• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用味精廢液發(fā)酵枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方優(yōu)化

    2016-08-15 05:25:19劉麗曾真方萍
    關鍵詞:味精枯草活菌

    劉麗, 曾真, 方萍.3*

    (1.浙江大學環(huán)境與資源學院,污染環(huán)境修復與生態(tài)健康教育部重點實驗室,杭州 310058;2.貴州大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境系,貴陽 550025;3.浙江大學環(huán)境與資源學院,浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點研究實驗室,杭州 310058)

    ?

    利用味精廢液發(fā)酵枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方優(yōu)化

    劉麗1,2, 曾真1, 方萍1.3*

    (1.浙江大學環(huán)境與資源學院,污染環(huán)境修復與生態(tài)健康教育部重點實驗室,杭州 310058;2.貴州大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境系,貴陽 550025;3.浙江大學環(huán)境與資源學院,浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點研究實驗室,杭州 310058)

    以營養(yǎng)肉湯(nutrient broth,NB)培養(yǎng)基為對照,通過對比試驗、正交試驗和單因素試驗,對以味精廢液為主要營養(yǎng)源的搖瓶培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌F-2培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,以提高F-2發(fā)酵液的活菌密度并實現(xiàn)味精廢液的資源化利用。對比試驗表明,用12.5 g/L濃縮味精廢液(concentrated monosodium glutamate wastewater,CMGW)培養(yǎng)的F-2菌懸液的D(600 nm)值及活菌密度顯著高于NB培養(yǎng)基,其培養(yǎng)F-2后的氨基酸含量顯著降低。通過L16(43×26)正交試驗篩選出F-2的優(yōu)化配方為CMGW 12.5 g/L,牛肉膏1.0 g/L,蛋白胨4.0 g/L,MnSO4·2H2O 0.5 g/L,H3BO30.02 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L。按此優(yōu)化配方接種培養(yǎng)F-2菌株,其菌液的活菌密度分別是未經(jīng)優(yōu)化的CMGW培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基的2.9倍和6.3倍。通過單因素試驗,篩選出基于該優(yōu)化配方的F-2菌株適宜的初始pH范圍為6.5~7.5,適宜的培養(yǎng)溫度為30~35 ℃。以上結果顯示,培養(yǎng)基CMGW對菌株F-2的發(fā)酵效果優(yōu)于NB培養(yǎng)基,其優(yōu)化配方的效果更佳。

    濃縮味精廢液; 枯草芽孢桿菌; 正交試驗設計; 培養(yǎng)基優(yōu)化; 氨基酸

    The purpose of this study was to investigate a cost-effective resource utilization of CMGW by increasing the density ofB.subtilisF-2 viable cells in cultures. The CMGW medium which was 80-fold diluent of the wastewater,i.e., 12.5 g/L CMGW, was served as the main carbon and nitrogen sources of strain F-2. Contrast experiments of shaking cultures, orthogonal and single factor experiments were applied to find the optimal CMGW medium formula and its culturing condition.

    The contrast experiments showed that theD(600 nm) value of F-2 suspension and viable cell density of the CMGW medium was significantly higher than that of nutrient broth (NB) medium, and the amino acid content in the CMGW medium decreased significantly after culturing. The optimal formula identifying F-2 by the orthogonal experiment of L16(43×26) was as follows: 12.5 g/L CMGW, 1.0 g/L beef extracts, 4.0 g/L peptone, 0.5 g/L MnSO4·2H2O, 0.02 g/L H3BO3, 0.1 g/L FeSO4·7H2O and 0.5 g/L MgSO4·7H2O. The viable cell density in the optimized CMGW medium was 2.9 and 6.3 times of the CMGW medium and NB medium, respectively. Furthermore, according to the results of single factor experiment, the proper initial pH and culturing temperature of the optimized CMGW medium were screened as pH 6.5-7.5 and 30-35 ℃.

    In conclusion, the CMGW medium is an ideal substitute for NB medium in the fermentation ofB.subtilisF-2, providing a practicable and promising approach to reuse and recover CMGW. Moreover, the CMGW medium is superior to NB medium, and the fermentation effect is even better after the medium and culturing condition are optimized.

    枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌,具有促進作物生長[9-11]、抑制植物病原菌[12-14]、加快畜禽糞便及日常生活廢棄物堆肥的腐熟進程等功能[15-17],是用于制備有機廢棄物堆肥發(fā)酵菌劑[16]或生物有機肥的重要功能菌[17]。關于通過優(yōu)化枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基以提高發(fā)酵的活菌密度的研究報道較多[18-20],但大多以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或大豆粉、玉米粉等為主料,生產(chǎn)成本較高且需要消耗大量資源[21]。鑒于此,本研究以營養(yǎng)肉湯(nutrient broth,NB)培養(yǎng)基為對照,通過一系列搖瓶培養(yǎng)試驗,對以濃縮味精廢液為主要營養(yǎng)源的枯草芽孢桿菌F-2液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化研究,以達到提高F-2菌株發(fā)酵的活菌密度、降低微生物菌劑的生產(chǎn)成本并實現(xiàn)廢棄物資源化利用的目的。

    1 材料與方法

    1.1供試材料

    供試菌株為枯草芽孢桿菌F-2,由本研究室自某商品有機肥中分離、篩選獲得,經(jīng)中國普通微生物菌種保藏管理中心鑒定并保藏,保藏號為CGMCC No.3882。該菌株能產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)豐原素(fengycin)[22],對18種植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用,對西瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf. sp.niveum)的抑制率高達93%。

    濃縮味精廢液(concentrated monosodium glutamate wastewater, CMGW)為味精廢液的蒸發(fā)濃縮液(由安徽環(huán)宇肥料有限公司提供),pH 3.1,電導率33.2 mS/cm;營養(yǎng)元素含量分別為全碳25.5%,全氮5.13%,全鉀2.07%,全磷0.16%,鈉5.51%,硫15.1%,鐵0.26 g/kg,鈣0.62 g/kg,鎂0.93 g/kg,鉬9.17 g/kg,鋅2.16 mg/kg,銅2.54 mg/kg,鎳2.29 mg/kg;其他重金屬含量見表1,均低于城鎮(zhèn)垃圾農(nóng)用控制標準[23]。

    表1濃縮味精廢液中重金屬含量及控制標準

    Table 1Heavy metal contents in concentrated monosodium glutamate wastewater (CMGW) and its control standard μg/kg

    元素ElementsAsCdCrHgPb濃縮味精廢液CMGW0.520.01000.07城鎮(zhèn)垃圾農(nóng)用控制標準Controlstandardsforurbanwastesforagriculturaluse30.003.003005100.00

    1.2培養(yǎng)基

    NB培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,加水至1 000 mL,pH 7.0;1×105Pa滅菌30 min。

    NB固體培養(yǎng)基:在NB培養(yǎng)基的基礎上加入瓊脂20.0 g;1×105Pa滅菌30 min。

    CMGW培養(yǎng)基:CMGW 12.5 g,加水稀釋至1 000 mL,pH 7.0;1×105Pa滅菌30 min。

    1.3F-2種子菌液制備

    取1環(huán)F-2斜面菌苔于NB固體培養(yǎng)基平板上劃線,在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)基中,于30 ℃、150 r/min下 振蕩培養(yǎng)18 h(經(jīng)前期F-2生長曲線測定試驗確定),獲得F-2種子菌液。

    1.4試驗設計

    1.4.1CMGW和NB培養(yǎng)基對F-2培養(yǎng)對比試驗

    按1%接種量分別接種F-2種子菌液于CMGW培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基中,每種培養(yǎng)基處理各重復5次,于30 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)18 h,觀察2種培養(yǎng)基培養(yǎng)F-2后菌懸液濃度及活菌密度。

    1.4.2基于CMGW的F-2菌株培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗

    1.4.3基于優(yōu)化配方的F-2培養(yǎng)條件優(yōu)選試驗

    以1.4.2節(jié)所篩選的優(yōu)化配方對菌株F-2進行不同培養(yǎng)基初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和不同培養(yǎng)溫度(25、30、35、40 ℃)的振蕩培養(yǎng)試驗。各處理的F-2種子液接種量均為1%,并在150 r/min下振蕩培養(yǎng)18 h。其中,不同初始pH試驗的培養(yǎng)溫度為30 ℃,不同培養(yǎng)溫度試驗的培養(yǎng)基初始pH為優(yōu)選確定的初始pH。各處理重復3次。

    1.5測定項目與方法

    1.5.1菌懸液細胞濃度測定

    在一定濃度范圍內(nèi),菌懸液的細胞濃度與其濁度即光密度成正比[24]80-84。以各培養(yǎng)基的原液為空白,采用紫外可見分光光度計(PerkinElmer Lambda 35,美國)測定在600 nm處相應處理培養(yǎng)終止時的菌懸液光密度值,記作D(600 nm),用以表示該菌懸液的細胞濃度。

    表2 L16(43×26)正交設計試驗方案

    括號內(nèi)的數(shù)據(jù)為各因子水平的實際量,g/L.

    The data in parentheses are the actual dosage of the level of each factor in the medium, g/L.

    1.5.2培養(yǎng)液活菌密度測定

    采用平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計相關處理培養(yǎng)液的活菌數(shù)[24]327-333。

    1.5.3總碳和總氮測定

    本系統(tǒng)是一個以傳感器數(shù)據(jù)采集、物聯(lián)網(wǎng)窄帶通信傳輸、數(shù)據(jù)庫應用、網(wǎng)絡平臺分享為一體的數(shù)據(jù)采集、分析管理系統(tǒng)。通過各類傳感器數(shù)據(jù)采集后進行匯聚,采用PHP+MYSQL技術實現(xiàn)本系統(tǒng)的開發(fā)。PHP語言簡單、功能強大,而MYSQL是一個非常優(yōu)秀的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫系統(tǒng),方便使用,性能穩(wěn)定。國內(nèi)外許多知名網(wǎng)站和應用均使用該數(shù)據(jù)庫作為數(shù)據(jù)的存儲。

    采用碳氮分析儀(Analytik Jean multi N/C 3100,德國)測定培養(yǎng)液的總碳和總氮,并計算碳氮比(C/N)。

    1.5.4氨基酸測定

    取1.000 g培養(yǎng)液樣品于25 mL刻度試管中,加6 mol/L鹽酸10 mL,抽真空密封后,于110 ℃水解24 h,定容到25 mL。取上清液0.5 mL,于70 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮干燥后加2 mL 0.022 mol/L稀鹽酸,完全溶解后過0.225 μm水相濾膜。濾液采用全自動氨基酸分析儀(HITCHI L-8900,日本)測定氨基酸含量。

    1.6數(shù)據(jù)分析

    試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理并作圖,利用DPS 14.5軟件[25]進行單因素試驗和正交試驗結果的方差分析。

    2 結果與分析

    2.1枯草芽孢桿菌F-2在CMGW與NB培養(yǎng)基中的生長量比較

    如圖1所示,振蕩培養(yǎng)18 h后,CMGW培養(yǎng)基中F-2菌液的D(600 nm)值顯著高于NB培養(yǎng)基(P=0.000 3)。通過平板計數(shù)測得活菌密度,前者為1.55×108CFU/mL,后者為7.10×107CFU/mL,兩者相差1倍以上??梢姡怨┰嚌饪s味精廢液的80倍水稀釋液(CMGW 12.5 g/L)培養(yǎng)F-2菌株的效果優(yōu)于常規(guī)NB培養(yǎng)基。

    2.2CMGW培養(yǎng)基與NB培養(yǎng)基的碳、氮源比較

    作為微生物細胞的基本構成物質(zhì),碳源和氮源在微生物生長繁殖過程中有著至關重要的作用[24]80-84。CMGW與NB培養(yǎng)基的總碳和總氮含量如圖2所示,氨基酸組分含量如圖3所示。盡管CMGW的總碳、總氮及總氨基酸含量均顯著低于NB,分別為后者的55.9%、36.9%和48.9%,且除γ-氨基丁酸(G-ABA)外,各氨基酸組分含量也均低于NB培養(yǎng)基,但CMGW的碳氮比(C/N)(4.97)顯著高于NB(3.28)(P=0.008),且F-2菌株在CMGW中的生長優(yōu)于NB。這說明供試的CMGW的80倍水稀釋液所提供的總碳源、總氮源及氨基酸能夠滿足F-2生長之需。

    短柵上的不同大寫字母表示在P<0.01水平差異有統(tǒng)計學意義。Different capital letters above bars represent statistically significant differences at the 0.01 probability level. 圖1 CMGW與NB培養(yǎng)基中F-2菌懸液的 D(600 nm)值比較Fig.1 Comparison of D(600 nm) values of F-2 suspension in CMGW and NB media

    短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences between CMGW and NB media treatments at the 0.05 probability level.圖2 CMGW與NB培養(yǎng)基的總碳和總氮含量比較Fig.2 Comparisons of total carbon (TC) and total nitrogen (TN) contents in CMGW and NB media

    圖3 CMGW與NB培養(yǎng)基的氨基酸組分含量比較Fig.3 Comparisons of amino acid contents in CMGW and NB media

    進一步分析CMGW培養(yǎng)基在培養(yǎng)F-2前后的氨基酸組分及總量變化,結果表明:培養(yǎng)F-2后氨基酸總量較培養(yǎng)前顯著降低(P=0.000 4)(圖4),降低率達12%;除半胱氨酸(Cys)有所上升外,其余氨基酸組分均不同程度地降低,其中谷氨酸(Glu)降低了129.6 mg/L,天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)也都至少降低了51.5 mg/L(圖5)。可見,在味精廢液中豐富的氨基酸可作為氮源或生長因子為F-2所利用,同時在F-2的代謝過程中可能還產(chǎn)生了半胱氨酸(Cys)。

    短柵上的不同大寫字母表示在P<0.01水平差異有統(tǒng)計學意義。Different capital letters above bars represent statistically significant differences at the 0.01 probability level.圖4 培養(yǎng) F-2前后CMGW培養(yǎng)基的氨基酸總量比較Fig.4 Comparison of total amino acid contents in CMGW medium before and after culturing F-2

    圖5 CMGW培養(yǎng)基的氨基酸組分在培養(yǎng)F-2后的減少量Fig.5 Reduction amount of amino acids in CMGW medium after culturing F-2

    上述結果表明,CMGW培養(yǎng)基的碳源和氮源總量、C/N及氨基酸組分及含量可滿足F-2生長繁殖的需求,但均與NB培養(yǎng)基有一定差別,若對其組分作適當改進可望進一步提高F-2菌液的菌體密度。

    2.3基于CMGW的F-2培養(yǎng)基配方優(yōu)化

    方差分析結果表明,F(xiàn)-2菌懸液D(600 nm)值在L16(43×26)正交試驗的16個處理組合(1~16)及NB(17)處理間差異顯著(圖6),除處理4、8、9、10和13外,其余處理的D(600 nm)值均顯著高于NB,其中處理11最高,其平板計數(shù)的活菌密度為3.55×108CFU/mL,比前述未經(jīng)優(yōu)化的CMGW培養(yǎng)基的活菌密度提高了1.3倍,比NB培養(yǎng)基提高了4.0倍。

    處理(1~16)的配方方案詳見表2;處理17為NB培養(yǎng)基。短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Please see Table 2 for the details of the culture medium formula of the first 16 treatments, and the treatment 17 is NB medium. Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.圖6 L16(43×26)正交試驗不同處理及NB處理的F-2菌懸液D(600 nm)值比較Fig.6 Comparisons of F-2 suspension D(600 nm) values among the treatments of the orthogonal array experiments and NB medium

    由圖7可見,F(xiàn)-2菌懸液D(600 nm)值除了在因子E(Mo)的水平間未見統(tǒng)計學上的顯著差異外,在其余8個供試因子的水平間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中:效應最大的因子為C,表現(xiàn)為D(600 nm)值隨CMGW稀釋倍數(shù)的增加而降低,其優(yōu)選稀釋倍數(shù)為80倍(12.5 g/L);其次為因子B,其D(600 nm)值隨蛋白胨用量提高呈先升后降趨勢,其優(yōu)選用量為4.0 g/L;因子F(Co)對D(600 nm)值表現(xiàn)為負效應,其余因子均有正效應。各因子的優(yōu)選水平列于表3。按此組合配制培養(yǎng)基接種培養(yǎng)F-2,其菌液的活菌密度為4.45×108CFU/mL,分別是正交試驗中處理11、未經(jīng)優(yōu)化的CMGW培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基的1.3倍、2.9倍和6.3倍。

    2.4基于CMGW優(yōu)化配方的F-2培養(yǎng)條件優(yōu)選

    按表3所列的各因子優(yōu)選水平組合配制不同初始pH培養(yǎng)基對F-2進行培養(yǎng),測得各pH處理下的F-2菌懸液D(600 nm)值如圖8所示。方差分析表明,培養(yǎng)基初始pH對D(600 nm)值有顯著影響(P=0.045),其中在初始pH 6.5~7.5范圍內(nèi)D(600 nm)值均高于1.35,顯著高于pH 8的

    (A~I)表示的含義詳見表2。圖中不同小寫字母表示同一因子水平間在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Please see Table 2 for the details of factors A to I. Different lowercase letters represent statistically significant differences among levels of the same factor at the 0.05 probability level. 圖7 F-2菌懸液D(600 nm)值在正交試驗各因子水平間的比較Fig.7 Comparisons of D(600 nm) values of F-2 suspensions among different levels of each factor in orthogonal array experiment

    Table 3Range,Pvalue and optimal dosage of each orthogonal array factor

    因子Factors極差RangeP值Pvalue優(yōu)選量Optimaldosage g L A 牛肉膏Beefextract 0 13292 00×10-41 0B 蛋白胨Peptone 0 35481 35×10-214 0C CMGW 0 78231 35×10-3312 5D MnSO4·2H2O 0 13704 79×10-150 5E Na2MoO4 0 00230 81480 00F CoCl2·6H2O 0 36767 17×10-280 0G H3BO3 0 17306 45×10-180 02H FeSO4·7H2O 0 17306 45×10-180 1I MgSO4·7H2O 0 12495 96×10-140 5

    短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.圖8 基于CMGW優(yōu)化配方的培養(yǎng)基初始pH對F-2生長的影響Fig.8 Effects of initial pH on F-2 growth cultured in optimal CMGW medium

    D(600 nm)值,而pH 6.0與8.0之間的差異未達統(tǒng)計學上的顯著水平(P>0.05)。說明基于該優(yōu)化配方的適宜F-2生長的初始pH范圍為6.5~7.5。

    圖9表明,在培養(yǎng)基優(yōu)化配方及優(yōu)選初始pH條件下,培養(yǎng)溫度對F-2菌懸液的D(600 nm)值也具有統(tǒng)計學上的顯著影響(P=0.000 6)。在供試溫度范圍內(nèi),D(600 nm)值呈現(xiàn)出先升后降的趨勢,以30~35 ℃范圍內(nèi)D(600 nm)值最高(均大于1.35),在25 ℃和40 ℃時D(600 nm)值顯著降低。說明基于該優(yōu)化配方的F-2適宜生長的培養(yǎng)溫度為30~35 ℃。

    短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.圖9 基于CMGW優(yōu)化配方及優(yōu)選pH的培養(yǎng)溫度對F-2生長的影響Fig.9 Effects of temperatures on F-2 growth cultured in optimal CMGW medium at preferred initial pH

    3 討論

    味精廢液是一類難處理的食品工業(yè)有機廢水,因含有多種營養(yǎng)物質(zhì),仍具有極高的資源化利用價值。GU等[5]研究指出,以味精廢液為主要氮源,以馬鈴薯淀粉廢液為主要碳源,可提高菌株EBL-06的發(fā)酵產(chǎn)量。BAI等[6]指出,以味精廢液為主要氮源,以甜菜渣為主要碳源,能提高黑曲霉發(fā)酵中果膠酶和果膠裂解酶的產(chǎn)量。本研究表明,供試的濃縮味精廢液不僅含有大量氮元素,也含有豐富的碳元素,可以為微生物提供充足的氮源和碳源;同時,該濃縮味精廢液用水稀釋80倍并調(diào)節(jié)pH至7.0后作為培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌F-2進行搖瓶振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)后F-2菌懸液的D(600 nm)值及活菌密度均顯著高于對照NB培養(yǎng)基。說明可采用CMGW培養(yǎng)基代替NB培養(yǎng)基發(fā)酵F-2。測定CMGW與NB培養(yǎng)基的碳、氮源與氨基酸總量及組分含量后發(fā)現(xiàn),CMGW培養(yǎng)基的總碳、總氮、總氨基酸含量均顯著低于NB培養(yǎng)基,極大部分氨基酸組分含量也低于NB;然而,CMGW的C/N卻顯著高于NB。趙瑞[26]研究表明,高C/N更有利于枯草芽孢桿菌TU100的生長代謝。由此推測,相對于NB培養(yǎng)基,CMGW培養(yǎng)基中F-2菌懸液具有更高的D(600 nm)值及活菌密度可能與其較高的C/N有關。進一步檢測培養(yǎng)F-2后CMGW培養(yǎng)基的氨基酸組分變化發(fā)現(xiàn),氨基酸總量降低12%,除半胱氨酸(Cys)外,其余氨基酸組分含量均明顯降低。表明CMGW培養(yǎng)基的氨基酸或許為F-2的氮源和生長因子,并且通過發(fā)酵菌株F-2能有效達到資源化回收該工業(yè)廢水之目的。此外,由于微生物生長受多種因素限制,盡管CMGW培養(yǎng)基的氨基酸大部分未被F-2利用,其氮源以外的碳源及其他營養(yǎng)物質(zhì)、氨基酸以外的其他生長因子、礦質(zhì)養(yǎng)分和能源等的匱乏和均衡情況以及培養(yǎng)條件等都會影響到發(fā)酵的活菌密度;因此,為進一步提高F-2的活菌密度,有必要對CMGW培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

    考慮到CMGW培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分低于NB培養(yǎng)基,適當提高碳、氮及氨基酸等含量也可能有利于提高F-2的活菌密度。但在前期研究中發(fā)現(xiàn),CMGW稀釋倍數(shù)越低,Na含量越高,電導率越大,F(xiàn)-2生長受到抑制;因此,不宜通過降低CMGW的稀釋倍數(shù)來提高CMGW培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)含量。而若提高其稀釋倍數(shù)又必然會導致培養(yǎng)基營養(yǎng)成分尤其是碳、氮源的降低;因此,在提高其稀釋倍數(shù)的同時有必要添加適量的碳、氮營養(yǎng)。牛肉膏和蛋白胨作為天然有機營養(yǎng)物質(zhì)可同時滿足在CMGW培養(yǎng)基優(yōu)化中對碳、氮源和多種營養(yǎng)物質(zhì)的需求。同時,為了考察在CMGW培養(yǎng)基的基礎上添加礦質(zhì)養(yǎng)分是否有益,本研究通過L16(43×26)正交試驗,對包括CMGW稀釋倍數(shù)、牛肉膏和蛋白胨添加量和6個礦質(zhì)養(yǎng)分在內(nèi)的9個正交因子的水平進行了優(yōu)化。結果表明:CMGW稀釋倍數(shù)對F-2菌懸液的D(600 nm)值影響效應最大,從80倍(12.5 g/L)到約300倍(3.3 g/L)范圍內(nèi)D(600 nm)值隨稀釋倍數(shù)加大而降低,而適量添加牛肉膏和蛋白胨均有助于D(600 nm)值的升高;在6個礦質(zhì)養(yǎng)分因子中,Mo的營養(yǎng)效應不顯著,Co有顯著負效應,其余4個營養(yǎng)因子Mn、B、Fe和Mg都具有正效應??梢姡?2.5 g/L CMGW培養(yǎng)基(即CMGW的80倍水稀釋液)的基礎上增大其稀釋倍數(shù)不能滿足F-2的生長所需,而向培養(yǎng)基中添加適量的牛肉膏、蛋白胨以及礦質(zhì)養(yǎng)分如Mn、B、Fe和Mg有助于提高F-2的活菌密度。綜合各因子的影響效應及用料成本,優(yōu)選出基于味精廢液的F-2培養(yǎng)基配方為CMGW 12.5 g/L,牛肉膏1.0 g/L,蛋白胨4.0 g/L,MnSO4·2H2O 0.5 g/L,H3BO30.02 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,pH 7.0。采用該優(yōu)化配方培養(yǎng)F-2所獲得的菌懸液活菌密度達4.45×108CFU/mL,比NB培養(yǎng)基提高了5.3倍。

    培養(yǎng)基的初始pH和培養(yǎng)溫度是影響微生物生長代謝的重要環(huán)境因子[26]。本研究結果表明,利用CMGW優(yōu)化配方培養(yǎng)F-2,其適宜的培養(yǎng)基初始pH范圍為 6.5~7.5,適宜的培養(yǎng)溫度為30~35 ℃。

    綜上所述,供試濃縮味精廢液的80倍水稀釋液(CMGW 12.5 g/L)可作為枯草芽孢桿菌F-2的培養(yǎng)基,其培養(yǎng)效果優(yōu)于肉湯培養(yǎng)基;對該培養(yǎng)基作進一步優(yōu)化可明顯提高發(fā)酵液的F-2活菌密度。因此,以味精廢液作為枯草芽孢桿菌F-2的培養(yǎng)基可實現(xiàn)廢棄物的資源化利用和降低菌劑生產(chǎn)成本的雙重目的。

    [1]YANG Q X, YANG M, ZHANG S J,etal. Treatment of wastewater from a monosodium glutamate manufacturing plant using successive yeast and activated sludge systems.ProcessBiochemistry, 2005,40(7):2483-2488.

    [2]趙芳,蒲彪,劉興艷.膜法處理食品工業(yè)廢水的研究進展.食品工業(yè)科技,2012,33(3):425-428.

    ZHAO F, PU B, LIU X Y. Research progress in the membrane separation technology in processing the wastewater of the food industry.ScienceandTechnologyofFoodIndustry, 2012,33(3):425-428. (in Chinese with English abstract)

    [3]石振清,王靜榮,李書申.味精廢水處理技術綜述.環(huán)境污染治理技術與設備,2001,2(2):81-85.

    SHI Z Q, WANG J R, LI S S. A review of monosodium glutamate wastewater treatment technology.TechniquesandEquipmentforEnvironmentalPollutionControl, 2001,2(2):81-85. (in Chinese with English abstract)

    [4]趙萌.高濃度味精廢水和剩余污泥的資源化研究.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學,2007:3.

    ZHAO M. The study on recycle of high concentrated monosodium glutamate wastewater and residual sludge. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2007:3. (in Chinese with English abstract)

    [5]GU L, BAI Z, JIN B,etal. Production of a newly isolatedPaenibacilluspolymyxabiocontrol agent using monosodium glutamate wastewater and potato wastewater.JournalofEnvironmentalSciences, 2010,22(9):1407-1412.

    [6]BAI Z H, ZHANG H X, QI H Y,etal. Pectinase production byAspergillusnigerusing wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance.BioresourceTechnology, 2004,95(1):49-52.

    [7]XUE F Y, MIAO J X, ZHANG X,etal. Studies on lipid production byRhodotorulaglutinisfermentation using monosodium glutamate wastewater as culture medium.BioresourceTechnology, 2008,99(13):5923-5927.

    [8]LIU J X, YUE Q Y, GAO B Y,etal. Microbial treatment of the monosodium glutamate wastewater byLipomycesstarkeyito produce microbial lipid.BioresourceTechnology, 2012,106:69-73.

    [9]王剛,張莉,劉鳳英,等.對西瓜幼苗具有促生作用根際細菌的篩選.河南農(nóng)業(yè)科學,2009(2):90-93.

    WANG G, ZHANG L, LIU F Y,etal. Selection of rhizobacteria for promoting the plant growth of watermelon seedlings.JournalofHenanAgriculturalSciences, 2009(2):90-93. (in Chinese with English abstract)

    [10]黃大野,姚經(jīng)武,朱志剛,等.枯草芽孢桿菌水分散粒劑防治黃瓜立枯病效果及對黃瓜的促生作用.湖北農(nóng)業(yè)科學,2014,53(18):4327-4328.

    HUANG D Y, YAO J W, ZHU Z G,etal. Controlling effect ofBacillussubtiliswater dispersible granule on cucumberRhizoctoniarot and its growth-promoting effect on cucumber.HubeiAgriculturalSciences, 2014,53(18):4327-4328. (in Chinese with English abstract)

    [11]王心選,高小寧,鄭剛,等.內(nèi)生枯草芽孢桿菌E1R-J對蘿卜、白菜促生作用.西北農(nóng)業(yè)學報,2009,18(6):231-236.

    WANG X X, GAO X N, ZHENG G,etal. The growth-promoting effect of endophytic bacteria E1R-J on radish and cabbage.ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica, 2009,18(6):231-236. (in Chinese with English abstract)

    [12]ZHANG N, WU K, HE X,etal. A new bioorganic fertilizer can effectively control banana wilt by strong colonization withBacillussubtilisN11.PlantandSoil, 2011,344(1/2):87-97.

    [13]周小虹,陸兆新,呂鳳霞,等.Bacillussubtilisfmbj與2-脫氧葡萄糖協(xié)同作用對Rhizopusstolonifer的生物防治效果.中國農(nóng)業(yè)科學,2011,44(21):4447-4453.

    ZHOU X H, LU Z X, Lü F X,etal. Bio-control effect of combiningBacillussubtilisfmbj with 2-deoxy-D-glucose onRhizopusstolonifer.ScientiaAgriculturaSinica, 2011,44(21):4447-4453. (in Chinese with English abstract)

    [14]黃曦,許蘭蘭,黃榮韶,等.枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進展.生物技術通報,2010(1):24-29.

    HUANG X, XU L L, HUANG R S,etal. Research advance in controlling plant diseases byBacillussubtilis.BiotechnologyBulletin, 2010(1):24-29. (in Chinese with English abstract)

    [15]王宇,趙述淼,胡詠梅,等.幾種微生物及其組合在豬糞堆肥發(fā)酵中的作用.湖北農(nóng)業(yè)科學,2009,48(1):81-84.

    WANG Y, ZHAO S M, HU Y M,etal. Effects of microbe and microbe combinations in pig excrement compost.HubeiAgriculturalSciences, 2009,48(1):81-84. (in Chinese with English abstract)

    [16]LI T Y, LIU L, WEI X H,etal. Comparison of the food waste degradation rate and microbial community in the matrix between two biodegradation agents in a food waste disposer.WasteManagement, 2014,34(12):2641-2646.

    [17]LIU L, LI T Y, WEI X H,etal. Effects of a nutrient additive on the density of functional bacteria and the microbial community structure of bioorganic fertilizer.BioresourceTechnology, 2014,172:328-334.

    [18]黃宇,孫寶盛,孫井梅,等.枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的研究.河南科學,2007,25(1):70-72.

    HUANG Y, SUN B S, SUN J M,etal. Study on fermentation conditions ofBacillussubtilis.HenanScience, 2007,25(1):70-72. (in Chinese with English abstract)

    [19]孫笑非,孫鳴.一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化.飼料研究,2009(2):68-69.

    SUN X F, SUN M. Optimization of aBacillussubtilisstrain fermentation medium.FeedResearch, 2009(2):68-69. (in Chinese)

    [20]羅璋,陳昌福,白曉慧,等.枯草芽孢桿菌BHI344培養(yǎng)條件的優(yōu)化.中國飼料,2007(10):41-43.

    LUO Z, CHEN C F, BAI X H,etal. Study on the optimization ofBacillussubtilisBHI344 culturing conditions.ChinaFeed, 2007(10):41-43. (in Chinese with English abstract)

    [21]曹亮亮,王康,馬婧,等.酸解羽毛粉代替蛋白胨研制新型細菌培養(yǎng)基.微生物學通報,2014,41(11):2353-2361.

    CAO L L, WANG K, MA J,etal. Using hydrolyzed feather powder to replace tryptone for producing a novel bacterial medium.MicrobiologyChina, 2014,41(11):2353-2361. (in Chinese with English abstract)

    [22]魯小城,趙宇華,方萍.枯草芽孢桿菌F-2抗植物病原真菌活性物質(zhì)的研究.浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版),2007,33(1):34-39.

    LU X C, ZHAO Y H, FANG P. Study on antifungal active substance ofBacillussubtilisF-2.JournalofZhejiangUniversity(AgricultureandLifeSciences), 2007,33(1):34-39. (in Chinese with English abstract)

    [23]國家環(huán)境保護局.城鎮(zhèn)垃圾農(nóng)用控制標準:GB 8172—1987.北京:中國標準出版社,1987.

    National Environmental Protection Agency.ControlStandardsforUrbanWastesforAgriculturalUse: GB 8172—1987. Beijing: Standards Press of China, 1987. (in Chinese)

    [24]和文祥,洪堅平.環(huán)境微生物學.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2007:80-84,327-333.

    HE W X, HONG J P.EnvironmentalMicrobiology. Beijing: China Agricultural University Press, 2007:80-84,327-333. (in Chinese)

    [25]TANG Q Y, ZHANG C X. Data Processing System (DPS) software with experimental design, statistical analysis and data mining developed for use in entomological research.InsectScience, 2013,20(2):254-260.

    [26]趙瑞.枯草芽孢桿菌TU100的發(fā)酵條件以及抗菌物質(zhì)的研究.武漢:中國農(nóng)業(yè)科學院,2006:18-25.

    ZHAO R. Studies on fermentation conditions and antibiotic substance ofBacillusSubtilisTU100. Wuhan: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2006:18-25. (in Chinese with English abstract)

    Optimization of a culture medium for Bacillus subtilis based on monosodium glutamate wastewater.JournalofZhejiangUniversity(Agric. &LifeSci.), 2016,42(4):485-494

    LIU Li1,2, ZENG Zhen1, FANG Ping1,3*

    (1.KeyLaboratoryofEnvironmentRemediationandEcologicalHealthoftheMinistryofEducation,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2.DepartmentofAgriculturalResourceandEnvironment,CollegeofAgriculture,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 3.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofSubtropicalSoilandPlantNutrition,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

    concentrated monosodium glutamate wastewater (CMGW);Bacillussubtilis; orthogonal experiment design; medium optimization; amino acid

    國家自然科學基金(31272242);國家水體污染防治與治理重大專項(2014ZX07101-012);貴州大學引進人才科研項目(貴大人基合字[2015]010號).

    Corresponding author):方萍(http://orcid.org/0000-0001-7784-7873),Tel:+86-571-88982480,E-mail:pfang@zju.edu.cn

    聯(lián)系方式:劉麗(http://orcid.org/0000-0002-4210-7450),E-mail:liuliz706@sina.com

    2015-08-29;接受日期(Accepted):2016-01-13;網(wǎng)絡出版日期(Published online):2016-07-18

    TQ 920.6; X 703

    A

    URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160718.2034.012.html

    猜你喜歡
    味精枯草活菌
    味精究竟是不是“害人精”?
    中老年保健(2022年4期)2022-08-22 03:00:40
    枯草芽孢桿菌在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的應用
    湖南飼料(2021年4期)2021-10-13 07:32:46
    運用OD值法快速進行乳酸菌活菌計數(shù)的研究
    歲末
    揚子江(2019年3期)2019-05-24 14:23:10
    雙歧三聯(lián)活菌聯(lián)合硝苯地平治療腹瀉型腸易激綜合征的臨床效果
    味精有毒論不可信
    雙歧桿菌三聯(lián)活菌聯(lián)合多潘立酮治療新生兒喂養(yǎng)不耐受40例
    美沙拉嗪聯(lián)合枯草桿菌二聯(lián)活菌治療潰瘍性結腸炎的療效分析
    下次再說,永不再來
    感恩的心
    最近最新免费中文字幕在线| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 熟女电影av网| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲真实伦在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 精品不卡国产一区二区三区| 看片在线看免费视频| av黄色大香蕉| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av熟女| 久久久久久大精品| 久久亚洲精品不卡| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲熟妇熟女久久| 啦啦啦免费观看视频1| av在线蜜桃| 成年版毛片免费区| 午夜久久久久精精品| 色视频www国产| 久久久国产成人免费| 亚洲av熟女| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线免费观看的www视频| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产成人影院久久av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜免费成人在线视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| www国产在线视频色| 久久久久久久精品吃奶| 淫秽高清视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99热只有精品国产| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线免费观看不下载黄p国产 | 日韩国内少妇激情av| h日本视频在线播放| 香蕉久久夜色| 99久久成人亚洲精品观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久人妻av系列| 久久久色成人| 丝袜美腿在线中文| 超碰av人人做人人爽久久 | 日韩欧美精品免费久久 | 淫秽高清视频在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 悠悠久久av| 国产精品99久久99久久久不卡| 成人永久免费在线观看视频| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av成人精品一区久久| 人妻久久中文字幕网| 国产日本99.免费观看| 久久久色成人| 欧美成人a在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产成人欧美在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 91久久精品国产一区二区成人 | 夜夜爽天天搞| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国语自产精品视频在线第100页| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品一区二区免费欧美| 91麻豆av在线| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美性感艳星| 一二三四社区在线视频社区8| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产乱人视频| 在线a可以看的网站| 国产精品久久久久久精品电影| 成人精品一区二区免费| 日本一本二区三区精品| 黄色丝袜av网址大全| 成人亚洲精品av一区二区| 国产97色在线日韩免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品久久视频播放| 亚洲av一区综合| 嫩草影院入口| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲av成人av| 在线免费观看的www视频| 久久久成人免费电影| 精华霜和精华液先用哪个| 久久精品人妻少妇| 精品国产亚洲在线| 国产视频一区二区在线看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成人无遮挡网站| 97超视频在线观看视频| 久久99热这里只有精品18| avwww免费| 国产精品一及| avwww免费| 少妇丰满av| 亚洲国产精品sss在线观看| 色在线成人网| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 在线观看66精品国产| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品99久久99久久久不卡| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 又紧又爽又黄一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费无遮挡裸体视频| 成年版毛片免费区| 色老头精品视频在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线国产一区二区在线| 在线国产一区二区在线| 亚洲国产欧美网| 99久久精品一区二区三区| 国产精品野战在线观看| 成人欧美大片| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产激情偷乱视频一区二区| 成人一区二区视频在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 真实男女啪啪啪动态图| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 国产激情欧美一区二区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 男女那种视频在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲国产欧美网| 国产精品98久久久久久宅男小说| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 丁香欧美五月| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99热只有精品国产| 综合色av麻豆| 两个人视频免费观看高清| 精品熟女少妇八av免费久了| 三级毛片av免费| 免费在线观看亚洲国产| 精品久久久久久成人av| 国产高清三级在线| 在线国产一区二区在线| www日本在线高清视频| av福利片在线观看| 日本黄大片高清| 在线观看av片永久免费下载| 欧美日本亚洲视频在线播放| 美女大奶头视频| 国产不卡一卡二| 深夜精品福利| 国产精品日韩av在线免费观看| av在线天堂中文字幕| 免费大片18禁| 国模一区二区三区四区视频| 久9热在线精品视频| 国产视频内射| 精品午夜福利视频在线观看一区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产色婷婷99| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 人人妻人人看人人澡| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费av不卡在线播放| 精品一区二区三区人妻视频| 国产av在哪里看| 亚洲成人精品中文字幕电影| www日本黄色视频网| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 有码 亚洲区| 亚洲内射少妇av| 免费观看人在逋| 成人午夜高清在线视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 黄片大片在线免费观看| 一级黄片播放器| 99久国产av精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 婷婷精品国产亚洲av| 国产一区在线观看成人免费| 最新中文字幕久久久久| 有码 亚洲区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产淫片久久久久久久久 | 男女下面进入的视频免费午夜| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩亚洲欧美综合| 制服人妻中文乱码| 久久久久免费精品人妻一区二区| av福利片在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲,欧美精品.| 18禁美女被吸乳视频| 俺也久久电影网| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 18禁国产床啪视频网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 一本久久中文字幕| 中出人妻视频一区二区| 国产激情欧美一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 啦啦啦免费观看视频1| 少妇丰满av| 综合色av麻豆| 黄片大片在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 精品久久久久久成人av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 麻豆成人av在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 草草在线视频免费看| 露出奶头的视频| 十八禁人妻一区二区| 免费在线观看成人毛片| 国产精品永久免费网站| 国产色婷婷99| 黄色成人免费大全| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲激情在线av| 性色avwww在线观看| 亚洲不卡免费看| 久久久久久久久中文| 熟女电影av网| 亚洲美女视频黄频| 舔av片在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产单亲对白刺激| 真人做人爱边吃奶动态| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲精品在线美女| 欧美在线黄色| 99在线人妻在线中文字幕| 啪啪无遮挡十八禁网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| h日本视频在线播放| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美午夜高清在线| 亚洲国产精品成人综合色| 天堂影院成人在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲一区二区三区色噜噜| 色噜噜av男人的天堂激情| 舔av片在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 在线观看av片永久免费下载| 亚洲18禁久久av| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美黑人巨大hd| www国产在线视频色| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 十八禁人妻一区二区| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| av视频在线观看入口| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产三级中文精品| 露出奶头的视频| 欧美日韩乱码在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人欧美大片| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜a级毛片| 成人午夜高清在线视频| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲人成网站高清观看| 国内精品久久久久精免费| 在线a可以看的网站| 国产av在哪里看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 最新中文字幕久久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美乱妇无乱码| 国产久久久一区二区三区| 搞女人的毛片| 精品电影一区二区在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 嫩草影院入口| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产欧美日韩精品一区二区| 91字幕亚洲| 久久久精品欧美日韩精品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 五月伊人婷婷丁香| 听说在线观看完整版免费高清| 精品欧美国产一区二区三| 少妇的丰满在线观看| 免费在线观看日本一区| 久久精品91蜜桃| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美一区二区亚洲| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产色婷婷99| 我的老师免费观看完整版| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲七黄色美女视频| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 少妇丰满av| 日韩av在线大香蕉| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品亚洲美女久久久| av天堂在线播放| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 色av中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 黄片大片在线免费观看| 国产高清videossex| 精品福利观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 我要搜黄色片| 桃色一区二区三区在线观看| 久久久久久久久中文| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产亚洲欧美在线一区二区| 毛片女人毛片| 精品国内亚洲2022精品成人| 三级国产精品欧美在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| www.www免费av| 亚洲人成网站高清观看| 国产午夜福利久久久久久| 深夜精品福利| 真人一进一出gif抽搐免费| 一级毛片女人18水好多| 精品一区二区三区人妻视频| 少妇的逼好多水| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜福利在线在线| 极品教师在线免费播放| 欧美3d第一页| 欧美精品啪啪一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 中国美女看黄片| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品,欧美在线| 久久久久九九精品影院| 日本一本二区三区精品| 欧美日韩黄片免| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 岛国视频午夜一区免费看| 精品欧美国产一区二区三| 国产激情偷乱视频一区二区| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲无线在线观看| 午夜激情欧美在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产三级在线视频| 国产精品精品国产色婷婷| 女人被狂操c到高潮| 国产精品国产高清国产av| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本 欧美在线| 九色国产91popny在线| 日本黄大片高清| 听说在线观看完整版免费高清| 久久草成人影院| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久久国产成人精品二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品一及| 成年人黄色毛片网站| av专区在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲av熟女| 黄色丝袜av网址大全| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲国产欧美人成| 99久久综合精品五月天人人| h日本视频在线播放| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 啦啦啦免费观看视频1| 久久亚洲真实| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲成人久久性| 极品教师在线免费播放| 国产精品久久电影中文字幕| 女同久久另类99精品国产91| 国产三级黄色录像| 最新在线观看一区二区三区| 嫩草影视91久久| 亚洲无线在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品久久久久久久电影 | 观看免费一级毛片| 亚洲专区中文字幕在线| 91在线精品国自产拍蜜月 | 色噜噜av男人的天堂激情| 久久性视频一级片| 中文字幕av在线有码专区| 一a级毛片在线观看| 一本一本综合久久| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品人妻1区二区| 久久久久久久午夜电影| 女人被狂操c到高潮| 窝窝影院91人妻| 无遮挡黄片免费观看| 夜夜爽天天搞| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产成人系列免费观看| 男插女下体视频免费在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 桃红色精品国产亚洲av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲成人精品中文字幕电影| 高清毛片免费观看视频网站| 韩国av一区二区三区四区| 色吧在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩精品中文字幕看吧| 99精品欧美一区二区三区四区| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲av免费高清在线观看| 精品日产1卡2卡| 久久久久久人人人人人| 搡老妇女老女人老熟妇| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产高清视频在线播放一区| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 男人舔奶头视频| 黄片大片在线免费观看| 国产熟女xx| 久久这里只有精品中国| 在线免费观看不下载黄p国产 | 男女之事视频高清在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产一区在线观看成人免费| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 99在线人妻在线中文字幕| 在线看三级毛片| 久久精品91蜜桃| 一夜夜www| 成人欧美大片| 99久久精品热视频| 久久久久性生活片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产综合懂色| 免费看a级黄色片| 给我免费播放毛片高清在线观看| 特级一级黄色大片| 哪里可以看免费的av片| 日韩欧美在线二视频| 亚洲精品在线观看二区| 午夜免费激情av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费高清视频大片| 精品日产1卡2卡| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 在线观看午夜福利视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产单亲对白刺激| 精品电影一区二区在线| 丝袜美腿在线中文| 看黄色毛片网站| 亚洲av免费在线观看| www国产在线视频色| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品久久视频播放| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品,欧美在线| 少妇的丰满在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 一区二区三区免费毛片| 成人精品一区二区免费| 88av欧美| 欧美中文综合在线视频| 波多野结衣高清无吗| 久久久色成人| 欧美日韩综合久久久久久 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品久久久久久精品电影| 久久久国产成人精品二区| 在线观看av片永久免费下载| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品福利观看| 天天添夜夜摸| 天堂网av新在线| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99国产综合亚洲精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 97超视频在线观看视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 老司机午夜十八禁免费视频| ponron亚洲| 欧美色视频一区免费| 亚洲中文字幕日韩| 免费看十八禁软件| 国语自产精品视频在线第100页| 男女之事视频高清在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 舔av片在线| 亚洲国产欧美网| 国产三级黄色录像| 看片在线看免费视频| 长腿黑丝高跟| 亚洲在线观看片| 国产私拍福利视频在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 精品午夜福利视频在线观看一区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美乱妇无乱码| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲中文字幕日韩| 日韩欧美免费精品| 韩国av一区二区三区四区| 黄色视频,在线免费观看| 色综合婷婷激情| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产探花在线观看一区二区| 免费高清视频大片| 免费观看精品视频网站| 哪里可以看免费的av片| 可以在线观看毛片的网站| 少妇的逼好多水| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产一区二区在线av高清观看| 怎么达到女性高潮| 天堂动漫精品| 中文字幕久久专区| 亚洲18禁久久av| 美女被艹到高潮喷水动态| 丰满乱子伦码专区| 香蕉久久夜色| 午夜福利免费观看在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 18禁国产床啪视频网站| xxx96com| 日本精品一区二区三区蜜桃| 看免费av毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 日日夜夜操网爽| 国产三级黄色录像| 久久久久久久久中文| 黄色视频,在线免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 两个人视频免费观看高清| 99久久九九国产精品国产免费| 色播亚洲综合网| av天堂中文字幕网| 男插女下体视频免费在线播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美乱妇无乱码| 亚洲成人久久性| 1024手机看黄色片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 可以在线观看的亚洲视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 女人被狂操c到高潮| 久久精品国产自在天天线| 99久久成人亚洲精品观看| 久久亚洲精品不卡| 国产高清videossex| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人精品一区二区免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲午夜理论影院| 天美传媒精品一区二区|