可用于功能性成分研究的Caco-2細(xì)胞中空纖維反應(yīng)器的構(gòu)建

徐冬冬， 楚強(qiáng)， 楊蕓蕓， 呂相敏， 章燕珍， 鄭曉冬*

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州 310009)

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可用于功能性成分研究的Caco-2細(xì)胞中空纖維反應(yīng)器的構(gòu)建

徐冬冬1， 楚強(qiáng)1， 楊蕓蕓1， 呂相敏1， 章燕珍2， 鄭曉冬1*

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州 310009)

為了構(gòu)建一種新型的Caco-2細(xì)胞中空纖維膜反應(yīng)器，探究該模型應(yīng)用于研究功能性成分吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的可行性，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將Caco-2細(xì)胞接種于聚醚砜(polyethersulfone, PES)和聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride, PVDF)中空纖維膜上，與經(jīng)典的Transwell單層培養(yǎng)模型進(jìn)行比較，探討不同材料對(duì)細(xì)胞模型的影響；同時(shí)，利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，通過(guò)細(xì)胞功能表征方法，包括用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，熒光免疫染色觀察驗(yàn)證細(xì)胞單層的完整性和通透性，測(cè)定細(xì)胞的堿性磷酸酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞的刷狀緣酶系活性，從而對(duì)Caco-2細(xì)胞在3維中空纖維反應(yīng)器與2維模型中的增殖分化狀況進(jìn)行對(duì)比和評(píng)價(jià)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明：Caco-2細(xì)胞于接種10 d后鋪展良好，輪廓清晰，逐漸融合形成細(xì)胞單層和完整的緊密連接；刷狀緣酶系活性檢測(cè)表明：Caco-2細(xì)胞于接種后8～14 d內(nèi)完成功能分化并且活性水平高于在Transwell模型上培養(yǎng)的細(xì)胞。因此，聚醚砜和聚偏氟乙烯中空纖維膜能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖，縮短細(xì)胞分化周期，從而形成高效穩(wěn)定的3維細(xì)胞模型；同時(shí)，中空纖維膜Caco-2細(xì)胞3維反應(yīng)器已經(jīng)具備甚至高于傳統(tǒng)的Transwell單層模型所具有的功能。

Caco-2細(xì)胞； 中空纖維； Transwell模型； 聚醚砜； 聚偏氟乙烯

Summary Human colon carcinoma cell line Caco-2 has been extensively used over the last thirty years as a model of the intestinal barrier. The parental cell line undergoes a process of spontaneous differentiation that leads to the formation of a monolayer of cells, expressing several morphological and functional characteristics of the mature enterocyte. Hollow fiber membrane bioreactors can offer aninvivo-like microenvironment for adherent cell types, such as Caco-2 cells, and enable a high quantity of the desired cellular product with less population variation and favorable operation costs.

The objective of this study is to construct a novel Caco-2 cell hollow fiber membrane bioreactor, to explore the feasibility for further application by morphological observation and functional test of Caco-2 cells.

In this experiment, the Caco-2 cells were cultured in polyethersulfone (PES) and polyvinylidenefluoride (PVDF) hollow fiber membranes as well as the classic Transwell culture plate. The morphological features of the cells were observed by optical microscope and scanning electron microscope (SEM), and the cell growth characters were examined by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT). Meanwhile, the integrity of the cell monolayer was verified by fluorescence microscopy. The polarization and compactification of the monolayer was determined by brush border enzymatic activity, including the activities of alkaline phosphatase andγ-glutamyltransferase. In this way, the proliferation and differentiation of Caco-2 cells were compared and evaluated in three-dimensional hollow fiber bioreactor and two-dimensional models.

Subsequently, time-dependent morphological observation of cell layers indicated that the Caco-2 cells cultured on hollow fiber, spread well and showed clear outline, and gradually formed confluent monolayer within 10 days. The brush border enzymes were well differentiated with higher expressed function within 8-14 days compared to the traditional model, and all of them tended to be consistent in the late cultivation.

In conclusion, both the PES and PVDF hollow fiber membranes can effectively accelerate the proliferation and differentiation of Caco-2 cells during the 21-day culture period, resulting in the construction of a highly stable three-dimensional cell model. Eventually, the three-dimensional Caco-2 cell hollow fiber membrane bioreactors of PES and PVDF are successfully constructed, and the model has advantages over the traditional Transwell monolayer model.

Caco-2細(xì)胞是人源結(jié)腸腺癌細(xì)胞，同源性好，生命力強(qiáng)，經(jīng)過(guò)3周左右的培養(yǎng)后，可形成連續(xù)的細(xì)胞單層，并在形態(tài)和功能上分化出接近成熟小腸上皮細(xì)胞的狀態(tài)[1]，也相應(yīng)表達(dá)出類(lèi)似小腸上皮細(xì)胞的水解酶(如麥芽糖酶、乳糖酶、氨基肽酶等)的作用。

作為附著依賴(lài)性細(xì)胞，單層貼壁培養(yǎng)模型是Caco-2細(xì)胞最常見(jiàn)的培養(yǎng)模型。為了改善極性細(xì)胞培養(yǎng)情況，HUBATSCH等[2]將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在覆有透過(guò)性微孔濾膜的插入式嵌套培養(yǎng)板上，如圖1所示。被培養(yǎng)在半透過(guò)性濾膜上的Caco-2細(xì)胞單層將整個(gè)培養(yǎng)體系分成了頂膜側(cè)(apical side)和基底膜側(cè)(basolateral side)，化學(xué)物質(zhì)由頂膜側(cè)進(jìn)入體系，通過(guò)檢測(cè)基底膜側(cè)被測(cè)物質(zhì)的濃度即可進(jìn)行物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝研究[3]。較為經(jīng)典的產(chǎn)品有Transwell?、Millicell?等。

圖1　Caco-2細(xì)胞單層培養(yǎng)模型[2]Fig.1　Caco-2 cell monolayer model[2]

中空纖維是一種由微濾膜材料制成的細(xì)微管狀結(jié)構(gòu)，如圖2所示，管壁是極薄的半透膜；每根纖維具有很高的比表面積，其構(gòu)造類(lèi)似于動(dòng)物的毛細(xì)血管，可以為貼壁細(xì)胞提供類(lèi)似體內(nèi)的微環(huán)境[4]。膜上的微孔結(jié)構(gòu)使離子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以穿過(guò)膜到達(dá)細(xì)胞單層的兩側(cè)，避免了培養(yǎng)液流動(dòng)而產(chǎn)生的不良應(yīng)力

A: 橫截面；B:聚醚砜中空纖維膜內(nèi)表面；C:聚偏氟乙烯中空纖維膜內(nèi)表面.A: Cross-section of hollow fiber; B and C: Inner surface of polyethersulfone (PES) and polyvinylidenefluoride (PVDF) hollow fibers, respectively.圖2　中空纖維膜結(jié)構(gòu)Fig.2　Structure of hollow fiber

影響，從而使細(xì)胞以更為自然的方式進(jìn)行代謝。同時(shí)，通過(guò)中空纖維膜構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境溫和，培養(yǎng)細(xì)胞密度較高，可達(dá)1×107～1×108mL-1[5]。

Caco-2細(xì)胞模型常被應(yīng)用于口服藥物的攝取、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及毒性研究[6-7]，近年來(lái)也被大量應(yīng)用于氨基酸、核苷酸、微量元素等營(yíng)養(yǎng)素的小腸吸收機(jī)制[8]以及丙烯酰胺等毒性成分的研究[9]。傳統(tǒng)的單層細(xì)胞模型與正常腸道存在較大差異，而采用中空纖維構(gòu)建的生物反應(yīng)器在形態(tài)上更接近小腸的管腔結(jié)構(gòu)，可以為Caco-2細(xì)胞提供大量中空纖維間的孔隙作為生長(zhǎng)空間，增加了Caco-2細(xì)胞與培養(yǎng)基的接觸面積，有利于物質(zhì)交換[10]，進(jìn)而可以縮短細(xì)胞的培養(yǎng)分化周期，從而更好地應(yīng)用于口服藥物以及功能性成分的小腸吸收機(jī)制研究。

本文構(gòu)建了3維Caco-2中空纖維反應(yīng)器模型，通過(guò)對(duì)比聚醚砜(polyethersulfone, PES)和聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride, PVDF)中空纖維培養(yǎng)環(huán)境與傳統(tǒng)Transwell模型的差別，研究不同材料和構(gòu)型對(duì)Caco-2細(xì)胞增殖分化的影響，為建立可靠、穩(wěn)定的Caco-2細(xì)胞模型并用于食品功能性成分的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Caco-2細(xì)胞(由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，30～60代)；聚醚砜親水性中空纖維微濾膜(孔徑0.1 μm，在0.1 MPa下純水通量為1 000 L/(m2·h)，內(nèi)/外徑0.8 mm/1.4 mm)、聚偏氟乙烯親水性中空纖維微濾膜(孔徑0.2 μm，在0.1 MPa下純水通量為800 L/(m2·h)，內(nèi)/外徑0.7 mm/1.3 mm)(天津森諾過(guò)濾技術(shù)有限公司)；Transwell聚碳酸酯膜細(xì)胞培養(yǎng)小室(Cat.No.3415，美國(guó)Corning公司)。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT](美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；Ⅰ型鼠尾膠原(美國(guó)Corning公司)；赫斯特?zé)晒馊剂?3342(上海晶純生化科技股份有限公司)；ZO-1免疫熒光染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；堿性磷酸酶試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2儀器

超凈臺(tái)(SW-CJ-2D型，江蘇省蘇州市凈化設(shè)備公司)，冷凍微量離心機(jī)(Legend Micro 17R，美國(guó)Thermo公司)，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱(BB15，美國(guó)Thermo公司)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(MLS-3750，日本Sanyo公司)，倒置相差顯微鏡(IX2-SLP，日本Olympus公司)，酶標(biāo)儀(SpectraMAX PLUS 384，美國(guó)分子儀器公司),熒光顯微鏡(AX10，德國(guó)Zeiss公司)，掃描電子顯微鏡(TM-1000，日本Hitachi公司)，步進(jìn)電機(jī)及其控制器和驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(上海四宏電機(jī)有限公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，然后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隔天換液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80%～90%融合時(shí)(約2～3 d)，用胰酶消化并按一定比例進(jìn)行傳代。

1.4Caco-2細(xì)胞單層培養(yǎng)模型的構(gòu)建

在接種細(xì)胞前用0.75 mg/mL的Ⅰ型鼠尾膠原溶液鋪被Transwell小室的頂膜側(cè)濾膜，晾干后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞以1.5×105cm-2的密度接種于濾膜上，基底膜側(cè)加入DMEM培養(yǎng)基；接種后隔天換液，1周后每天換液，培養(yǎng)21 d。

1.5Caco-2細(xì)胞3維培養(yǎng)模型的構(gòu)建

將中空纖維切成3 cm小段，浸入磷酸鹽緩沖溶液(phosphate-buffered saline,PBS)中，通過(guò)蒸汽高壓滅菌后在超凈臺(tái)上鋪開(kāi)風(fēng)干。在接種細(xì)胞前，先用0.1%乙酸溶液配置0.75 mg/mL鼠尾膠原溶液，注入中空纖維內(nèi)腔，靜置于6孔板中待膠原凝固。試驗(yàn)時(shí)，將密度為5×106mL-1的Caco-2細(xì)胞懸液注入中空纖維內(nèi)腔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，使用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，使中空纖維沿軸向旋轉(zhuǎn)，便于細(xì)胞均勻貼附；旋轉(zhuǎn)4 h后，將培養(yǎng)有細(xì)胞的中空纖維置于6孔板中，每孔加入2～3 mL培養(yǎng)基，每天輕微晃動(dòng)培養(yǎng)板，每1～2 d更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d。

1.6細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

于倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，了解其生長(zhǎng)習(xí)性并記錄拍照。

將生長(zhǎng)于中空纖維上的細(xì)胞單層用戊二醛固定并用乙醇梯度脫水處理后，于掃描電子顯微鏡下觀察Caco-2細(xì)胞在中空纖維膜內(nèi)表面的生長(zhǎng)狀況和細(xì)胞單層形成情況。

用10 μg/mL Hoechst 33342熒光染料溫育中空纖維內(nèi)腔的Caco-2細(xì)胞，棄去染料溶液,并用PBS漂洗后剖開(kāi)中空纖維，迅速置于倒置熒光顯微鏡(紫外激發(fā)光)下通過(guò)細(xì)胞核觀察Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)和分布情況。

1.7MTT試驗(yàn)

將接種有Caco-2細(xì)胞的中空纖維取出，放入新的6孔板中，用PBS漂洗；將配好的MTT溶液注入中空纖維，然后將該6孔板置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)3～4 h，使MTT還原為藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，然后用PBS漂洗2次，將中空纖維剖開(kāi)觀察結(jié)晶情況，再加入含有0.1% HCl的異丙醇溶液萃取10 min，得到藍(lán)紫色萃取液；設(shè)置波長(zhǎng)為570 nm，測(cè)該萃取液的吸光度值。

1.8刷狀緣酶系檢驗(yàn)

取出中空纖維置于新的6孔板中，用PBS漂洗，將中空纖維剖開(kāi)剪碎，用0.5% Trition X-100溶液(經(jīng)PBS稀釋)進(jìn)行裂解，必要時(shí)可進(jìn)行超聲或振蕩處理；30 min后收集裂解液，將樣品置于-80 ℃冰箱中凍存。根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作并測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度值，根據(jù)酶活性的定義計(jì)算出樣品中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)的活性。

1.9ZO-1蛋白熒光染色試驗(yàn)

將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的中空纖維膜和Transwell嵌套小室從培養(yǎng)箱中取出，用PBS漂洗，隨后用預(yù)先配好的4%多聚甲醛溶液浸泡，于4 ℃冰箱中放置過(guò)夜以固定細(xì)胞，之后用PBS溶液緩慢清洗3次，再用混合有1%胎牛血清和0.2% Trition X-100的PBS溶液于室溫下浸潤(rùn)90 min，以封閉樣品；用鵝抗兔IgG-CY3抗體對(duì)封閉后的樣品染色，于37 ℃環(huán)境下放置90 min；最后用PBS緩慢清洗后迅速置于熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光的激發(fā)波段和發(fā)射波段分別為510～560 nm和>590 nm。

1.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2013和SPSS 19.0軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間先進(jìn)行方差分析，方差齊性用t檢驗(yàn)，方差不齊用t′檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(MTT法)

通過(guò)MTT試驗(yàn)來(lái)表征不同材料的中空纖維反應(yīng)器和Transwell單層培養(yǎng)模型中Caco-2細(xì)胞琥珀酸脫氫酶活性，即在570 nm處的吸光度值。如圖3所示，中空纖維反應(yīng)器和Transwell單層模型呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)(P>0.05)。在前9～10 d細(xì)胞的總琥珀酸脫氫酶活性不斷增長(zhǎng)，而在隨后1周內(nèi)總體上基本維持穩(wěn)定水平，在細(xì)胞增長(zhǎng)分化末期呈現(xiàn)出一定的衰減。其原因可能是在細(xì)胞大量增長(zhǎng)融合后，由于生存空間有限而使細(xì)胞間形成了接觸抑制，隨后，其細(xì)胞內(nèi)的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量被用于功能分化，因而代表線粒體功能的琥珀酸脫氫酶有所減弱。

圖3　Caco-2細(xì)胞在Transwell插入式濾膜、PES和PVDF中空纖維膜上培養(yǎng)的MTT結(jié)果Fig.3　MTT value of Caco-2 cells cultured on the surface of Transwell insert, PES and PVDF hollow fibers

2.2Caco-2細(xì)胞掃描電鏡觀察

在21 d培養(yǎng)周期內(nèi)，Caco-2細(xì)胞在PES和PVDF中空纖維內(nèi)表面的生長(zhǎng)融合狀態(tài)見(jiàn)圖4和圖5。在培養(yǎng)前期，Caco-2細(xì)胞增殖明顯，逐漸形成細(xì)胞單層，覆蓋了中空纖維膜內(nèi)表面；而在培養(yǎng)后期，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，不僅覆蓋膜材料表面，還出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)，并出現(xiàn)部分球形死亡細(xì)胞。對(duì)2種中空纖維材料比較發(fā)現(xiàn)，在PES中空纖維膜表面，Caco-2細(xì)胞形態(tài)更為清晰，而在PVDF膜內(nèi)培養(yǎng)21 d左右形成的細(xì)胞密度更大，完全覆蓋了膜材料表面。

從接種培養(yǎng)9 d的掃描電鏡圖(圖6)中可以觀察到：Caco-2細(xì)胞在中空纖維膜表面黏附鋪展良好，細(xì)胞均伸出偽足，細(xì)胞輪廓清晰，呈現(xiàn)出良好的梭形或不規(guī)則多邊形的上皮細(xì)胞形態(tài)，逐漸匯合成片，形成細(xì)胞單層；在PVDF中空纖維膜上，部分細(xì)胞向材料空隙內(nèi)遷移。

2.3Caco-2細(xì)胞熒光顯微鏡觀察

使用Hoechst 33342染料對(duì)活細(xì)胞核進(jìn)行原位

A～F分別表示接種Caco-2細(xì)胞后第2、5、7、9、11、19天的生長(zhǎng)情況。標(biāo)尺=1 mm。A-F show the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PES hollow fiber membrane at the days 2, 5, 7, 9, 11, 19, respectively. Bar=1 mm. 圖4　培養(yǎng)在PES中空纖維膜內(nèi)表面的Caco-2細(xì)胞掃描電鏡圖Fig.4　Scanning electron microscope (SEM) images of the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PES hollow fiber membrane

熒光染色。從圖7和圖8中可以看出，在中空纖維膜內(nèi)表面上可見(jiàn)大量染色的細(xì)胞核分布，有的細(xì)胞核呈橢圓形，有的呈梭形，貼附于中空纖維膜內(nèi)側(cè)。從細(xì)胞分布情況(圖7)看，在PES中空纖維內(nèi)表面的Caco-2細(xì)胞分布相對(duì)不均勻，而在PVDF中空纖維內(nèi)表面的細(xì)胞密度均勻。對(duì)比圖8和圖7可見(jiàn)，接種Caco-2細(xì)胞第8天后的中空纖維內(nèi)表面的細(xì)胞數(shù)較接種后第4天的增量明顯，罕見(jiàn)濃縮、碎裂的細(xì)胞核。該結(jié)果與在掃描電鏡下觀察到的一致。

A～F分別表示接種Caco-2細(xì)胞后第2、5、7、9、11、19天的生長(zhǎng)情況。標(biāo)尺=1 mm。A-F show the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PVDF hollow fiber membrane at the days 2, 5, 7, 9, 11, 19， respectively. Bar=1 mm.圖5　培養(yǎng)在PVDF中空纖維膜內(nèi)表面的Caco-2細(xì)胞掃描電鏡圖Fig.5　SEM images of the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PVDF hollow fiber membrane

(A～B)：PES中空纖維，放大倍數(shù)分別為500×，2 000×；(C～D)：PVDF中空纖維，放大倍數(shù)分別為500×，2 000×。(A-B): PES hollow fiber, with magnification times of 500× and 2 000× respectively; (C-D): PVDF hollow fiber, with magnification times of 500× and 2 000× respectively.圖6　Caco-2細(xì)胞在中空纖維上生長(zhǎng)9 d后的掃描電鏡圖Fig.6　SEM images of the morphology of Caco-2 cells cultured on the inner surface of hollow fiber membranes at the ninth day

A：PES；B：PVDF。放大倍數(shù)200×。A: PES; B: PVDF. The magnification is 200 times.圖7　接種Caco-2細(xì)胞第4天的中空纖維膜的熒光染色圖 Fig.7　Image of fluorescent staining of Caco-2 cells cultured on the inner surface of hollow fiber at the fourth day

A：PES；B：PVDF。放大倍數(shù)200×。A: PES; B: PVDF. The magnification is 200 times.圖8　接種Caco-2細(xì)胞第8天的中空纖維膜的熒光染色圖Fig.8　Image of fluorescent staining of Caco-2 cells cultured on the inner surface of hollow fiber at the eighth day

2.4Caco-2細(xì)胞極性觀察

ALP活性值為相對(duì)于第1天活性值的倍數(shù)。The value of ALP activity is times of its activity cultured at day 1.圖9　培養(yǎng)在Transwell、PES和PVDF板上的Caco-2細(xì)胞的ALP活性檢測(cè)Fig.9　Alkaline phosphatase (ALP) activity of Caco-2 cells cultured on the apical surface of Transwell insert and the inner surface of PES and PVDF hollow fiber membranes

Caco-2細(xì)胞接種培養(yǎng)后，前期穩(wěn)定增長(zhǎng)融合形成細(xì)胞層，后期開(kāi)始分化，出現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和刷狀緣。刷狀緣酶系中最具代表性的是堿性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)。堿性磷酸酶活性在Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)周期中不斷增長(zhǎng)，可以驗(yàn)證單細(xì)胞層的分化情況[11]。本文在21 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)測(cè)定特異性底物的水解反應(yīng)速率來(lái)確定酶活性，對(duì)比PES、PVDF中空纖維膜和Transwell插入式濾膜之間的差別。如圖9所示：在PES和PVDF中空纖維膜上培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞的ALP活性在培養(yǎng)周期內(nèi)持續(xù)快速增長(zhǎng)，并在2周左右達(dá)到峰值，增長(zhǎng)了約12倍，兩者都與在Transwell上培養(yǎng)的結(jié)果存在顯著差異；在培養(yǎng)8 d后，Caco-2細(xì)胞的ALP活性在PES和PVDF中空纖維反應(yīng)器中的變化較為穩(wěn)定，而在Transwell嵌套小室上培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞的酶活性增長(zhǎng)緩慢，在培養(yǎng)10 d后較快增長(zhǎng)，與酶活性已有下降的中空纖維膜上培養(yǎng)的細(xì)胞間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖10　培養(yǎng)在Transwell、PES和PVDF板上的Caco-2細(xì)胞的γ-GT活性檢測(cè)Fig.10　γ-Glutamyltransferase (γ-GT) activity of Caco-2 cells cultured on the apical surface of Transwell insert and the inner surface of PES and PVDF hollow fiber membranes

從圖10可以看出：在21 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，在中空纖維膜內(nèi)表面培養(yǎng)的細(xì)胞的γ-GT相對(duì)活性高于在Transwell嵌套小室上培養(yǎng)的細(xì)胞；在前期培養(yǎng)中，PES和PVDF中空纖維培養(yǎng)模型顯著優(yōu)于Transwell模型(P<0.05)，而三者在培養(yǎng)后期的酶活性水平趨于一致。

2.5Caco-2細(xì)胞層的緊密連接完整性觀察

完整的緊密連接網(wǎng)絡(luò)是Caco-2細(xì)胞實(shí)現(xiàn)充分分化的標(biāo)志之一。一般而言，用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色足以證明肌動(dòng)蛋白細(xì)胞單層的存在，而ZO-1蛋白的免疫熒光染色結(jié)果可以驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞緊密連接的完整性[2]。由于本試驗(yàn)采用的PVDF中空纖維膜的內(nèi)表面孔徑大于細(xì)胞直徑，導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)于各膜孔內(nèi)壁，熒光染色結(jié)果難以說(shuō)明是否形成了細(xì)胞層表面緊密連接。而PES中空纖維膜表面相對(duì)光滑，從圖11中可以觀察到具有完整緊密連接的Caco-2細(xì)胞層的形成。說(shuō)明用本試驗(yàn)構(gòu)建的PES中空纖維膜內(nèi)表面培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞可以保證細(xì)胞層的完整性和致密性。

放大倍數(shù)200×.The magnification is 200 times.圖11　接種Caco-2細(xì)胞第10天的PES中空纖維膜內(nèi)表面的ZO-1熒光染色圖Fig.11　Image of ZO-1 fluorescent staining of Caco-2 cells cultured on the inner surface of PES hollow fiber membrane at the 10th day

3　討論

通常情況下，人們通過(guò)評(píng)價(jià)Caco-2細(xì)胞模型單細(xì)胞層的緊密性和完整性來(lái)判斷模型構(gòu)建是否成功，主要觀測(cè)指標(biāo)有細(xì)胞形態(tài)、刷狀緣酶系活性、跨膜電阻值、漏出標(biāo)志物被動(dòng)擴(kuò)散的跨膜通量等。只有至少滿(mǎn)足2個(gè)以上條件才能說(shuō)明Caco-2細(xì)胞單層的緊密性與完整性良好[12]。本試驗(yàn)采用多種顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和測(cè)定刷狀緣酶系活性，以及通過(guò)熒光染色觀察來(lái)考察Caco-2細(xì)胞單層的完整性和細(xì)胞分化情況。

本文通過(guò)MTT法測(cè)定表明，細(xì)胞在前10 d快速增長(zhǎng)，隨后生長(zhǎng)變緩趨于穩(wěn)定，之后略有下降。這與文獻(xiàn)[13]所報(bào)道的Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)變化趨勢(shì)一致。此外，Caco-2細(xì)胞在中空纖維膜內(nèi)的生長(zhǎng)情況與傳統(tǒng)的Transwell單層細(xì)胞模型對(duì)比無(wú)顯著差異。這與DENG等[14]的試驗(yàn)結(jié)果一致，證明該3維Caco-2模型不遜于傳統(tǒng)的2維細(xì)胞模型。

從掃描電鏡照片可以看出，在細(xì)胞培養(yǎng)后期，細(xì)胞逐漸融合形成單層結(jié)構(gòu)，在PVDF中空纖維膜內(nèi)甚至覆蓋了膜內(nèi)表面。在熒光顯微鏡下可以觀察到被熒光染料染色的細(xì)胞核，從側(cè)面反映了Caco-2細(xì)胞在中空纖維膜內(nèi)表面生長(zhǎng)情況良好，在培養(yǎng)周期的前期大量增殖并逐漸形成細(xì)胞單層。同時(shí)，ZO-1蛋白所指示的細(xì)胞間緊密連接的形成也證明了PES中空纖維膜構(gòu)建的Caco-2細(xì)胞模型用于后期功能性成分滲透研究的可行性。

從Caco-2細(xì)胞的刷狀緣酶系活性結(jié)果可知，在中空纖維膜反應(yīng)器中的Caco-2細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了充分的分化，其堿性磷酸酶和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性均在8～14 d培養(yǎng)范圍內(nèi)達(dá)到較高水平，已經(jīng)具備甚至高于在傳統(tǒng)的Transwell插入式濾膜上培養(yǎng)21 d的細(xì)胞所具有的功能。

在體內(nèi)，組織或器官需要星羅棋布的血管輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)。而細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，由于缺乏網(wǎng)絡(luò)狀的血管系統(tǒng)，細(xì)胞聚集體超過(guò)一定厚度(一般為幾百μm)就會(huì)導(dǎo)致位于中心的細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)和氧氣而壞死，這是組織工程目前無(wú)法解決的難題[15-16]。盡管存在諸如培養(yǎng)環(huán)境不夠均一、培養(yǎng)工藝不易放大的缺點(diǎn)，但具有微濾膜性質(zhì)的中空纖維膜，不但直徑大小可選，還能實(shí)現(xiàn)可控的選擇透過(guò)性，是理想的組織和細(xì)胞體外培養(yǎng)的替代材料。中空纖維以它特有的優(yōu)點(diǎn)，在加速細(xì)胞功能表達(dá)方面表現(xiàn)出極大的價(jià)值。

借助于現(xiàn)有的在藥物滲透、轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收方面的研究基礎(chǔ)，近年來(lái)，Caco-2細(xì)胞模型也已經(jīng)越來(lái)越多地被應(yīng)用于食品科學(xué)領(lǐng)域中活性物質(zhì)的吸收代謝研究[17]，如對(duì)類(lèi)胡蘿卜素[18]、酯類(lèi)[19]、黃酮類(lèi)物質(zhì)[20]等的研究。未來(lái)除了在食品科學(xué)領(lǐng)域?qū)钚晕镔|(zhì)的研究之外，構(gòu)建Caco-2細(xì)胞中空纖維模型的成功經(jīng)驗(yàn)，也可以運(yùn)用到其他組織細(xì)胞模型的構(gòu)建中，從而拓寬中空纖維細(xì)胞模型的應(yīng)用范圍。

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XU Dongdong1, CHU Qiang1, YANG Yunyun1, Lü Xiangmin1, ZHANG Yanzhen2, ZHENG Xiaodong1*

(1.CollegeofBiosystemsEngineeringandFoodScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2.TheSecondAffiliatedHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310009,China)

Caco-2 cell; hollow fiber; Transwell model; polyethersulfone; polyvinylidenefluoride

浙江省自然科學(xué)基金(Z14C200006)；浙江大學(xué)馥莉食品研究院基金(KY201301)；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃(2013C33139).

Corresponding author)：鄭曉冬(http://orcid.org/0000-0002-0307-7754),E-mail:xdzheng@zju.edu.cn

聯(lián)系方式：徐冬冬(http://orcid.org/0000-0001-5451-9885),E-mail:xudong006@163.com

2015-09-18；接受日期(Accepted)：2015-11-06；網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online)：2016-07-19

TS 201.1

A

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160719.1907.008.html