3種方法在診斷結(jié)核性胸膜炎中的價值

鄭立恒，柳曉金，劉　會，張曉光

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050041；2.河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050021；3.河北省胸科醫(yī)院結(jié)核科，河北 石家莊 050041；4.河北省胸科醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050041)

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·論著·

3種方法在診斷結(jié)核性胸膜炎中的價值

鄭立恒1，柳曉金2，劉會3，張曉光4*

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050041；2.河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050021；3.河北省胸科醫(yī)院結(jié)核科，河北 石家莊 050041；4.河北省胸科醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050041)

[摘要]目的評價胸水Xpert MTB/RIF系統(tǒng)、腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)活性檢測和外周血結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價值。方法回顧性分析河北省胸科醫(yī)院確診的109例結(jié)核性胸膜炎患者的胸水Xpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測結(jié)果、ADA活性以及外周血T-SPOT.TB檢查結(jié)果。結(jié)果Xpert MTB/RIF系統(tǒng)與ADA活性檢測法、T-SPOT.TB法、ADA活性檢測聯(lián)合T-SPOT.TB法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但ADA活性檢測法、T-SPOT.TB法、ADA活性檢測聯(lián)合T-SPOT.TB法三者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論由于結(jié)核性胸水多為刺激產(chǎn)生，含有結(jié)核分枝桿菌的胸水很少，Xpert MTB/RIF系統(tǒng)應(yīng)用在胸水檢測中陽性率低，對結(jié)核性胸膜炎的診斷意義有限；ADA活性和T-SPOT.TB檢測陽性率高，聯(lián)合檢測診斷效果更好，對結(jié)核性胸膜炎有重要的輔助診斷價值。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核，胸膜；胸水；診斷

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.020

結(jié)核病是全世界都在關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，中國在22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中排名第二，僅次于印度，每年新發(fā)病例大約占全球總數(shù)的14.3%[1]。結(jié)核性胸膜炎是一種常見疾病，是由于結(jié)核分枝桿菌直接感染和(或)胸膜對結(jié)核分枝桿菌菌體成分產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[2]，常合并有胸水增多。由于胸水產(chǎn)生多數(shù)是由刺激產(chǎn)生，其中并不含有結(jié)核菌，即使有菌進(jìn)入胸膜腔其在胸水中的濃度也很低，所以離心涂片抗酸染色和培養(yǎng)陽性率均不高。非病原學(xué)的腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)[3]和結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)[4-5]檢測陽性率較病原學(xué)檢測敏感度明顯提高。隨著診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，Xpert MTB/RIF系統(tǒng)的出現(xiàn)受到結(jié)核病界的廣泛關(guān)注，Boehme等[6]報(bào)道該技術(shù)敏感度與特異度均高、省時、操作簡便、應(yīng)用前景好，此技術(shù)在常見的痰標(biāo)本中研究最多，胸水的檢測報(bào)道很少。本研究將河北省胸科醫(yī)院109例確診的結(jié)核性胸膜炎患者的胸水Xpert MTB/RIF系統(tǒng)和ADA活性檢測以及外周血T-SPOT.TB的檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年1—12月在河北省胸科醫(yī)院住院確診的結(jié)核性胸膜炎患者109例為研究對象，男性68例(62.39%)，女性41例(37.61%)，年齡18～79歲，平均(37.08±12.27)歲。結(jié)核性胸膜炎診斷符合以下標(biāo)準(zhǔn)：胸水找到、培養(yǎng)出抗酸桿菌，或TBDNA陽性，或胸膜、胸腔鏡組織病理檢查結(jié)果符合結(jié)核病理改變。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲；②有典型的結(jié)核中毒癥狀；③胸水白細(xì)胞分類以淋巴細(xì)胞為主；④胸水蛋白/血清蛋白>0.5；⑤胸水結(jié)核抗體陽性；⑥胸水ADA>45 U/L。 以上6 項(xiàng)符合3 項(xiàng)以上排除其他原因引起的胸腔積液，且診斷性抗結(jié)核治療有效即確診。

1.2儀器和試劑Xpert MTB/RIF檢測儀及試劑盒(美國Cepheid公司)；ADA試劑盒(寧波美康公司)；T-SPOT.TB試劑盒(英國Oxford Immunotec Ltd.)。

1.3方法

1.3.1Xpert MTB/RIF檢測胸水標(biāo)本中加入消化液，使其與胸水比例為1∶1(V/V)，擰緊試管蓋子，劇烈搖動數(shù)次。室溫放置15 min，待標(biāo)本中無肉眼可見塊狀物時，吸取2 mL加入Xpert MTB/RIF反應(yīng)試劑盒中，然后將其放入4通道Gene Xpert平臺中自動運(yùn)行，2 h以后，查看系統(tǒng)上顯示的結(jié)核菌檢測結(jié)果。詳細(xì)過程參考說明書。

1.3.2ADA活性檢測取5 mL胸水離心后取上清，應(yīng)用奧林巴斯Au5400型生化分析儀進(jìn)行檢測(速率法)，ADA>45 U/L 時，考慮為結(jié)核性胸膜炎，記為陽性[7]。

1.3.3T-SPOT.TB檢測肝素鈉抗凝管采集患者外周血5～6 mL，加入淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，用AIM-V培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×106/mL。在已包被抗γ干擾素單抗的微孔板上，由上至下4個孔中分別加入50 μL植物血凝素作為陽性對照孔，50 μL ESAT-6抗原作為A孔，50 μL CFP-10抗原作為B孔，加入50 μL AIM-V培養(yǎng)液作為陰性對照。最后在各孔加入100 μL稀釋好的單個核細(xì)胞，將培養(yǎng)板放入37 ℃孵箱16～20 h，用PBS洗板4次，加入標(biāo)記的二抗后，在2～8 ℃放置1 h，再用PBS洗板4次，加底物常溫避光條件下顯色7 min，蒸餾水終止反應(yīng)。陽性結(jié)果判斷：①空白對照斑點(diǎn)數(shù)≤5個，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)減空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6；②空白對照斑點(diǎn)數(shù)≥6，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性孔[8]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

109例胸水中，Xpert MTB/RIF系統(tǒng)與ADA活性檢測法、T-SPOT.TB法、ADA活性檢測聯(lián)合T-SPOT.TB法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但ADA活性檢測法、T-SPOT.TB法、ADA活性檢測聯(lián)合T-SPOT.TB法三者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1　4種方法檢測結(jié)果比較Table 1　Comparison of detection results of 4 methods　(n=109，例數(shù)，%)

*P<0.05與Xpert MTB/RIF系統(tǒng)法比較(χ2檢驗(yàn))

3　討　　論

胸水病因復(fù)雜，滲出性胸水多為結(jié)核菌和腫瘤引起，但是臨床無特異性表現(xiàn)，確診困難，結(jié)核性胸膜炎的早期診斷和治療對患者的預(yù)后非常重要。胸水抗酸染色和培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌是診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)，但是找到病原菌十分困難，抗酸染色敏感度不高，有研究顯示結(jié)核性胸腔積液結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)及染色陽性率僅為10%[9]，而培養(yǎng)不但時間長陽性率也不高。其主要原因不只是胸水中的結(jié)核菌難以檢出，更重要的是大多數(shù)情況胸水中就不含有結(jié)核菌，其產(chǎn)生是由于結(jié)核菌的代謝產(chǎn)物或炎癥因子刺激，還有即使有結(jié)核菌進(jìn)入胸水中，其含量低，胸水量大，進(jìn)一步對結(jié)核菌進(jìn)行了稀釋，現(xiàn)有方法學(xué)的局限性使其不易檢出，或者形成膿性胸水，標(biāo)本處理和質(zhì)控困難，也不容易檢測出來。

Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)是一種采用巢式PCR技術(shù)，可在2 h左右檢測結(jié)核菌的自動化、全封閉檢測平臺[10]。巢式PCR的應(yīng)用使檢測敏感度提高了2～3個數(shù)量級，也減少了非特異性擴(kuò)增。近幾年，Xpert MTB/RIF系統(tǒng)應(yīng)用于痰、灌洗液、腦脊液、膿液等各種臨床標(biāo)本，檢出時間只需2 h左右，檢測在密閉系統(tǒng)中自動完成，快速、簡便、沒有生物安全的風(fēng)險，成為WHO推薦使用的診斷技術(shù)[11-12]。本研究回顧分析應(yīng)用Xpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測確診結(jié)核性胸膜炎患者的胸水，其陽性率只有2.75%，分析其原因仍是胸水多為刺激產(chǎn)生，含有結(jié)核菌的胸水是很少的，從病原學(xué)診斷結(jié)核性胸膜炎很困難。

ADA是嘌呤核苷代謝中的一種酶，在淋巴細(xì)胞中的含量較高，是紅細(xì)胞的10倍。當(dāng)患結(jié)核性胸膜炎時,因免疫系統(tǒng)受到刺激，淋巴細(xì)胞增多明顯,故胸水中ADA含量增高。ADA活性檢測對結(jié)核性胸膜炎有重要診斷價值，常ADA>45 U/L，而狼瘡性胸腔積液、惡性胸水以及由肝硬化所致的胸水ADA活性僅有輕度增高。特殊情況是，當(dāng)艾滋病患者同時患結(jié)核性胸膜炎時，由于免疫系統(tǒng)的缺陷，受到刺激后淋巴細(xì)胞的反應(yīng)能力減弱，胸水中的ADA活性可能沒有明顯升高，也有個別的惡性胸水ADA升高顯著。本研究中ADA>45 U/L的患者達(dá)到72.48%，其陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Xpert MTB/RIF系統(tǒng)的檢出率，可見從生物化學(xué)的角度診斷結(jié)核性胸膜炎效果更好。

T-SPOT是一種γ干擾素釋放試驗(yàn)分析技術(shù)，其原理是結(jié)核菌感染者的血液和感染部位的體液中有結(jié)核菌特異效應(yīng)T細(xì)胞，這些細(xì)胞受到結(jié)核菌特異抗原刺激后可分泌γ干擾素，常用的抗原為ESAT-6和CFP-10，它們是結(jié)核菌所特有，而其他分枝桿菌及卡介菌沒有,因此此技術(shù)敏感度和特異度較高,具有快速、高效、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，并且不受BCG接種的影響。本研究結(jié)果顯示全血T-SPOT.TB診斷診斷結(jié)核性胸膜炎的陽性率為79.82%，明顯高于Xpert MTB/RIF系統(tǒng)的檢出率；ADA活性檢測聯(lián)合T-SPOT.TB法陽性率為87.16%，比一種方法的檢出率又有所提高，但與ADA活性檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，雖然Xpert MTB/RIF系統(tǒng)在其他標(biāo)本的檢測中效果很好，但由于胸水產(chǎn)生的原因多屬非結(jié)核菌進(jìn)入胸膜腔，應(yīng)用此技術(shù)效果不理想，用于診斷結(jié)核性胸膜炎意義不大，而通過非檢測病原菌的ADA活性檢測和T-SPOT.TB法陽性率高，2種方法聯(lián)合檢測效果更好，具有更高的輔助診斷價值。

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(本文編輯：劉斯靜)

[收稿日期]2015-09-11；[修回日期]2016-03-07

[作者簡介]鄭立恒(1979-)男，河北辛集人，河北省胸科醫(yī)院主管檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗(yàn)學(xué)研究。 *通訊作者。E-mail：64440878@qq.com

[中圖分類號]R521.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)07-0822-04

Value analysis of 3 methods in the diagnosis of tuberculous pleurisy

ZHENG Li-heng1， LIU Xiao-jin2, LIU Hui3， ZHANG Xiao-guang4*

(1.Department of Clinical Laboratory， Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041， China；2.Department of Clinical Laboratory， the Fifth Hospital of Shijiazhuang City， Hebei Province，Shijiazhuang 056000, China； 3.Department of Internal Medicine， Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041， China； 4.Department of Tuberculosis， Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041， China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the clinical value of Xpert MTB/RIF assay, level of adenosine deaminase(ADA)method and T-SPOT.TB method in diagnosis of tuberculous pleurisy. MethodsA total of 109 patients with tuberculous pleurisy were enrolled in this retrospective study, and their pleural effusion were given Xpert MTB/RIF assay and the levels of ADA were measured. The whole blood was detected by T-SPOT.TB method. ResultsThere were significant differences in MTB/RIF Xpert system and ADA activity detection method, T-SPOT.TB method, ADA activity detection combined T-SPOT.TB method(P<0.05). There were significant differences inADA activity assay, T-SPOT.TB assay, ADA activity assay combined with T-SPOT.TB method(P>0.05). ConclusionBecause the tuberculous pleural effusion is stimulated and mycobacterium tuberculosis contains very little pleural effusion, the positive rate of the application of Xpert MTB/RIF system in hydrothorax detection is low, the significance in the diagnosis of tuberculous pleurisy by this method is limited. The positive rate of ADA activity and T-SPOT. TB test is high, and the joint detection and diagnosis effect is better, indicating ADA activity and T-SPOT. TB test are valuable methods in diagnosis of tuberculous pleurisy.

[Key words]tuberculosis, pleural； hydrothorax； diagnosis