三種混合模式色譜填料色譜性能的比較

董彬彬，夏海鋒,2

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三種混合模式色譜填料色譜性能的比較

董彬彬1，夏海鋒1,2

（1江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

摘要:以γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷為中間活化劑，將3-氨基吡啶、2-巰基苯并咪唑和2-巰基-1-甲基咪唑3種雜環(huán)配基鍵合到粒徑為5 μm、孔徑為30 nm的球形硅膠上，制備3種高效疏水電荷誘導(dǎo)色譜填料。利用溶菌酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白G作為模型蛋白，考察其在3種不同配基色譜柱上的保留行為和分離行為。比較了3種不同性質(zhì)的模型蛋白在不同色譜柱上的色譜性能的異同。發(fā)現(xiàn)以2-巰基-1-甲基咪唑?yàn)榕浠纳V柱具有良好的pH控制色譜行為和良好的分離性能，初步驗(yàn)證了高效疏水電荷誘導(dǎo)色譜的分離模式及潛在應(yīng)用。

關(guān)鍵詞:生物分離；蛋白質(zhì)；高效液相色譜；疏水電荷誘導(dǎo)色譜；保留因子；分離行為

引 言

高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）是發(fā)展于20世紀(jì)60年代的一種快速、靈敏的色譜技術(shù)[1]，廣泛應(yīng)用于小分子[2-4]和大分子[5-7]等各種領(lǐng)域的分析和分離。高效液相色譜從分離模式出發(fā)可以分為高效反相色譜、高效親和色譜、高效離子交換色譜、高效體積排阻色譜等幾大類(lèi)，其中高效反相色譜運(yùn)用最為廣泛。近年來(lái)，一些與HPLC相關(guān)的新的衍生或復(fù)合技術(shù)也被逐漸發(fā)展起來(lái)，如高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用[8]、超高效液相[9]、高效液相色譜-多壁碳納米管固相萃取[10]、高效液相毛細(xì)管電泳[11]等，不僅豐富了HPLC的研究范疇，也為化合物的精細(xì)分離和分析提供了新的技術(shù)突破。盡管如此，傳統(tǒng)HPLC本身的分離模式通常為單一模式，即利用一種溶質(zhì)和固相的相互作用關(guān)系進(jìn)行幾種溶質(zhì)之間的分離，在實(shí)際應(yīng)用中，針對(duì)不同的分離對(duì)象往往需要依據(jù)其體系的理化性質(zhì)選擇不同的分離方法。

在蛋白質(zhì)色譜領(lǐng)域，混合模式色譜（mixed-mode chromatography，MMC）是近二十多年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型方法。混合模式指色譜介質(zhì)上的配基包含兩種或兩種以上的作用模式[12]，能夠與目標(biāo)生物分子發(fā)生多種相互作用，并且其功能往往具有互補(bǔ)性或協(xié)同性。在此之中，以疏水作用和電荷作用相結(jié)合的疏水電荷誘導(dǎo)色譜（hydrophobic charge-induction chromatography，HCIC）是MMC的典型代表[13]。HCIC結(jié)合了配基與蛋白質(zhì)之間的疏水或親硫作用力以及配基帶電基團(tuán)與蛋白質(zhì)之間的電荷排斥力兩種作用力，能夠依靠pH的調(diào)節(jié)進(jìn)行蛋白質(zhì)的吸附與解吸[14-15]，在抗體 IgG[16]和IgY[17]、青霉素?；D(zhuǎn)移酶[18]等親和分離中有著成功的應(yīng)用。典型的疏水電荷誘導(dǎo)配基主要有4-氨基吡啶[14]、2-巰基-1-甲基咪唑[19]、4-巰基乙基吡啶[20]、2-巰基苯并咪唑[21]等。

基于HCIC的技術(shù)特點(diǎn)，作者將疏水電荷誘導(dǎo)作用引入到高分辨率的高效液相色譜中，克服了高效液相分離模式單一的缺點(diǎn)，形成了一種疏水作用促進(jìn)吸附和電荷排斥作用協(xié)助洗脫的混合模式的新型色譜，從而利用疏水和電荷兩種作用力之間的平衡和轉(zhuǎn)換進(jìn)行不同蛋白的分離和分析。在前期工作中，鄭夢(mèng)杰等[22]以4-巰基吡啶為配基，以BSA和溶菌酶為模型蛋白對(duì)此混合模式色譜進(jìn)行了色譜行為的初步探索，基本驗(yàn)證了這種分離模式的可行性。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步拓展配基范圍，利用在常壓HCIC模式下表現(xiàn)良好的幾種典型的疏水電荷誘導(dǎo)配基，考察3-氨基吡啶、2-巰基苯并咪唑和2-巰基-1-甲基咪唑3種不同雜環(huán)化合物作為此類(lèi)配基的可能性，探索了模型蛋白在不同色譜柱的保留行為和分離行為，進(jìn)一步解釋此類(lèi)型混合模式色譜的色譜性能。

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑:硅膠微球（5 μm，30 nm，無(wú)錫加萊克色譜科技有限公司）；γ-(2,3-環(huán)氧丙氧)-丙基三甲氧基硅烷（KH560，上海耀華）；2-巰基-1-甲基咪唑、3-氨基吡啶、2-巰基苯并咪唑（阿拉丁試劑）；溶菌酶（Lys）（pI 10.8，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；牛血清蛋白（BSA）（pI 4.7，生工生物工程有限公司）；免疫球蛋白G（IgG、）（pI 7.0，由本實(shí)驗(yàn)室從牛初乳中純化獲得，HPLC純度98%）；其他試劑皆為市售分析純。

儀器:弗魯克 FLUKO 攪拌器 R30，上海京工實(shí)業(yè)有限公司；THZ-82A 水浴恒溫振蕩器，金壇市順華儀器有限公司；Agilent 1260 Infinity 液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 硅膠的預(yù)處理

將濃鹽酸和去離子水配成20%的鹽酸溶液與硅膠微球混合，將其加熱至 100℃，轉(zhuǎn)子加熱攪拌反應(yīng)回流8 h，然后用大量去離子水進(jìn)行抽濾，直到洗至中性為止，放置在110℃烘箱中烘8 h，然后置入90℃真空干燥箱中，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 硅膠的環(huán)氧活化

稱(chēng)取5.0 g預(yù)處理過(guò)的硅膠微球于250 ml三口圓底燒瓶，量取50 ml干燥的甲苯于三口燒瓶中，在N2保護(hù)下，磁力攪拌分散30 min。待到除盡空氣后，加入5 ml KH560，將溫度升至90℃，用油浴加熱回流攪拌 6 h。待反應(yīng)結(jié)束后，使用大量的甲苯和丙酮溶液洗滌，直到無(wú)黏稠物質(zhì)出現(xiàn)為止，放入 120℃烘箱中干燥過(guò)夜，然后放在干燥器中冷卻備用。

1.4 配基的偶聯(lián)

將KH560活化的硅膠微球加入到250 ml錐形瓶，加入50 ml pH 7.5的0.1 mol·L-1PBS緩沖液、5 ml二甲亞砜和 0.2 g 配基，在 40℃、轉(zhuǎn)速 180 r·min-1的條件下，反應(yīng)6 h。待反應(yīng)結(jié)束后，分別用大量的乙醇和去離子水溶液洗滌。加入 100 ml 1% 巰基甘油溶液（含pH 7.5 0.5 mol·L-1NaCl）使環(huán)氧基團(tuán)充分反應(yīng)完全，反應(yīng)2 h，反應(yīng)后用大量去離子水洗滌。35℃真空干燥12 h。2-巰基苯并咪唑和3-氨基吡啶的偶聯(lián)同按上述方法。

1.5 活化密度和偶聯(lián)密度的測(cè)定

環(huán)氧活化密度的測(cè)定采用硫代硫酸鈉法[22]。取活化后的KH560硅膠M1加入過(guò)量的1.3 mol·L-1的硫代硫酸鈉溶液，在30℃下180 r·min-1水浴搖床反應(yīng)4 h，加入兩滴酚酞指示劑，用0.01 mol·L-1的鹽酸滴定至無(wú)色，記錄下消耗鹽酸的體積V1。活化密度C1根據(jù)式（1）計(jì)算

環(huán)氧基團(tuán)與配基的偶聯(lián)密度采用酸堿滴定的方法[14]，取已偶聯(lián)的配基介質(zhì)M2，加入2.5 ml 0.1 mol·L-1的NaCl緩沖液。用0.1 mol·L-1的鹽酸溶液滴定到pH=3.8[14]，記錄消耗的鹽酸體積V2，根據(jù)式（2）計(jì)算偶聯(lián)密度C2

1.6 保留因子的測(cè)定

保留因子的測(cè)定采用等度洗脫3種蛋白BSA、溶菌酶和 IgG?？紤]到硅膠微球偶聯(lián)的配基在pH=2～8最為穩(wěn)定，因此以pH 2.2時(shí)空白硅膠微球色譜柱的保留時(shí)間作為T(mén)0，峰面積作為A0，以3種色譜柱在各個(gè)點(diǎn)的pH保留時(shí)間為T(mén)R，峰面積為AR，分別以式（3）、式（4）計(jì)算在不同的pH流動(dòng)相中時(shí)間保留因子KT和峰面積保留因子KA。

1.7 高效液相色譜條件

色譜柱:4.6 mm×250 mm（無(wú)錫加萊克色譜科技有限公司委托填裝）；檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm；流速: 0.8 ml·min-1；柱溫:30℃。保留因子測(cè)定流動(dòng)相組成:各個(gè)pH組分的0.01 mol·L-1的K2HPO4-H3PO4緩沖液（以0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH）。等度洗脫流動(dòng)相配制組成:pH 2.5 含10%乙腈的0.01 mol·L-1的K2HPO4-H3PO4緩沖液。梯度洗脫流動(dòng)相配制組成:A液為pH 4的0.01 mol·L-1的H3PO4-K2HPO4，B液為pH 2的含10%乙腈的0.01 mol·L-1的K2HPO4-H3PO4，梯度時(shí)間20 min（A液到B液），隨后恒定B液10 min。模型蛋白BSA、溶菌酶和IgG濃度均為1 mg·ml-1，進(jìn)樣量為10 μl，連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算各自的洗脫時(shí)間保留因子和峰面積保留因子。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 硅膠微球的環(huán)氧活化和偶聯(lián)

已經(jīng)在前期工作[21]中考察了 KH560進(jìn)行硅膠微球的環(huán)氧活化，活化密度主要受KH560添加量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的影響。本文以 1 ml KH560硅膠、90℃反應(yīng)6 h的條件，獲得了175 μmol·g-1的活化硅膠，在pH=7.5的PBS含10% DMSO緩沖液中，以 n(配基):n(活化環(huán)氧基團(tuán))=10:1的配比，在 180 r·min-1、最優(yōu)溫度的水浴搖床中反應(yīng)6 h，進(jìn)行3-氨基吡啶、2-巰基苯并咪唑、2-巰基-1-甲基咪唑 3種配基的偶聯(lián)，結(jié)果如表1所示。

表1　3種HPHCIC配基的偶聯(lián)條件、偶聯(lián)密度及其pKa值Table 1 Reaction condition, ligand density and pKaofthree HPHCIC ligands

圖1　3-氨基吡啶時(shí)間保留因子Fig.1 Effect of mobile phase pH on retention factor of time on 3-aminopyridine

從表中可以看出，2-巰基苯并咪唑最優(yōu)配基的密度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于3-氨基吡啶和2-巰基-1-甲基咪唑，造成這種現(xiàn)象的原因是2-巰基苯并咪唑配基的苯環(huán)使空間位阻過(guò)大，阻礙了巰基基團(tuán)與環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)，雖然升高溫度能夠使反應(yīng)速率加快，但同時(shí)也加快了水解速率。所以這雙重作用導(dǎo)致了2-巰基苯并咪唑配基密與環(huán)氧基結(jié)合的能力降低。

2.2 流動(dòng)相pH對(duì)3種蛋白的保留因子的影響

圖1～圖6分別顯示了流動(dòng)相pH對(duì)3種模型蛋白（Lys、BSA和IgG）在3種配基（3-氨基吡啶、2-巰基苯并咪唑、2-巰基-1-甲基咪唑）色譜柱上的保留因子的影響。理論上，0≤KT≤+∞，0≤KA≤1。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與配基之間無(wú)相互作用力時(shí)，KT和KA均為 0，即蛋白質(zhì)不保留；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)完全吸附于配基上，KT為+∞而KA為1，即蛋白質(zhì)完全保留。本文中pH的測(cè)定范圍為2.2～6.0，圖1、圖3和圖5（時(shí)間保留因子 KT）中沒(méi)有標(biāo)注的點(diǎn)為完全保留，其KT值為+∞；相應(yīng)地，完全保留時(shí)圖2、圖4和圖6中的KA值均為1。

圖2　3-氨基吡啶峰面積保留因子Fig.2 Effect of mobile phase pH on retention factor of mass on 3-aminopyridine

圖3　2-巰基苯并咪唑時(shí)間保留因子Fig.3 Effect of mobile phase pH on retention factor of time on 2-mercapto benzimidazole

圖4　2-巰基苯并咪唑峰面積保留因子Fig.4 Effect of mobile phase pH on retention factor of mass on 2-mercapto benzimidazole

圖5　2-巰基-1-甲基咪唑時(shí)間保留因子Fig.5 Effect of mobile phase pH on retention factor of time on 2-mercapto-1-methylimidazole

圖6　2-巰基-1-甲基咪唑峰面積保留因子Fig.6 Effect of mobile phase pH on retention factor of mass on 2-mercapto-1-methylimidazolel

蛋白質(zhì)與配基之間的相互作用主要體現(xiàn)在靜電作用以及疏水或親硫作用兩個(gè)方面。從3種蛋白的pI值可知，當(dāng)流動(dòng)相處于較低pH時(shí)，3種蛋白的凈電荷均為正值，3種雜環(huán)配基也均帶正電荷，此時(shí)蛋白質(zhì)與配基之間的靜電作用是電荷排斥作用。同時(shí)，蛋白質(zhì)與配基的疏水或親硫作用也受到了環(huán)境pH等因素的較大影響:流動(dòng)相pH通過(guò)改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，影響表面水化層的大小，從而影響疏水區(qū)域的暴露水平；同時(shí)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)也隨pH的變化而發(fā)生變化，在較低pH下蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)更易被破壞，疏水基團(tuán)有可能更多地暴露出來(lái)。

蛋白質(zhì)與配基在不同pH流動(dòng)相下的作用關(guān)系是一個(gè)復(fù)雜的相互制約的結(jié)果。從圖1～圖6可以發(fā)現(xiàn)，保留因子的最低點(diǎn)并不都在pH最低時(shí)（pH 2.2）出現(xiàn)。在較低的pH范圍內(nèi)，當(dāng)pH過(guò)低時(shí)蛋白質(zhì)有可能處于變性即三維結(jié)構(gòu)破壞疏水基團(tuán)暴露的狀態(tài)，此時(shí)盡管pH的減小增加了電荷排斥力，但蛋白質(zhì)與配基的疏水作用也在增強(qiáng)，因此出峰快慢（KT大小）和出峰量大?。↘A大?。┤Q于疏水作用和電荷排斥作用兩者變化幅度大小。而在較高的pH范圍內(nèi)，電荷排斥力迅速下降，蛋白質(zhì)與配基的相互作用迅速增加，KT和KA值迅速增大，直至不能出峰（完全保留）。比較而言，對(duì)于 3-氨基吡啶配基，在低pH段保留因子的變化處于一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，3種蛋白中帶電荷量更少的BSA的KT和KA先于溶菌酶和IgG升高，體現(xiàn)了電荷排斥力占據(jù)了主導(dǎo)作用。對(duì)于帶咪唑環(huán)的2-巰基苯并咪唑和2-巰基-1-甲基咪唑配基，IgG的保留行為在2-巰基-1-甲基咪唑、2-巰基苯并咪唑配基中的表現(xiàn)與其他兩種蛋白有較大差異。在過(guò)低pH時(shí)，IgG會(huì)遭到變性，三維結(jié)構(gòu)破壞疏水基團(tuán)暴露的狀態(tài)，加強(qiáng)了親硫吸附和疏水作用力，IgG蛋白的疏水作用力的增強(qiáng)完全蓋過(guò)了其與配基的電荷排斥，表現(xiàn)出完全吸附（苯并咪唑配基）或大部分吸附（甲基咪唑配基），當(dāng)pH升高到 3.0～3.5范圍，IgG恢復(fù)了正常的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致親硫作用急劇減小，有一定的洗出峰，而當(dāng)升高pH，由于電荷排斥的減小，又表現(xiàn)為較大的或完全的吸附。有文獻(xiàn)在研究中報(bào)到[23-24]，含有咪唑的HCIC配基具有更好的IgG親和性能，而苯并咪唑由于過(guò)于強(qiáng)的疏水性質(zhì)，盡管吸附量較大，但選擇性較弱，本文結(jié)果也印證了這一現(xiàn)象。此外，從圖5和圖6中可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在 2-巰基-1-甲基咪唑配基上的保留因子突變寬度較小，即在很小的pH變化范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)完成了從全部保留到不保留，這將有利于蛋白質(zhì)在梯度范圍內(nèi)被完整洗脫下來(lái)，這在后面的結(jié)果中也體現(xiàn)出來(lái)。

圖7　單一流動(dòng)相下配基對(duì)3種蛋白的出峰情況Fig.7 Effect of three proteins’ separation at condition of isocratic elution

蛋白質(zhì)在配基上的保留因子反映了蛋白質(zhì)和配基之間的相互作用關(guān)系，而不同蛋白質(zhì)在同一配基上的保留因子的差異正好反映了此配基用于分離不同蛋白質(zhì)的可能性。不同蛋白質(zhì)的保留性質(zhì)差異越大，越有可能產(chǎn)生較大的分離度，而通過(guò)條件流動(dòng)相的pH等條件，又可以進(jìn)行蛋白之間分離度的調(diào)節(jié)。從上述結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，3-氨基吡啶雖然有合適的配基密度，但由于氨基基團(tuán)的作用，其排斥力進(jìn)一步增加，導(dǎo)致3種蛋白的保留時(shí)間失去了選擇性。而3種蛋白質(zhì)在2-巰基苯并咪唑和2-巰基-1-甲基咪唑配基上的保留行為具有更大的差異性，其潛在的分離性能可能更加優(yōu)越。盡管如此，2-巰基苯并咪唑由于配基密度過(guò)小，排斥力小，疏水作用力過(guò)強(qiáng)，出峰受到影響，洗脫條件更加劇烈，限制了其應(yīng)用。

2.3 三種模型蛋白的分離行為

2.3.1 單一流動(dòng)相下模型蛋白的分離行為 圖7是3種不同蛋白在單一流動(dòng)相條件下在3種不同的配基上的出峰情況。如前所述，蛋白在色譜柱中的保留行為是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它與蛋白質(zhì)和配基之間的疏水相互作用和電荷排斥力直接相關(guān)，而且由于蛋白質(zhì)在色譜柱內(nèi)與固定相作用時(shí)產(chǎn)生的折疊翻轉(zhuǎn)[25-26]等情況，其相互作用又有一些未知的因素會(huì)影響蛋白質(zhì)出峰和峰形。不同蛋白由于分子大小和分子形狀的不同，以及硅膠微球具有一定的孔徑分布，因此蛋白質(zhì)之間的分離行為又具有一定的體積排阻作用。同時(shí)，從3種配基的保留因子可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)與配基之間的作用力過(guò)于強(qiáng)烈，僅在低pH條件下往往出現(xiàn)無(wú)法出峰的情況。此處為減少影響因素，減弱了固定相與流動(dòng)相之間極性達(dá)到減弱其相互作用，加入一定量的乙腈來(lái)協(xié)助蛋白質(zhì)的洗出[27]。盡管如此，由于3種蛋白與不同種配基之間的疏水作用力和電荷排斥力大小的不同，導(dǎo)致其分離行為的差異。從圖7中可以發(fā)現(xiàn)，3種蛋白在不同配基色譜柱的出峰時(shí)間均不相同。對(duì)于3-氨基吡啶配基[圖7(a)]，在pH 2.5含有10%乙腈的條件下，IgG和Lys受分子大小而體積排阻的主導(dǎo)先后出峰，而由于BSA的帶電量最小，在低電荷排斥的作用下，最后出峰。對(duì)于 2-巰基苯并咪唑配基[圖 7(b)]，在此流動(dòng)相條件下，由于配基對(duì)于 IgG的極大影響，IgG最后出峰，且出峰面積較小。而對(duì)于2-巰基-1-甲基咪唑配基[圖7(c)]，BSA與配基的相互作用表現(xiàn)為更早的出峰，而IgG的出峰時(shí)間與苯并咪唑配基類(lèi)似，但出峰量明顯更高。從分離度的角度來(lái)看圖7(c)中的BSA與Lys基本分開(kāi)，R=1.42；而Lys與IgG未分開(kāi)，R=0.67。對(duì)比2.2節(jié)中3種蛋白質(zhì)在3種配基上的保留行為，其出峰性質(zhì)基本與其結(jié)果相符合，只是由于乙腈的加入，一定程度上改善了 IgG 和BSA的出峰量。但由于洗脫條件過(guò)于單一，不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離度并沒(méi)有達(dá)到理想狀態(tài)，需要進(jìn)一步進(jìn)行考察。

2.3.2 梯度流動(dòng)相下模型蛋白的分離行為 基于蛋白質(zhì)在配基上的保留行為，設(shè)計(jì)了梯度pH流動(dòng)相洗脫條件，考察模型蛋白的分離行為，如圖8所示。對(duì)于 3-氨基吡啶配基[圖 8(a)]，由于帶正電荷的氨基的存在以及吡啶基團(tuán)相對(duì)較弱的疏水性質(zhì)，模型蛋白在梯度范圍內(nèi)均較快的洗脫，其出峰順序也與蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)直接相關(guān)，依次為 Lys、IgG和BSA。但從圖中也發(fā)現(xiàn)，Lys和BSA出現(xiàn)了兩個(gè)峰。推測(cè)原因，可能是由于配基分子具有兩個(gè)位置的正電荷（氨基和吡啶基），導(dǎo)致同種蛋白質(zhì)在與配基相互接觸時(shí)可能產(chǎn)生不同的作用力。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)不利于蛋白質(zhì)的分析，因此氨基吡啶配基的應(yīng)用受到限制。對(duì)于2-巰基苯并咪唑[圖8(b)]，可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的拖尾非常嚴(yán)重，且出峰的規(guī)律性不強(qiáng)，3種蛋白質(zhì)并沒(méi)有能夠得到很好的分離。這可能與巰基苯并咪唑的高疏水性有關(guān)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在較高pH下被高度地保留，而在此梯度中逐漸被洗脫下來(lái)。對(duì)于2-巰基-1-甲基咪唑配基[圖8(c)]，從圖中可以總結(jié)為:首先Lys、BSA和IgG依次被洗脫下來(lái)，其峰形較好，分離明顯，且3種蛋白的出峰時(shí)間較長(zhǎng)，即有較大的保留。蛋白質(zhì)的保留行為受到了疏水作用、親硫作用、電荷排斥作用以及分子大小的綜合影響。由于IgG與咪唑基團(tuán)的類(lèi)特異性親和作用（疏水和親硫的結(jié)合），因此 IgG在此梯度下有較大的保留，出峰時(shí)間達(dá)到了21 min，而Lys和BSA受帶電荷量的主導(dǎo)，分別先后出峰。圖 8(c)中梯度分離度明顯要好于等度分離，其中Lys與BSA之間的分離度達(dá)到了R=2.29，BSA與IgG之間分離度R=3.96。其次從2.2節(jié)保留因子的測(cè)定中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在2-巰基-1-甲基咪唑配基上的保留因子隨pH的變化有較大的突變，可以認(rèn)為蛋白質(zhì)從完全保留到被洗脫發(fā)生在較小的pH變化范圍內(nèi)，由此在pH梯度下，蛋白質(zhì)在相應(yīng)pH環(huán)境中被相對(duì)集中地洗脫下來(lái)?？梢?jiàn)，以2-巰基-1-甲基咪唑?yàn)榕浠腍PHCIC色譜柱很好地再現(xiàn)了蛋白質(zhì)受疏水電荷誘導(dǎo)作用的行為，更加符合此類(lèi)混合模式色譜用于蛋白質(zhì)分離和分析的要求。而且此色譜柱重復(fù)性能好，多次重復(fù)保留時(shí)間誤差在0.1 s以?xún)?nèi)；且使用了一年時(shí)間，使用了上千次之久，峰形未有太大的變化，保留時(shí)間不提前。

圖8　梯度流動(dòng)相下2-巰基-1-甲基咪唑配基對(duì)3種蛋白的出峰情況Fig.8 Effect of three proteins’ separation at condition of gradient elution

3　結(jié) 論

本文以KH560為中間活化劑，制備了3種以3-氨基吡啶、2-巰基苯并咪唑和2-巰基-1-甲基咪唑?yàn)榕浠男滦突旌夏Ｊ浇橘|(zhì)，并利用3種不同性質(zhì)的模型蛋白質(zhì)對(duì)其色譜性能進(jìn)行了考察。通過(guò)對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及配基與活化基團(tuán)的比例的考察，優(yōu)化配基偶聯(lián)的條件，獲得了較高的配基密度。然后通過(guò)探索3種蛋白質(zhì)在3種色譜柱上的保留因子和分離行為，初步獲得了3種介質(zhì)的色譜性能。2-巰基-1-甲基咪唑?yàn)榕浠纳V柱在單一pH流動(dòng)相和pH梯度流動(dòng)相下表現(xiàn)出了較強(qiáng)的受pH控制的蛋白質(zhì)色譜行為，并且對(duì)3種模型蛋白具有較好的出峰性能和分離性能，是一種潛在的蛋白質(zhì)分離與分析的HPHCIC配基。相較于前期工作，本文選用了更多配基來(lái)探索HPHCIC的性能，相應(yīng)地將配基密度提高了23.5%，把洗脫用乙腈濃度降低到10%，添加了一種新的模型蛋白IgG來(lái)考察了3種模型蛋白的保留行為，并獲得了良好的分離效果。對(duì)于配基密度的影響以及在實(shí)際蛋白質(zhì)分離與分析中的應(yīng)用等方面，將在后續(xù)工作中進(jìn)一步展開(kāi)。

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由于不同地層的物理化學(xué)性質(zhì)不同，地基的穩(wěn)定性也有很大的差異，為滿(mǎn)足工程建設(shè)的需要，應(yīng)對(duì)不穩(wěn)固的地基進(jìn)行處理。通常情況下，通過(guò)采取一些列的措施減小土顆粒之間的空隙，提高土層的重度，達(dá)到減少地基土體沉降量的目的，并設(shè)置排水設(shè)避免地表水和地下水對(duì)地基穩(wěn)固性的影響，使地基的穩(wěn)定性得到提高，并滿(mǎn)足施工要求。

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2016-01-21收到初稿，2016-04-12收到修改稿。

聯(lián)系人:夏海鋒。第一作者:董彬彬（1990—），男，碩士研究生。

Received date: 2016-01-21.

中圖分類(lèi)號(hào):TP 273

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0438—1157（2016）07—2893—08

DOI:10.11949/j.issn.0438-1157.20160095

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21206054）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20151123）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(JUSRP51401A)。

Corresponding author:Prof. XIA Haifeng, hfxia@jiangnan.edu.cn supported by the National Natural Science Foundation of China (21206054), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20151123）and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (JUSRP51401A).

Comparison of three silica resins in chromatographic property for mixed-mode chromatography

DONG Binbin1, XIA Haifeng1,2
(1Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;2National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Abstract:Spherical silica gel with a diameter of 5 μm and pore size of 30 nm was activated by KH-560 and coupled with three kinds of ligands (3-aminopyridine, 2-mercapto benzimidazole and 2-mercapto-1-methylimidazole) to prepare the high performance hydrophobic charge-induction chromatography (HPHCIC) column. The chromatographic properties of three columns were compared and evaluated with three model proteins (Lysozyme, BSA and IgG). The column with 2-mercapto-1-methylimidazole as ligand displayed a proper chromatography and separation behavior which controlled by pH. This work demonstrated that the novel synthetic materials can be utilized as the media of high performance hydrophobic charge induction chromatography.

Key words:bioseparation; protein; high performance liquid chromatography; hydrophobic charge-induction chromatography; retention factor; separation behavior