掌跖角化-牙周破壞綜合征個案患者家系組織蛋白酶C的基因突變分析

陳遠(yuǎn)嬌　李晨軍

成都軍區(qū)總醫(yī)院口腔科，成都 610017

掌跖角化-牙周破壞綜合征個案患者家系組織蛋白酶C的基因突變分析

陳遠(yuǎn)嬌李晨軍

成都軍區(qū)總醫(yī)院口腔科，成都 610017

目的通過研究一例掌跖角化-牙周破壞綜合征（PLS）患者及其家系組織蛋白酶C（CTSC）基因突變的特點，提供PLS分子致病機制的理論依據(jù)，豐富PLS基因診斷和治療的科學(xué)資料。方法取得臨床發(fā)現(xiàn)的一例PLS先證者及其家屬知情同意，分別提取先證者及其父母、姐姐的基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和DNA直接測序技術(shù)，分析先證者及其直系血親CTSC基因的突變情況。結(jié)果PLS先證者CTSC基因存在復(fù)合型雜合突變，突變位點是c.754C＞T和c.1040A＞G，其父母均為攜帶者，姐姐未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論PLS先證者的臨床表征是由CTSC基因突變引起。

組織蛋白酶C；掌跖角化-牙周破壞綜合征；基因突變

掌跖角化-牙周破壞綜合征（Papillon-Lefèvre syndrome，PLS）是1924年由法國人Papillon和Lefèvre首次報告的常染色體隱性遺傳性疾病，其發(fā)病率約為百萬分之一至四［1］。男女發(fā)病率相似，未見種族特異性，多發(fā)于有近親結(jié)婚史的家系。PLS以早發(fā)的快速進(jìn)展的重度牙周組織破壞和掌跖過度角化為特征，牙周組織嚴(yán)重破壞且發(fā)現(xiàn)較晚時常導(dǎo)致乳恒牙的早期脫落。迄今為止，PLS的病因和致病機制還不完全清楚，但已有的研究結(jié)果表明位于染色體11q14.2的組織蛋白酶C（cathepsin C，CTSC）基因的突變是PLS的致病基礎(chǔ)［2］。本研究對臨床確診的一個PLS患者家系進(jìn)行CTSC基因分析。

1　材料和方法

1.1研究對象

先證者為一名臨床確診為PLS的患兒，該患兒于2010年9月（8歲）因新萌牙齒松動、伴牙齒咬合疼痛、牙齦出血就診。就診時口腔檢查:所有乳牙脫落，3、8、9、10、14、19、23、24、25、26、30萌出，多數(shù)牙松動并探及深牙周袋、牙周溢膿；未萌恒牙區(qū)的下頜牙槽嵴低平狹窄，牙齦未見明顯炎癥表現(xiàn)（圖1）。X線片示全口牙槽骨廣泛性吸收，4顆第一磨牙僅根尖處見少量牙槽骨（圖2）。雙手掌、足底皮膚過度角化，脫屑，病損厚度不一，呈魚鱗狀。足底皮膚損害累及足背和跟腱，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)區(qū)見輕度皮膚損害。手背、指甲及肘關(guān)節(jié)無明顯異常。全身皮膚無膿腫，無多汗及臭汗?，F(xiàn)先證者13歲，發(fā)育良好，智力正常，恒牙均萌出，牙列擁擠，僅19、24、25輕微松動，牙齦呈輕度炎癥。家系追溯4代，現(xiàn)存17人，無近親結(jié)婚史，了解相關(guān)病史，對各家系成員進(jìn)行全身及牙周?？茩z查，僅發(fā)現(xiàn)先證者一名受累。先證者共有直系血親3人，包括父親、母親及一名姐姐，3人的牙周及全身檢查結(jié)果顯示均無侵襲性牙周炎及掌跖角化癥狀。

圖1　初診時先證者口內(nèi)照Fig　1　Intraoral view of propositus at the baseline

圖2　初診時先證者口腔曲面斷層片F(xiàn)ig　2　Panoramic radiograph of propositus at the baseline

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取因該PLS家系僅患兒一名先證者，故選擇先證者及其直系血親作為實驗對象。取得受試者知情同意后，抽取外周靜脈血各5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，使用血液DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA。

1.2.2引物設(shè)計和合成參照Toomes等［3］和Hart等［4］關(guān)于CTSC基因1～7外顯子引物設(shè)計方案設(shè)計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）PCR反應(yīng)體系為50 μL體系，包括10×PCR buffer 5 μL、25 mmol·L-1dNTP 4 μL、10 μmol·L-1上游引物1 μL、10 μmol·L-1下游引物1 μL、5 U·μL-1Taq酶0.5 μL、ddH2O 33.5 μL，模板DNA 5 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變形30 s，按各外顯子的退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)后于72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)在GeneAmp PCR System 9600（PerkinElmer公司，美國）上進(jìn)行。

1.2.4DNA直接測序使用瓊脂糖凝膠分別純化所得CTSC基因外顯子1～7的PCR產(chǎn)物，并將純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，其中外顯子5使用正向巢氏測序引物，其余外顯子使用PCR擴(kuò)增引物，測序結(jié)果與人類基因組中的CTSC基因序列進(jìn)行對比分析。

2　結(jié)果

2.1CTSC基因外顯子5突變情況

先證者位于外顯子5的第754位堿基發(fā)生了一個雜合突變，該堿基對中的堿基C被T取代（c.754C＞T）（圖3a），與之相對應(yīng)的第252位氨基酸密碼子由CAA改變?yōu)門AA，其編碼的氨基酸由谷氨酰胺改變?yōu)榻K止密碼子（p.Q252X），該無義突變使該條染色體上的CTSC基因編碼的氨基酸縮短為251個氨基酸。該突變位點以前的研究均未報道過，屬于新突變位點。先證者的父親于外顯子5的第754位堿基也發(fā)現(xiàn)了一個與先證者相同的雜合突變（圖3b），先證者的母親及姐姐均未在外顯子5上發(fā)現(xiàn)突變位點（圖3c、d）。

圖3　CTSC基因外顯子5測序Fig　3　Sequencing of CTSC gene mutation of exon 5

2.2CTSC基因外顯子7突變情況

先證者位于外顯子7的第1 040位堿基發(fā)生了一個雜合突變（圖4a），該堿基對中的堿基A被G取代（c.1040A＞G），與之相對應(yīng)的第347位氨基酸密碼子由TAT改變?yōu)門GT，其編碼的氨基酸由酪氨酸改變?yōu)榘腚装彼幔╬.Y347C）。先證者的母親于外顯子7的第1 040位堿基也發(fā)現(xiàn)了一個與先證者相同的雜合突變（圖4b），先證者的父親及姐姐均未在外顯子7上發(fā)現(xiàn)突變位點（圖4c、d）。

圖4　CTSC基因外顯子7測序Fig　4　Sequencing of CTSC gene mutation of exon 7

2.3CTSC基因內(nèi)含子1的改變

先證者外顯子2的PCR產(chǎn)物正向測序發(fā)現(xiàn):CTSC基因內(nèi)含子1距外顯子2序列始端有一個13個堿基T的連續(xù)序列，先證者這個連續(xù)序列含有一個堿基T的雜合缺失，造成外顯子2的序列無法檢測（圖5a）。接著對先證者及其雙親、姐姐的外顯子2的PCR產(chǎn)物行反向測序，結(jié)果均未在外顯子2上發(fā)現(xiàn)突變，在內(nèi)含子1末尾的T堿基連續(xù)序列均發(fā)現(xiàn)一個堿基T雜合缺失，但該缺失不位于內(nèi)含子1和外顯子2的接合處，不影響CTSC基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯（圖5b～e）。

圖5　CTSC基因內(nèi)含子1測序Fig　5　Sequencing of CTSC gene mutation of intron 1

由此可見，PLS先證者CTSC基因存在復(fù)合型雜合突變，突變位點是外顯子5上的c.754C＞T 和外顯子7上的c.1040A＞G，其父母均為攜帶者，姐姐未發(fā)現(xiàn)突變。另外，先證者及其父母、姐姐均在CTSC基因內(nèi)含子1末尾的T堿基連續(xù)序列中發(fā)現(xiàn)一個堿基T的雜合缺失。

3　討論

PLS屬于常染色體隱性遺傳疾病，位于常染色體11q14.2的CTSC基因突變是PLS的致病基礎(chǔ)［2］。迄今為此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)70多種CTSC基因突變型與PLS有關(guān)，其中無義突變和錯義突變較多［5］。本實驗發(fā)現(xiàn)的c.754C＞T以前從未報道過，是CTSC基因的新突變位點，c.1040A＞G早在Toomes等［3］證實CTSC基因突變是PLS的遺傳學(xué)基礎(chǔ)的研究中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為可能是PLS患者CTSC的突變熱點［2］。

CTSC基因突變類型中，以純合突變或純合子突變合并雜合突變?yōu)橹?，本實驗中先證者由兩個雜合突變組合的復(fù)合型雜合突變較少。目前研究［6］不能確定CTSC基因是否有特異性突變。另外，先證者及其父母、姐姐均在CTSC基因內(nèi)含子1末尾的T堿基連續(xù)序列中發(fā)現(xiàn)一個堿基T的雜合缺失，該缺失距離內(nèi)含子1和外顯子2的接合處較遠(yuǎn)，不會影響CTSC基因內(nèi)含子的剪接、成熟mRNA的加工及后期mRNA的轉(zhuǎn)錄，考慮為CTSC基因多態(tài)性位點［7］。

c.754C和c.1040A都位于CTSC基因的高度保守序列［7］，c.754C＞T致使編碼谷氨酰胺的第252位密碼子CAA被終止密碼子TAA替代，致使后來合成的CTSC肽鏈縮短；c.1040A＞G導(dǎo)致第347位氨基酸密碼子TAT被TGT替換，轉(zhuǎn)錄過程中半胱氨酸替換正常序列中的酪氨酸（p.Y347C）。半胱氨酸替換酪氨酸，不但改變肽鏈的結(jié)構(gòu)，還影響肽鏈的折疊和組裝，妨礙CTSC功能蛋白質(zhì)的形成。c.754C＞T和c.1040A＞G的復(fù)合型雜合突變，可能嚴(yán)重影響CTSC基因合成有功能的蛋白質(zhì)，致使CTSC的活性顯著降低甚至缺乏。

CTSC在中性粒細(xì)胞、具有細(xì)胞毒性的淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、牙槽骨內(nèi)巨噬細(xì)胞以及肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)較高，可以活化中性粒細(xì)胞衍生的絲氨酸蛋白酶和粒酶，影響免疫反應(yīng)［8-9］。由于CTSC基因突變引起的免疫紊亂增加了PLS患者的炎癥易感性，致使PLS患者更容易發(fā)生嚴(yán)重的少發(fā)的炎癥性疾?。?］。所以，可推測本實驗中的先證者因CTSC基因的復(fù)合型雜合突變致使牙周組織中CTSC活性幾乎完全喪失，引起牙周組織的免疫反應(yīng)紊亂和嚴(yán)重的牙周炎癥。先證者乳牙期雖未追溯到明顯的牙齦炎癥表現(xiàn)，但存在乳牙早脫、萌出恒牙牙周炎重等早發(fā)性重度牙周炎表現(xiàn)，與上述推測符合。

大部分PLS患者都有過度的掌跖角化癥狀和早發(fā)的快速進(jìn)展性牙周炎這兩個典型的臨床表現(xiàn)，但是少數(shù)病例中患者表現(xiàn)為不典型的臨床癥狀或一些少發(fā)的臨床表現(xiàn)，因此，有學(xué)者［5，10］就CTSC基因的突變位點及類型與PLS患者的臨床表型之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示:PLS患者致病基因的遺傳異質(zhì)性低、等位基因異質(zhì)性高，即PLS的致病基因僅是CTSC基因，CTSC基因發(fā)生不同類型的突變產(chǎn)生多種異常表型的概率高；PLS患者顯著的表型異質(zhì)性與特別的基因突變類型間無確切聯(lián)系，但可能與一些附加基因的修飾和后天環(huán)境因素的影響有關(guān)。CTSC基因突變是PLS遺傳學(xué)基礎(chǔ)已經(jīng)被證實，其可作為PLS診斷的新措施，特別適用于一些臨床癥狀不典型但疑為PLS病例的診斷。

目前，PLS的治療措施有限，掌跖角化病損和牙周破壞都以對癥治療為主。早期給予牙周干預(yù)治療，可以盡量保存PLS患者牙周情況較好的乳恒牙甚至全口健康的恒牙。CTSC基因檢測可作為一種篩查手段，增大早期發(fā)現(xiàn)PLS的機率。近期研究［11］顯示，PLS患者的牙周炎癥反應(yīng)的改變與血清IgE含量變化一致，IgE有可能作為監(jiān)測PLS牙周炎癥反應(yīng)程度的指示因子。全面了解PLS的病因和致病機制，以及病因與臨床表型的關(guān)系，從病因出發(fā)，采用基因治療的方法糾正或補償CTSC基因的異常和缺陷，有望打破PLS治療方面的困境。

［1］ Papillon MM， Lefevre P. Two cases of symmetrically familial palmar and plantar hyperkeratosis （Meleda disease） within brother and sister combined with severe dental alterations in both cases［J］. Bull Soc Fr Dermatol Syphiligr， 1924， 31 （2）:82-87.

［2］ Dhanawade SS， Shah SD， Kakade GM. Papillon-lefevre syndrome with liver abscess［J］. Indian Pediatr， 2009， 46（8）: 723-725.

［3］ Toomes C， James J， Wood AJ， et al. Loss-of-function mutations in the cathepsin C gene result in periodontal disease and palmoplantar keratosis［J］. Nat Genet， 1999， 23（4）:421-424.

［4］ Hart PS， Zhang Y， Firatli E， et al. Identification of cathepsin C mutations in ethnically diverse papillon-Lefèvre syndrome patients［J］. J Med Genet， 2000， 37（12）:927-932.

［5］ Nagy N， Vályi P， Csoma Z， et al. CTSC and Papillon-Lefèvre syndrome: detection of recurrent mutations in Hungarian patients， a review of published variants and database update ［J］. Mol Genet Genomic Med， 2014， 2（3）:217-228.

［6］ Hart TC， Bowden DW， Ghaffar KA， et al. Sublocalization of the Papillon-Lefevre syndrome locus on 11q14-q21［J］. Am J Med Genet， 1998， 79（2）:134-139.

［7］ Nakano A， Nomura K， Nakano H， et al. Papillon-Lefèvre syndrome: mutations and polymorphisms in the cathepsin C gene［J］. J Invest Dermatol， 2001， 116（2）:339-343.

［8］ 李頌， 涂平， 朱學(xué)駿. Papillon-Lefèvre綜合征伴溝紋舌1例［J］. 臨床皮膚科雜志， 2006， 35（2）:94-95. Li S， Tu P， Zhu XJ. A case of Papillon-Lefèvre syndrome with fissured tongue［J］. J Clin Dermatol， 2006， 35（2）:94-95.

［9］ S?rensen OE， Clemmensen SN， Dahl SL， et al. Papillon-Lefèvre syndrome patient reveals species-dependent requirements for neutrophil defenses［J］. J Clin Invest， 2014， 124 （10）:4539-4548.

［10］ Sulák A， Tóth L， Farkas K， et al. One mutation， two phenotypes: a single nonsense mutation of the CTSC gene causes two clinically distinct phenotypes［J］. Clin Exp Dermatol，2016， 41（2）:190-195.

［11］ Wang X， Liu Y， Liu Y， et al. Long-term change of disease behavior in Papillon-Lefèvre syndrome: seven years followup［J］. Eur J Med Genet， 2015， 58（3）:184-187.

（本文編輯李彩）

Gene mutational analyses of the cathepsin C gene in families with Papillon-Lefèvre syndrome

Chen Yuanjiao， Li Chenjun.（Dept. of Stomatology， Chengdu Military General Hospital， Chengdu 610017， China）
Correspondence: Li Chenjun， E-mail: lichenjun65@163.com.

ObjectiveThis study aims to investigate the gene mutational characteristics of cathepsin C （CTSC） gene in a Chinese patient with Papillon-Lefèvre syndrome （PLS）， then further confirm the genetic basis for the phenotype of PLS， and obtain genetic information that can be used as guide in the diagnosis and treatment of PLS. MethodsWith their consent，peripheral blood samples were obtained from the proband and his family members （his parents and older sister） for genomic DNA extraction. The coding region and exon/intron boundaries of the CTSC gene were amplified and sequenced using polymerase chain reaction and direct sequencing of DNA. ResultsCompound heterozygous mutations of CTSC gene were identified in the patient. The proband carries one heterozygous nonsense mutation c.754C＞T in exon 5 and one heterozygous missense mutation c.1040A＞G in exon 7. Both parents were heterozygous carriers without the clinical symptoms of PLS. None of the mutations were detected in the proband's sister. ConclusionThe study proves that mutations of CTSC gene are responsible for the phenotype of Papillon-Lefèvre syndrome.

cathepsin C；Papillon-Lefèvre syndrome；gene mutation

R 781.6

A

10.7518/hxkq.2016.04.005

2015-12-16；

2016-02-18

陳遠(yuǎn)嬌，住院醫(yī)師，碩士，E-mail:chenyuanjiao2010@ 163.com

李晨軍，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail:lichenjun65@163. com