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    不同納米材料作為基因載體的效率比較

    2016-08-11 23:03:37董亞賢堯慧燕梁兵鐘高賢刁芳明
    中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥 2016年20期
    關(guān)鍵詞:納米材料毒性質(zhì)粒

    董亞賢+堯慧燕+梁兵+鐘高賢+刁芳明+石紅婷

    【摘要】 目的 比較不同靶向納米材料作為基因載體的細(xì)胞毒性大小及其轉(zhuǎn)染效率。方法 以聚乙烯亞胺(PEI)為對(duì)照, 化學(xué)合成髓鞘堿性蛋白68-86(MBP68-86)-多聚賴氨酸(PLL)-聚乙烯亞胺-聚乙二醇(PEG)接枝支化特異性配體乳鐵蛋白 (Lf)及PLL-PEI-PEG, 并采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性, 倒置顯微鏡熒光觀察法和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf細(xì)胞毒性比PLL-PEI-PEG及PEI低, 三組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的轉(zhuǎn)染效率為(41.8±0.9)%;PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的轉(zhuǎn)染效率為(28.4±1.1)%;PEI/pAAV-EGFP 為的轉(zhuǎn)染效率(20.5±1.2)%, 兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG可作為基因轉(zhuǎn)染的傳輸載體, 其中MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf最好。

    【關(guān)鍵詞】 納米材料; MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf;基因載體;PLL-PEI-PEG

    DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.193

    目前所有的基因治療研究領(lǐng)域, 都存在轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染效率、定向性、可控性、安全性等方面的不足[1]。而納米載體憑借其低毒、高效負(fù)載等優(yōu)點(diǎn)在基因治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。作者前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功合成并驗(yàn)證了PLL-PEI-PEG[2] 。因此, 本文在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上合MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf, 并在體外比較不同新型靶向納米材料的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率, 以篩選出更加高效、低毒和高靶向性的基因載體, 為神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療帶來(lái)新的希望。

    1 材料與方法

    1. 1 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) 大鼠單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司, 由本實(shí)驗(yàn)室保存。采用加有10% 胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    1. 2 PLL-PEI-PEG-Lf/MBP68-86的制備 MBP68-86用Traut試劑硫酸化后再與納米材料以分子比4∶1混合, 在室溫下反應(yīng)1h, 去除過剩的MBP68-86。

    1. 3 質(zhì)粒DNA(pDNA)的制備 質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增, 然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取純化。得到的質(zhì)粒通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度。檢測(cè)合格的質(zhì)粒保存于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1. 4 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備 在Eppendorf管中, 將1 μg pDNA稀釋在50 μl不含F(xiàn)BS的DMEM中, 振蕩均勻, 按不同N/P比把相應(yīng)量的納米材料加入到另外一管裝有50 μl不含F(xiàn)BS的DMEM的Eppendorf管中, 然后把兩溶液在室溫下振蕩5min得到均勻復(fù)合物。

    1. 5 細(xì)胞毒性 采用四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性, 具體方法參見文獻(xiàn)[2]。

    1. 6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 采用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果, 并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率, 具體轉(zhuǎn)染過程及檢測(cè)方法參見文獻(xiàn)[2]。

    1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2. 1 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果 采用MTT檢測(cè)細(xì)胞毒性。當(dāng)N/P<10時(shí), 三種納米材料載體的細(xì)胞存活率都>80%;在N/P=15時(shí), MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP為78%, PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP為63%, 比PEI/pAAV-EGFP的細(xì)胞存活率(52%)要高, 兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);N/P<15時(shí), MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP和PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的存活率相當(dāng), 但兩者比PEI25kD/pAAV-

    EGFP要高, 只是在N/P>15時(shí)MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP的細(xì)胞存活率才比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP低, 兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    納米材料形成復(fù)合物后在PBMC細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。見圖1。

    2. 2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

    2. 2. 1 倒置熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果 采用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果, 發(fā)現(xiàn)在N/P=15時(shí)載體綠色熒光蛋白表達(dá)量最多, 同時(shí)MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的細(xì)胞熒光表達(dá)效果比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP要好。

    2. 2. 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果 本實(shí)驗(yàn)還利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了N/P=15時(shí)三種納米材料的轉(zhuǎn)染效率, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的轉(zhuǎn)染效率為(41.8±0.9)%;PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的轉(zhuǎn)染效率為(28.4±1.1)%;PEI/pAAV-EGFP 為的轉(zhuǎn)染效率(20.5±1.2)%, 兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討論

    新型納米材料作為基因載體具有良好的安全性和生物相容性[3]。近來(lái)許多實(shí)驗(yàn)[4, 5]通過改變陽(yáng)離子聚合物的結(jié)構(gòu)或?qū)ζ溥M(jìn)行化學(xué)修飾而降低毒性, 并實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率。在以前的工作中, 作者已經(jīng)成功合成并驗(yàn)證了靶向、高效及可降解型PLL-PEI-PEG基因載體, 并作了相關(guān)的報(bào)道[2]。由于乳鐵蛋白(Lf)可通過受體介導(dǎo)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通過血腦屏障??紤]到這一點(diǎn), 作者擬將Lf主要結(jié)構(gòu)序列連接到PEG末端, 從而使這種納米材料PLL-PEI-PEG-Lf可通過跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦組織。雖因PLL-PEI-PEG-Lf可透過血腦屏障進(jìn)入腦組織, 但對(duì)腦的不同組織并無(wú)特異性。因此本實(shí)驗(yàn)在PEG的基礎(chǔ)上加以MBP68-86修飾, 使新的載體同時(shí)具備血腦屏障穿透性和活化的免疫細(xì)胞靶向性。

    同樣用量的時(shí)候MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的毒性最低?;蜉d體除了應(yīng)具有較低的毒性, 較高的轉(zhuǎn)染效率也非常關(guān)鍵。MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的轉(zhuǎn)染效果較PLL-PEI-PEG及PEI好, 另外流式細(xì)胞儀檢測(cè)也證實(shí)了同樣的結(jié)果。由此可以得出MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作為基因傳輸載體較好。

    綜上所述, MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG都可作為基因傳輸?shù)妮d體, 但由于MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作為PLL-PEI-PEG的改進(jìn)品, 各方面的性能都優(yōu)于PLL-PEI-PEG, 因此具有更高的可塑性和價(jià)值。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 梁兵, 袁芳, 楊寧, 等. 3種不同類型基因?qū)胂到y(tǒng)轉(zhuǎn)染類神經(jīng)元細(xì)胞的效率比較.重慶醫(yī)學(xué), 2012, 41(18):1792-1798.

    [2] 董亞賢, 石紅婷, 梁兵, 等. 新型靶向納米材料作為基因載體的評(píng)估. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2015, 42(13):2405-2408.

    [3] 梁兵, 袁芳, 殷建瑞, 等. 納米材料PEG-PEI介導(dǎo)雙基因促體外擬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用. 山東醫(yī)藥, 2012, 52(25):1-4.

    [4] 謝黎崖, 胡權(quán), 吳永良, 等.葉酸和聚乙二醇雙修飾的殼聚糖納米粒的制備及其性能表征.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2013, 30(3):284-289.

    [5] 劉文文, 王曉梅, 趙永波, 等.重組大鼠質(zhì)粒pEGFP-GDNF的構(gòu)建及真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2005, 22(2):104-106.

    [收稿日期:2016-03-31]

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