單胺氧化酶A基因啟動(dòng)子30-bp重復(fù)序列多態(tài)性與重度子癇前期發(fā)病機(jī)制的關(guān)系

孫　燕，侯雪晶，郭紅梅

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單胺氧化酶A基因啟動(dòng)子30-bp重復(fù)序列多態(tài)性與重度子癇前期發(fā)病機(jī)制的關(guān)系

孫燕1，侯雪晶1，郭紅梅2

1.066000，秦皇島市第一醫(yī)院產(chǎn)科；2.100039北京，武警總醫(yī)院口腔科

【摘要】目的探討單胺氧化酶A(MAO-A)基因啟動(dòng)子30-bp重復(fù)序列多態(tài)性與重度子癇前期發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)60例重度子癇前期患者(病例組)及70例正常孕婦(對(duì)照組)MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)的基因型，并對(duì)該多態(tài)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果MOA-A基因啟動(dòng)子區(qū)H/H、H/L、L/L各基因型的分布頻率和H、L等位基因的分布頻率在病例組與對(duì)照組之間的分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性可能與重度子癇前期的發(fā)病無(wú)相關(guān)性，但從機(jī)制上推測(cè)其基因多態(tài)性導(dǎo)致酶活性下降、兒茶酚胺滅活減少可能是重度子癇前期發(fā)病的重要原因。

【關(guān)鍵詞】重度子癇前期；單胺氧化酶A；基因多態(tài)性

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders complicating pregnancy)是妊娠期特有的疾病，可嚴(yán)重危害母嬰健康，發(fā)病原因至今尚無(wú)定論，但遺傳因素的影響已取得共識(shí)。有研究表明，妊娠期高血壓疾病患者交感神經(jīng)緊張性增加，血中兒茶酚胺尤其是去甲腎上腺素水平明顯高于正常孕婦[1，2]，可能與妊娠期高血壓疾病的發(fā)病相關(guān)[1，3]。單胺氧化酶A(MAO-A)是兒茶酚胺代謝過程中的主要降解酶，其酶的活性導(dǎo)致血中兒茶酚胺水平的變化，可能在妊娠期高血壓疾病的發(fā)病過程中起一定的作用，調(diào)控MAO-A合成的基因位于X 染色體p11.23-11.4區(qū),在MAO-A基因啟動(dòng)區(qū)內(nèi)存在含30bp堿基的可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(30bp-uVNTR) ，這種多態(tài)性與MAO-A基因的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，被認(rèn)為是MAO-A基因功能的標(biāo)志物[4]。啟動(dòng)子區(qū)域30bp-uVNTR多態(tài)性在人群中分別有2、3、3.5、4、5次重復(fù)(2R、3R、3.5R、4R、5R)，其中3、4次重復(fù)最多見，3.5次或4次重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄活性較之3次與5次重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄活性高2～10倍[4]。關(guān)于MAO-A基因啟動(dòng)子30-bp重復(fù)序列多態(tài)性與重度子癇前期的遺傳易感性的關(guān)系國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。為此，我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法，探討重度子癇前期患者M(jìn)AO-A基因啟動(dòng)子區(qū)30bp的可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)(MAOA-uVNTR)多態(tài)現(xiàn)象與正常孕婦的關(guān)聯(lián)分析。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象選取2014-10至2015-10于秦皇島市第一醫(yī)院產(chǎn)科住院的重度子癇前期患者60例(病例組)，平均(21.2±4.01)歲，平均孕周(33.5±2.13)周。選擇同期門診產(chǎn)檢及住院的健康孕婦共70例(對(duì)照組)，平均(23.03±3.09)歲，平均孕周(35.52±1.85)周。兩組孕婦均為中國(guó)漢族婦女、單胎、初產(chǎn)，均無(wú)內(nèi)科其他合并癥及輸血史。HDCP的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸及茍文麗主編的第八版《婦產(chǎn)科學(xué)》中的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2方法

1.2.1DNA的提取所有受試者均采取外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，-70 ℃保存，常規(guī)法提取DNA。

1.2.2PCR反應(yīng)參考文獻(xiàn)[6] 設(shè)計(jì)引物。上游引物序列：5＇-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3＇，下游引物序列：5＇-GAACGGACGCTCCATTCGGA-3＇。PCR總反應(yīng)體系20 μl，包括PCRmix 10 μl，上游引物0.25 μl，下游引物0.25 μl，模板1 μl，ddH2O 8.5 μl，PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性35 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃終末延伸5 min。應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，同時(shí)選擇2000 bp DNAmarker同時(shí)水平電泳，判定擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及基因型。其中3R/3R基因型顯示320 bp條帶，3R/4R基因型顯示320 bp、350 bp兩條帶，4R/4R基因型顯示350 bp條帶。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理根據(jù)Sabol等[4]的研究結(jié)果和分組方式，將3.5次和4次重復(fù)序列定義為高活性組(H/H)，2次、3次和5次重復(fù)序列定義為低活性組(L/L)。本研究未發(fā)現(xiàn)2次、3.5次及5次重復(fù)序列，故高活性組只包含4次重復(fù)序列，低活性組為3次重復(fù)序列。資料統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 11.5版軟件包進(jìn)行，采用χ2檢驗(yàn)比較各基因型和等位基因在重度子癇前期組及正常對(duì)照組的分布頻率差異，以及進(jìn)行Hardy-Wein-berg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果3R/3R基因型顯示320 bp條帶，3R/4R基因型顯示320 bp、350 bp兩條帶，4R/4R基因型顯示350 bp條帶，本研究未發(fā)現(xiàn)2次、3.5次及5次重復(fù)序列(圖1)。

2.2MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)基因型頻率的比較病例組MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)基因型H/H、H/L、L/L的頻率分別為10%、40%和50%，與對(duì)照組的H/H、H/L、L/L基因型頻率11.4%、45.7%和42.9%(同前)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.66，P>0.05；表1)。

圖1　PCR電泳產(chǎn)物(MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)不同基因型的電泳圖)

M為 2000bp Marker;1、3泳道為H/H基因型(350 bp)；2、4、5泳道為H/L基因型(320/350 bp)；6泳道為L(zhǎng)/L基因型(320 bp)

表1　重度子癇前期組與正常孕婦組MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)基因型頻率比較　(%)

注：病例組：重度子癇前期患者組；對(duì)照組：健康孕婦組

2.3MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)等位基因頻率的比較病例組MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)等位基因H、L的分布頻率分別為30.0%、70.0%，與對(duì)照組的等位基因頻率34.3%、65.7%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.54，P>0.05；表2)。

表2　重度子癇前期組與正常孕婦組MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)等位基因頻率比較　(%)

注：病例組：重度子癇前期患者組；對(duì)照組：健康孕婦組

2.4Hardy-Wein-berg遺傳平衡定律檢驗(yàn)

HH∶HL∶LL與p2∶2pq∶q2相符，由此可證明該群體是一個(gè)平衡群體。

3討論

妊娠期高血壓是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇以及慢性高血壓并發(fā)子癇前期和慢性高血壓合并妊娠，發(fā)生率5%～12%。該組疾病嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因。病因至今不明，具有家族傾向性，提示遺傳因素與該病發(fā)生有關(guān)，但遺傳方式尚不明確。在子癇前期的遺傳易感性研究中，盡管目前已定位了十幾個(gè)子癇前期染色體易感區(qū)域，但在該區(qū)域內(nèi)進(jìn)一步尋找易感基因仍面臨很大的挑戰(zhàn)[5]。

張麗紅等[7]發(fā)現(xiàn),血漿中腎上腺素及去甲腎上腺素含量與血壓呈正相關(guān)。Hernandez[8]等研究證實(shí)，血中兒茶酚胺水平的變化，可以影響血壓，并與高血壓相關(guān)。Missouris等[9]發(fā)現(xiàn)，在未接受治療的高血壓患者,尿去甲腎上腺素分泌增加，并與高血壓的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

單胺氧化酶A(MAO-A)是兒茶酚胺代謝過程中的主要降解酶，其酶的活性導(dǎo)致血中兒茶酚胺水平的變化，可能在妊娠期高血壓疾病的發(fā)病過程中起一定的作用，MAO-A的基因位于X 染色體p11.23-11.4區(qū),其中啟動(dòng)子區(qū)存在30bp的可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)(MAOA-uVNTR)多態(tài)現(xiàn)象，該多態(tài)現(xiàn)象與MAO-A活性相關(guān)，被認(rèn)為是MAO-A基因功能的標(biāo)志物，該重復(fù)序列可出現(xiàn)3～6次的重復(fù)，其中3次重復(fù)的基因會(huì)使所編碼的酶活性降低，3.5次或4次重復(fù)的等位基因較之3次與5次重復(fù)的基因轉(zhuǎn)錄活性高了2～10倍[4]。以往的研究顯示，低表達(dá)的MAO-A基因容易導(dǎo)致酗酒、攻擊性和反社會(huì)行為，它甚至被一些科學(xué)家稱為“戰(zhàn)士”基因，但對(duì)于該基因多態(tài)性與重度子癇前期疾病的研究我國(guó)目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，探討重度子癇前期患者M(jìn)AO-A基因啟動(dòng)子區(qū)30bp的可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)(MAOA-uVNTR)多態(tài)現(xiàn)象與正常孕婦的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MAO-A基因啟動(dòng)子區(qū)的等位基因和基因型分布在重度子癇前期組和對(duì)照組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明MAO-A基因啟動(dòng)子30-bp重復(fù)序列多態(tài)性與重度子癇前期的發(fā)病無(wú)相關(guān)性。但妊娠期高血壓疾病的發(fā)生和發(fā)展是極其復(fù)雜的過程，影響子癇前期基因型和表型的其他因素如：多基因型、基因種族差異、基因相互作用及環(huán)境等，特別是基因和環(huán)境相互作用是極其重要的。此外由于本研究樣本量的限制, 我們并不排除MAO-A基因在重度子癇前期易感性中的作用, 有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。我們還認(rèn)為, 對(duì)該位點(diǎn)和其它可能位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合分析, 如該基因上的其它多態(tài)以及鄰近基因位點(diǎn)等的共同分析, 將可能揭示MAO-A 基因在重度子癇前期病因中的作用。

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(2015-04-19收稿2016-03-21修回)

(責(zé)任編輯梁秋野)

基金項(xiàng)目：河北省秦皇島市科技支撐項(xiàng)目(編號(hào)201302A086)

作者簡(jiǎn)介：孫燕，碩士，主治醫(yī)師。

【中國(guó)圖書分類號(hào)】R714.246

Association between severe preeclampsia and mononmine oxidase A gene

SUN Yan1, HOU Xuejing1，and GUO Hongmei2.1.

Department of Obstetrics, The First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, China;2.Department of Stomatology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the impact of this polymorphism of monoamine oxidase A(MAO-A) variable number tandem repeat (VNTR) on the risk of severe preeclampsia.MethodsSixty pregnant women wih severe preeclampsia and seventy normal pregnant women were genotyped for MAO-A VNTR polymorphism using PCR-based restriction fragment length polymorphism method.ResultsSignificant differences were not observed between the case group and normal controls in the frequencies of MAO-A VNTR alleles and genotypes.ConclusionsThere is no significant difference in the allele and genotype frequencies of MAO-A gene between case group and normal controls . Our results show that MAO-A VNTR polymorphism perhaps can no increase the risk of severe preeclampsia.

【Key words】severe preeclampsia; MAO-A；gene polymorphism