肝X受體激動劑上調(diào)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞血栓調(diào)節(jié)蛋白表達的機制和作用*

丁涵露，李怡，馮韻霖，陳瑾，鐘翔，王楠，汪偉，張萍，王莉

［1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（四川省人民醫(yī)院）腎內(nèi)科，四川 成都 610072；2.四川省成都市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610017］

·論著·

肝X受體激動劑上調(diào)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞血栓調(diào)節(jié)蛋白表達的機制和作用*

丁涵露1，李怡1，馮韻霖1，陳瑾1，鐘翔1，王楠2，汪偉1，張萍1，王莉1

［1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（四川省人民醫(yī)院）腎內(nèi)科，四川 成都 610072；2.四川省成都市第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610017］

目的探討肝X受體（LX R）激動劑T0901317上調(diào)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（H R G EC）血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）表達的機制和作用。方法W es t ern bl ot檢測25 m m ol高糖和2μm ol T0901317刺激后的H R G EC上IκBα、磷酸化IκBα、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（N F-κB）p65、磷酸化N F-κB p65表達；免疫共沉淀法檢測LX R與P300之間有無結(jié)合；重組腺病毒AdTM shR N A轉(zhuǎn)染H R G EC，觀察其對高糖下H R G EC分泌炎癥介質(zhì)的影響。結(jié)果T0901317能顯著降低高糖刺激后的IκBα和N F-κB p65磷酸化（P＜0.05），LX R-α沉默后N F-κB活性增強；2μm ol T0901317刺激H R G EC 24 h后以C o-IP檢測LX R與P300的表達上調(diào)；T0901317明顯抑制高糖刺激下的H R G EC培養(yǎng)上清中TN F-α、IL-1β濃度（P＜0.05），AdTM s hR N A轉(zhuǎn)染H R G EC后，有或無T0901317刺激，H R G EC培養(yǎng)上清中TN F-α、IL-1β濃度與高糖組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論LX R可能通過與P300發(fā)生相互作用阻斷了N F-κB與P300之間的競爭性結(jié)合而提高TM的表達并抑制炎癥介質(zhì)的分泌。

人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞；肝X受體；血栓調(diào)節(jié)蛋白；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（hum an renal gl om erul ar endot hel i al cel l s，H RGEC）炎性損傷是慢性腎臟病尿蛋白形成的重要原因，既往研究多集中于致炎機制，而對H RGEC內(nèi)源性抗炎機制的關(guān)注很少。血栓調(diào)節(jié)蛋白（t hrom bom odul i n，TM）通過促進活化蛋白C形成及抑制高遷移率族蛋白1等途徑發(fā)揮重要的內(nèi)源性抗炎功能［1］。肝X受體（l i ver X recept or，LXR）是核受體家族成員中一種重要的核受體，T0901317是LXR的高親和力人工合成配體，通常用于實驗研究。在哺乳動物中存在LXRα和LXRβ兩種亞型，LXR激動劑與LXR結(jié)合后激活靶基因的轉(zhuǎn)錄而參與膽固醇、脂類和葡萄糖等物質(zhì)代謝［1-2］，以及發(fā)揮重要的抗炎作用［3-4］。前期的研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的H RGEC表達LXRα、LXRβ，LXR激動劑主要通過LXRα上調(diào)TM表達，但LXR激動劑上調(diào)H RGEC TM表達的機制不明，以熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)TM啟動子區(qū)域（-2494～+160）無LXR結(jié)合點。核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nucl ear t ranscri pt i on f act or-κB，NF-κB）需要與協(xié)同轉(zhuǎn)錄輔活化因子P300結(jié)合才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性［5-6］，有人發(fā)現(xiàn)，核受體家族成員PPARγ依賴配體激活后，通過與NF-κB競爭結(jié)合P300而起到抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路活性的作用［7］，同樣作為核受體家族的全反式維甲酸也是通過競爭性結(jié)合P300而抑制腫瘤壞死因子-α（t um or necrosi s f act or-α，TNF-α）誘導(dǎo)的TM表達下降［5，8］，因此筆者推測LXR可能通過競爭性結(jié)合P300而抑制NF-κB活性，故本研究擬檢測高糖和LXR激動劑T0901317刺激后的H RGEC上NF-κB信號通路活性改變，在此基礎(chǔ)上免疫共沉淀法檢測LXR與P300之間有無結(jié)合，最后以重組腺病毒AdTM shRNA轉(zhuǎn)染H RGEC，觀察其對高糖刺激下H R GEC分泌炎癥介質(zhì)的影響，以探討LXR激動劑上調(diào)TM表達的機制和作用。

1　材料與方法

1.1實驗試劑

H RGEC和T0901317（美國Si gm a公司），小鼠抗人IκBα抗體、小鼠抗人磷酸化IκBα抗體、小鼠抗人NF-κB p65抗體，小鼠抗人磷酸化NF-κB p65抗體（美國Cel l Si gnal i ng Technol ogy公司）、兔抗人P300抗體、兔抗人TM抗體（美國Sant a公司），小鼠抗人β-act i n抗體、羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG（北京博奧森公司），shRNA-LXRα設(shè)計與合成由美國Invi t rogen Li f e Technol ogi es公司完成，白介素-1β（i nt erl euki n-1β，IL-1β）和TNF-α酶聯(lián)免疫吸 附 法 （enzym e-l i nkedi m m unosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Pi erce公司）。

1.2W est ern bl ot檢測LXR激動劑及shR N ALXR α對N F-kB信號通路蛋白的作用

1.2.1實驗分組①二甲基亞砜（di m et hyl sul f oxi de，DM SO）對照組；②25 m m ol/L葡萄糖組（Gs組）；③25 m m ol/L葡萄糖+2μm ol/L T0901317（Gs+T09組）；④25 m m ol/L甘露醇組（M a組）；⑤shRNALXRα+25 m m ol/L葡萄糖+2μm ol/L T0901317；⑥shRNA-C ont rol+25m m ol/L葡 萄 糖+2μm ol/L T0901317，其中⑤⑥組分別給予含shRNA-LXRα或shRNA-Cont rol病毒液轉(zhuǎn)染，24 h更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，將病毒感染48 h后的細(xì)胞分別予以葡萄糖和/或T0901317處理24 h。

1.2.2實驗方法上述各實驗分組在藥物處理24 h后收集細(xì)胞加蛋白裂解液提取總蛋白，檢測細(xì)胞總蛋白濃度后取50μg蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodi um dodecyl sul f at e-pol yacryl am i de gel el ect rophoresi s，SDS-PAGE）凝膠電泳后，13 V恒壓過夜，將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（pol yvi nyl i dene f l uori de，PVDF）膜上。PVDF膜以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，分別加入phosphor-NF-κB p65（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1000）、phosphor-IκBα（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）和β-act i n（1∶1 000）單克隆抗體室溫反應(yīng)2 h，山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯色，每組實驗均重復(fù)3次，用Gel Pro Anal yzer 3.2圖像分析軟件分析條帶灰度值，取平均值做為實驗結(jié)果。

1.3免疫共沉淀法檢測LXR與P300之間有無結(jié)合

分別將有或無2μm ol/L T0901317處理24 h的H RGEC做LXR與P300的免疫沉淀反應(yīng)，用含1% Tri t on X-100磷酸鹽緩沖溶液（phosphat e buf f er sal i ne，PBS）（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取細(xì)胞勻漿，4℃、14000×g離心30m i n后，將裂解液分成4等份，一份加入10μl兔IgG抗體作為陰性對照組，一份不加抗體作為空白對照組，一份加入0.2μg P300抗體，一份加入0.2μg TM抗體，上述各組分別在4℃孵育過夜，然后與100μl蛋白A/G瓊脂糖珠子搖床4℃孵育6 h，2 000 r/mi n離心2 m i n，去上清液，以1.5 m l預(yù)冷的PBS反復(fù)離心洗滌珠子5次，去上清液，以5×上樣緩沖液20μl于100℃變性10 m i n，2 000 r/mi n離心5 m i n，收集上清液，置于-20℃冰箱保存，用于10%SDS-PAGE電泳。

1.4ELI SA觀察腺病毒AdTM shR N A對高糖刺激下H R G EC分泌炎癥介質(zhì)的影響

將構(gòu)建成功的TM小分子干擾RNA的腺病毒AdTM shRNA用于以下實驗。

1.4.1實驗分組①25 m m ol/L葡萄糖組（Gs組）；②25 m m ol/L葡萄糖+2μm ol/L T0901317（Gs+T09組）；③25 m m ol/L葡萄糖+AdTM shRNA+2μm ol/L T0901317（Gs+AdTM shRNA+T09組）；④25 m m ol/L葡萄糖+Adcont rol+2μm ol/L T0901317（Gs+AdCt rl+ T09組）；⑤25 m m ol/L葡萄糖+AdTM shRNA+（Gs+ AdTM shRNA組）；⑥25 m m ol/L葡萄糖+Adcont rol （Gs+AdCt rl組），其中③～⑥組分別給予含AdTM shRNA或Adcont rol病毒液轉(zhuǎn)染，24 h更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，將病毒感染48 h后的細(xì)胞分別予以葡萄糖和/或T0901317處理24 h。

1.4.2實驗方法上述各實驗分組藥物作用24 h后收集上清液，以ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β濃度。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)平均值比較用單因素方差分析（ANOVA），組間比較用Bonf erroni分析進行，兩組間比較用t檢驗，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1W est ern bl ot檢測LXR激動劑抑制N F-κB信號通路活性

Gs組與對照組的IκBα、NF-κB p65水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tI κBα=-20.684，PI κBα= 0.000，tNF-κB p65=-13.133，PNF-κB p65=0.000），表明高糖刺激后，IκBα磷酸化增加和p-p65（核/漿）水平升高（見表1）。Gs+T09組與Gs組的p-IκBα、p-p65（核/漿）水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tp-I κBα= -4.867，Pp-I κBα=0.008，tp-p65=-10.384，Pp-p65=0.000），Gs+T09組的p-IκBα、p-p65（核/漿）水平較Gs組降低，表明T0901317能降低高糖刺激后的p-IκBα、p-p65（核/漿）水平（見圖1A、1B和表1）。shRNA-LXRα組與對照組的p-IκBα、p-p65（核/漿）水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），shRNA-LXRa 組IκBα磷酸化增加，p-p65（核/漿）水平升高，表明shRNA-LXRα干擾后IκBα磷酸化增加，p-p65（核/漿）水平升高（見圖1C、1D和表2）。

2.2免疫共沉淀法檢測LXR與p300之間有結(jié)合

2μm ol T0901317刺激H RGEC 24 h后用Co-IP檢測發(fā)現(xiàn)LXR與P300的表達上調(diào)，在以LXR抗體免疫共沉淀下來的蛋白復(fù)合物中可檢測到P300蛋白，在以P300抗體免疫共沉淀下來的蛋白復(fù)合物中可檢測到LXR蛋白（見圖2）。由此可推斷出T0901317可以促進LXR與P300之間的結(jié)合，證明LXR與P300之間是有相互作用的。由于NF-κB需要與P300結(jié)合才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，因此結(jié)合本實驗發(fā)現(xiàn)T0901317抑制NF-κB信號通路蛋白活性，筆者推測LXR可能競爭性與P300結(jié)合，阻斷了NF-κB與P300之間的結(jié)合，NF-κB活性下降從而TM表達提高。

2.3AdTM shR N A轉(zhuǎn)染H R G EC后抑制高糖下H R G EC分泌的炎癥介質(zhì)

Gs+T09組與高糖組的TNF-α、IL-1β水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tTNF-α=15.728，PTNF-α= 0.000，tI L-1β=13.090，PI L-1β=0.000），Gs+T09組的TNF-α、IL-1β水平較高糖組降低，表明T0901317能降低高糖刺激后的 TNF-α、IL-1β 水平。Gs+AdTM shRNA+T09組的TNF-α、IL-1β水平與高糖組比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（tTNF-α= 1.880，PTNF-α=0.133，tI L-1β=1.654，PI L-1β=0.173）；Gs+ AdTM shRNA組的TNFα、IL-1β水平與高糖組比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（tTNF-α=2.76，PTNF-α= 0.051，tI L-1β=-0.533，PI L-1β=0.623）， 兩 組 的TNF-α、IL-1β 水平較高糖組無明顯降低，表明AdTM shRNA轉(zhuǎn)染H RGEC后，無論有或無T0901317刺激，H RGEC培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β水平都無明顯降低，提示TM可能具有減輕高糖刺激下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。見表3和圖3。

表1　各組p-I kBα光密度和p-p65（核/漿）比較 （n=3，±s）

表1　各組p-I kBα光密度和p-p65（核/漿）比較 （n=3，±s）

組別P值對照組　6 0 . 6 7 ± 2 . 5 1 7 p -I k Bα光密度/ % F 值P 值p -p 6 5（核/漿）F 值8 5 . 6 7 ± 2 . 5 1 7 G s組　1 2 2 . 3 3 ± 4 . 5 0 9 　1 3 5 . 0 0 ± 6 . 0 0 0 G s + T 0 9組　7 0 . 6 7 ± 2 . 5 1 6 　1 1 4 . 0 0 ± 4 . 0 0 0 M a組　4 7 . 0 0 ± 4 . 0 0 0 　6 4 . 0 0 ± 4 . 0 0 0 2 6 5 . 1 8 8 　0 . 0 0 0 1 5 7 . 2 3 8 　0 . 0 0 0

圖2　免疫共沉淀法檢測LXR與P300之間有結(jié)合

表2　shR N A-LXR α干擾后各組p-I kBα光密度和p-p65（核/漿）比較 （%，n=3±s）

表2　shR N A-LXR α干擾后各組p-I kBα光密度和p-p65（核/漿）比較 （%，n=3±s）

組別p -p 6 5（核/漿）s h R N A -C t r l對照組　8 2 . 3 3 ± 3 . 5 1 1 　4 8 . 3 3 ± 2 . 5 1 6 s h R N A -L X Rα組　1 1 4 . 0 0 ± 6 . 0 0 0 　1 1 9 . 3 3 ± 4 . 0 4 1 t值　-7 . 8 8 9 　-2 5 . 8 3 0 P值　0 . 0 0 1 　0 . 0 0 0 p -I k Bα光密度/ %

表3　T0901317抑制高糖刺激下H R G EC分泌TN Fα、I L-1β （n=3，pg/m l，±s）

表3　T0901317抑制高糖刺激下H R G EC分泌TN Fα、I L-1β （n=3，pg/m l，±s）

組別P 值G s 　0 . 5 4 3 ± 0 . 3 2 5 T N F -α F 值P 值I L -1 β F 值1 7 9 . 5 3 ± 9 . 4 5 G s + T 0 9 　0 . 2 1 5 ± 0 . 1 5 7 　9 5 . 5 0 ± 5 . 8 5 G s + A d T M s h R N A + T 0 9 　0 . 4 9 4 ± 0 . 3 1 3 　1 6 7 . 6 7 ± 8 . 0 7 G s + A d C t r l + T 0 9 　0 . 2 7 5 ± 0 . 1 8 5 　1 0 1 . 9 0 ± 4 . 0 3 G s + A d T M s h R N A 　0 . 4 2 1 ± 0 . 2 5 5 　1 8 3 . 3 7 ± 8 . 1 3 G s + A d C t r l 　0 . 5 1 5 ± 0 . 1 6 3 　1 7 3 . 7 3 ± 8 . 3 1 9 3 . 9 2 1 　0 . 0 0 0 8 6 . 1 7 8 　0 . 0 0 0

圖3　AdTM shR N A轉(zhuǎn)染H R G EC抑制高糖下H R G EC分泌TN F-α、I L-1β

3　討論

NF-κB是普遍存在于細(xì)胞漿中以p50/p65異二聚體為形式的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，與NF-κB的抑制性蛋白 IκB（i nhi bi t or，IκB）包括IκBα和IκBβ）結(jié)合而呈非活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到病原菌等刺激時，IκB激酶因磷酸化而活化并使IκBα發(fā)生磷酸化，繼而發(fā)生泛素化而被26 S蛋白酶體降解。IκBα降解使得p50/p65轉(zhuǎn)位入核，對多種靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。p65的核定位信號區(qū)的N-氨基端（S276）發(fā)生磷酸化是p50/p65異二聚體轉(zhuǎn)位、與靶基因DNA結(jié)合及調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄所必需的［9-10］，已經(jīng)明確，大多數(shù)的炎癥介質(zhì)包括TNF-α、IL-6啟動子中包含特異性NF-κB結(jié)合保守序列［11-12］。

既往研究報道，NF-κB可通過競爭性結(jié)合P300而抑制某些轉(zhuǎn)錄因子的活化［13-14］，而且LXR啟動子區(qū)域可能含有NF-κB的結(jié)合位點［15-16］。IκBα磷酸化是NF-κB通路得以激活的初始信號，本實驗發(fā)現(xiàn)高糖刺激后IκBα磷酸化比例明顯增加，LXR激動劑T0901317能顯著降低高糖刺激后的IκBα磷酸化和NF-κB p65磷酸化。特異性敲低H RGEC上的LXRα，再以高糖刺激及T09013171處理，與無效RNA干擾對照組比較，IκBα磷酸化比例增加（P＜0.05），同樣磷酸化NF-κB p65水平也顯著提高（P＜0.01），提示T0901317可抑制NF-κB信號通路蛋白活性，而且這種抑制作用依賴于LXRα的活化，上述實驗結(jié)果與已有文獻報道的LXR激動劑抑制IκB磷酸化和NF-κB p65轉(zhuǎn)位入核而上調(diào)缺血心肌細(xì)胞血紅素加氧酶的表達相一致［16］，因此本實驗中LXR激動劑促進TM表達有可能與其抑制NF-κB信號通路蛋白的活性有關(guān)。

作為核受體家族一員的 LXR活化后抑制NF-κB通路活性的機制雖然尚未完全闡明，但有人發(fā)現(xiàn)，核受體家族的另一個重要成員PPARγ能與NF-κB發(fā)生生理性相互作用，PPARγ激動劑存在時兩者的相互作用增強，并抑制NF-κB驅(qū)動炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄［17］。而有人則提出，PPARγ依賴配體激活后，通過與NF-κB競爭結(jié)合P300而起到抑制NF-κB信號通路活性的作用［7］。同樣作為核受體家族的全反式維甲酸也是通過競爭性結(jié)合P300而抑制TNF-α誘導(dǎo)的TM表達下降［5，8］，在本實驗中，T0901317刺激后的H RGEC上NF-κB信號通路活性下降，加之免疫共沉淀法檢測到LXR與P300之間有結(jié)合，因此推測LXR活化后，LXR可能通過與NF-κB競爭性結(jié)合P300而抑制NF-κB的活性，達到上調(diào)TM表達和抑制炎癥介質(zhì)分泌的作用。

LXR-β在多種組織廣泛表達，LXR-α主要表達在膽固醇代謝組織［18］，之前的研究發(fā)現(xiàn)LXR-α、LXR-β表達在H RGEC，LXR-α激活后TM表達增強。本實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染LXR-α-si RNA后，H RGEC的NF-κB信號通路蛋白活性增加，提示LXR-α活化在H R GEC表達TM中可能起重要作用，鑒于T0901317可同時激活LXR-α、LXR-β［19］，因此內(nèi)源性LXR-β在TM表達中的作用不能完全排除?？傊?，本實驗發(fā)現(xiàn)LXR活化可抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)分泌，因此靶向LXR-TM的治療可能會減輕高糖下內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

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（申海菊編輯）

Mechanism and role of LXR agonist upregulating thrombomodulin expression in human glomerular endothelial cells*

Han-lu Ding1，Yi Li1，Yun-lin Feng1，Jin Chen1，Xiang Zhong1，Nan Wang2，Wei Wang1，Ping Zhang1，Li Wang1
（1.Department of Nephrology，Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，Sichuan 610072，China；2.Department of Nephrology，the Second People's Hospital of Chengdu，Chengdu，Sichuan 610017，China）

ObjectiveToexploretheeffectofliverXreceptor（LXR）agonistT0901317on thrombomodulin（TM）expression in human glomerular endothelial cells（HUGECs）and its mechanism. Methods Western blot was used to detect the expressions of IκBα，p-IκBα，nuclear transcription factor-κB （NF-κβ）p65 and p-NF-κB p65 in HUGECs stimulated by 25 mmol high glucose and 2 μmol T0901317.The interaction between LXR and the transcriptional coactivator p300 in HUGECs was detected using coimmunoprecipitation（Co-IP）assay.The concentrations of IL-1β and TNF-α in the supernatant of HUGECs transfected with or without AdTMshRNA were determined using commercially available ELISA kits.Results T0901317（2 μmol）significantly reduced the phosphorylation of IκBα and NF-κB p65 in the HUGECs stimulated by high glucose（P＜0.05）.The activity of NF-κB was increased by LXR-α silencing despite thepresence of T0901317.Co-IP revealed up-regulation of LXP and p300 in the HUGECs 24 h after stimulation by 2 μmol T0901317.T0901317 inhibited the secretion of high glucose-induced inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β in the HUGECs（P＜0.05）.The levels of TNF-α and IL-1β were increased by TM silencing with AdTMshRNA despite the presence of T0901317，but the differences were not significant（P＞0.05）.Conclusions LXR agonist increases TM expression and inhibits secretion of inflammatory mediators probably by competitively blocking the interaction between NF-κB and p300 through interaction with p300.

glomerular endothelial cell；liver X receptor；thrombomodulin；nuclear transcription factor-κB

R 692.9；TQ 937

A

1005-8982（2016）05-0001-06

10.3969/j.i s s n.1005-8982.2016.05.001

2015-06-01
*

國家自然科學(xué)基金（No：81170680）；四川省科技廳課題（No：2013JY0141）

王莉，E-m ai l：scwangl i 62@163.com