用及機制還未完全闡明。本課題組采用蛋白酶體抑制劑MG132抑制蛋白酶體活性,處理人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞,觀察UPS受抑后對細胞活力、細胞凋亡,Aβ生成的影響,并初步探討其機制,以期為闡明UPS在AD中的作用提供依據(jù)。

      材料和方法

      1 細胞

      人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購于上海生命科學研究所。

      2 主要試劑和儀器

      蛋白酶體MG132(Sigma);完全1640培養(yǎng)基和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司);胎牛血清(杭州四季青公司);Aβ1-40和Aβ1-42ELISA試劑盒(藍基生物公司);APP、BACE1、ADAM10、PS1、PS2和NCT抗體(Abcam)。CO2培養(yǎng)箱(SANYO);多功能酶標儀(Tecan INFINITE200);垂直電泳儀、電泳槽及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad);流式細胞儀(BD)。

      3 主要方法

      3.1 細胞培養(yǎng)及給藥 SH-SY5Y細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞生長到80%融合時給藥,給藥處理24 h。除MTT實驗中MG132濃度為1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和15 μmol/L外,其余實驗均為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L??瞻讓φ战M給予等量的DMEM培養(yǎng)基。

      3.2 MTT實驗檢測細胞活力[5]細胞培養(yǎng)于96孔板中,給藥處理后,去培養(yǎng)基,每孔加入含MTT的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h,MTT終濃度為0.5 g/L,4 h后去除培養(yǎng)基,每孔加入DMSO 100 μL,室溫搖床振蕩10 min,酶標儀檢測其吸光度,波長為490 nm,每組重復3孔。

      3.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)于6孔板中,給藥處理后,用不含EDTA的胰蛋白酶消化后收集細胞,PBS清洗2次,離心去上清。500 μL緩沖液重懸細胞,調(diào)整細胞濃度為5×108/L,依次加入5 μL PI和5 μL Annexin V,5 min后,流式細胞儀檢測細胞凋亡。每組重復3孔。

      3.4 ELISA檢測細胞Aβ1-40和Aβ1-42水平[6]細胞培養(yǎng)于6孔板中,給藥處理后留取上清,用于測定Aβ1-40和Aβ1-42水平;胰酶消化后收集細胞,PBS清洗2次,采用反復凍融法裂解細胞,收集裂解液用于測定細胞內(nèi)Aβ1-40和Aβ1-42水平,計算時將上清液及細胞裂解液中Aβ1-40和Aβ1-42含量分別相加,作為Aβ1-40和Aβ1-42的總含量。根據(jù)ELISA試劑盒說明書,采用競爭酶聯(lián)免疫測定技術(shù),樣品與Aβ-HRP親和素在預先包被抗人Aβ抗體的酶標板孔里,37℃反應(yīng)1 h,然后再與HRP酶底物共同孵育,加入終止液后于酶標儀450 nm處測定吸光度。每組重復3孔。

      3.5 Western blot檢測蛋白水平[7]細胞培養(yǎng)于6孔板中,給藥處理后,胰酶消化收集細胞,預冷PBS 洗2次,用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞,冰上放置30 min,4℃ 12 000×g離心20 min,收集上清,BCA試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,相關(guān)Ⅰ抗室溫孵育2 h,4℃過夜,Ⅱ抗室溫孵育2 h,ECL于顯影儀中曝光顯影,實驗重復3次。以β-actin為內(nèi)參照,進行半定量分析,比值表示其相對量。

      4 統(tǒng)計學方法

      用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理,數(shù)據(jù)用(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      結(jié)果

      1 MG132降低SH-SY5Y細胞活力

      MTT實驗結(jié)果顯示,與空白對照組相比,加入MG132后的SH-SY5Y細胞活力明顯下降(P<0.01),隨著濃度的增加細胞活力分別下降了38.00%、47.22%、51.17%、52.00%和52.98%,表明MG132對SH-SY5Y細胞具有明顯損傷作用,見圖1。

      Figure 1.MG132 reduced the viability of SH-SY5Y cells.Mean ±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.圖1 MG132降低SH-SY5Y細胞活力

      2 MG132誘導SH-SY5Y細胞凋亡

      流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與空白對照組相比,MG132各濃度(2.5、5和10 μmo/L)組早期凋亡率和晚期凋亡率都明顯增加,總凋亡率分別為36.97%、46.20%和50.50%,相比空白對照組的6.31%明顯升高,說明MG 132能明顯誘導SH-SY5Y細胞凋亡,見圖2。

      3 MG132提高SH-SY5Y細胞Aβ1-40和Aβ1-42的水平

      與空白對照組比較,MG132各濃度組總的Aβ1-40和Aβ1-42水平都明顯增高,且具有一定的劑量依賴性,說明MG132可提高Aβ水平,見圖3。

      Figure 2.MG132 induced the apoptosis of SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.圖2 MG132誘導SH-SY5Y細胞凋亡

      Figure 3.MG132 increased the level of Aβ in the SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.圖3 MG132提高SH-SY5Y細胞Aβ1-40和Aβ1-42水平

      4 MG132調(diào)節(jié)與Aβ生成相關(guān)蛋白的表達

      Aβ由APP水解產(chǎn)生,其水解酶為BACE1和γ-分泌酶[8]。與空白對照組相比,給予MG132后,APP 和BACE1蛋白表達明顯增多。γ分泌酶是由4個亞基組成的復合蛋白,其中發(fā)揮重要作用的為PS1、PS2 和NCT[8]。與空白對照組相比,給予MG132后PS1 和PS2蛋白表達都明顯增加,NCT雖然表達也有所增加,但無顯著性統(tǒng)計學差異。ADAM10是使APP經(jīng)非淀粉樣途徑水解的主要酶,經(jīng)此途徑水解不產(chǎn)生Aβ[8]。與空白對照組相比,給予 MG132后,ADAM10表達明顯下降,見圖4。

      討論

      UPS是廣泛存在于細胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)降解途徑,對于維持各種細胞功能具有重要意義。UPS系統(tǒng)由泛素、泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase enzyme,E3)和26S蛋白酶體構(gòu)成,其中酶主要負責底物蛋白的泛素化,而26S蛋白酶體負責識別泛素分子標記的蛋白底物并將其降解[9]。研究發(fā)現(xiàn),UPS異常與多種神經(jīng)變性疾病相關(guān),如帕金森病、AD等[10]。尤其是UPS與AD的相關(guān)性,越來越受到研究者的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)在AD患者腦組織中蛋白酶體活性明顯下降,尤其是與學習記憶密切相關(guān)的海馬區(qū);AD患者2個重要的病理學改變[由Aβ形成的老年斑(senile plaque,SP)和由磷酸化Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)]中泛素積聚[11-12];也有研究發(fā)現(xiàn)泛素系統(tǒng)的紊亂及蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的損害是AD發(fā)生的早期事件[13];說明UPS失調(diào)在AD發(fā)生過程中可能起著重要作用。所以有學者認為AD是蛋白質(zhì)錯誤折疊性疾病,蛋白質(zhì)質(zhì)量控制失衡是導致AD發(fā)生直接或間接原因[14]。因此本課題組利用蛋白酶體活性抑制劑MG132對UPS在AD中的作用進行了研究,發(fā)現(xiàn)MG132處理SH-SY5Y細胞后,細胞活力隨著MG132濃度的增高明顯下降,細胞凋亡明顯增加,表明蛋白酶體活性下降能誘導細胞損傷,說明正常的蛋白酶體活性是維持神經(jīng)細胞活力及功能的重要因素。

      Figure 4.The effect of MG132 on the expression of the related proteins for Aβ generation in the SH-SY5Y cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.圖4 MG132影響與SH-SY5Y細胞Aβ生成相關(guān)蛋白的表達

      基于Aβ建立的淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為Aβ在腦內(nèi)沉積是AD病理改變的中心環(huán)節(jié),可引發(fā)一系列病理過程,這些病理過程又進一步促進Aβ沉積,從而形成一種級聯(lián)式放大效應(yīng)[15]。而有研究發(fā)現(xiàn)UPS在Aβ的生成和代謝中發(fā)揮重要作用,可調(diào)控Aβ的水平[16]。在本研究中經(jīng)不同濃度的MG132處理SH-SY5Y細胞后,Aβ1-40及Aβ1-42的水平都明顯升高,也證實了此觀點。同時本研究還對UPS系統(tǒng)調(diào)控Aβ水平的機制進行了初步研究。

      Aβ是由APP通過酶降解產(chǎn)生[8,17]。APP的降解包括淀粉樣肽源途徑和非淀粉樣肽源途徑。淀粉樣肽源途徑是指APP在腦內(nèi)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶的作用生成具神經(jīng)毒性的Aβ片段,非淀粉樣肽源途徑是指APP在α-分泌酶(如ADAM10)和γ-分泌酶的作用下從Aβ序列內(nèi)部進行降解,生成sAPPα而避免Aβ的生成。生理狀態(tài)下,APP主要經(jīng)非淀粉樣途徑水解,少量經(jīng)淀粉樣途徑產(chǎn)生 Aβ,而且sAPPα還具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用。而本研究發(fā)現(xiàn),給予MG132后,BACE1水平明顯升高,ADAM10水平則明顯下降,說明UPS功能下降可改變生理的APP降解途徑,使其更多的經(jīng)淀粉樣肽源途徑降解。同時本研究也發(fā)現(xiàn),給予MG132后APP水平明顯升高,說明APP也可通過UPS系統(tǒng)進行降解,這與Shen等[5]的研究結(jié)論相符。本研究還對蛋白酶體活性被抑制后γ-分泌酶蛋白表達進行了研究,研究發(fā)現(xiàn)MG132明顯提高γ-分泌酶蛋白復合物中活性蛋白PS1和PS2的表達,而對NCT的影響不明顯。說明蛋白酶體活性降低引起的Aβ水平升高,可能也與UPS系統(tǒng)參與γ-分泌酶的代謝有關(guān)。

      總之,本實驗結(jié)果表明抑制蛋白酶體活性,可誘導神經(jīng)細胞損傷和Aβ水平上升,其機制可能與其調(diào)節(jié)與Aβ生成相關(guān)的底物APP及α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶相關(guān)組分有關(guān),但對其深入的分子機制還有待進一步研究。

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      (責任編輯:陳妙玲,羅 森)

      Effect of MG132 on Aβ generation in SH-SY5Y cells

      WANG Hao1,SUN Li-li1,YU Yang2,YANG Yan-ru1,MA Jian1,CHEN Wei1,ZHANG Ji-guo1,QIN Shu-cun2

      (1School of Pharmaceutical Science,Taishan Medical University,Taian 271016,China;2Key Laboratory of Atherosclerosis in Universities of Shandong,Institute of Atherosclerosis,Taishan Medical University,Taian 271000,China.E-mail:jgzhang@tsmc.edu.cn;shucunqin@hotmail.com)

      AIM:To observe the influences of different concentrations of MG132 on apoptosis and beta-amyloid protein(Aβ)generation in SH-SY5Y cells,and to explore the underlying mechanism.METHODS:SHSY-5Y cells were incubated with MG132 for 24 h.The final concentrations of MG132 were 2.5,5 and 10 μmol/L.The cell viability was determined by MTT assay.The cell apoptosis was assessed by flow cytometry.The levels of Aβ were measured by ELISA.The relative protein levels were detected by Western blot.RESULTS:In the SH-SY5Y cells,MG132 reduced the cell viability,induced the cell apoptosis,increased the level of Aβ,and increased the expression of the related proteins for Aβ generation in a concentration-dependent manner.CONCLUSION:MG132 induces apoptosis and increases the levels of Aβ1-42and Aβ1-40by regulating the proteins related to Aβ generation in the SH-SY5Y cells.

      Alzheimer’s disease;Ubiquitin-proteasome system;MG132;Beta-amyloid protein;Apoptosis

      R363.2

      A

      10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.007

      1000-4718(2016)07-1195-05

      2015-12-08

      2016-02-29

      國家自然科學基金資助項目(No.81441111;No.81302202);山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2011HM044);山東省衛(wèi)生廳資助項目(No.2013WS0313);泰安市科技計劃資助項目(No.2015NS2072)

      △張繼國 Tel:0538-6229836;E-mail:jgzhang@tsmc.edu.cn;秦樹存 Tel:0538-6222986;E-mail:shucunqin@hotmail.com

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