一株纖維素降解菌的鑒定及其對(duì)飼料粗纖維的降解效果

王堯悅，曹平華，陳玉林，楊明明，楊雨鑫

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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一株纖維素降解菌的鑒定及其對(duì)飼料粗纖維的降解效果

王堯悅，曹平華，陳玉林，楊明明，楊雨鑫

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 對(duì)本課題組分離的一株纖維素降解菌進(jìn)行鑒定，優(yōu)化其產(chǎn)酶條件并檢測(cè)其對(duì)飼料粗纖維的降解效果,以期為該菌在飼料粗纖維降解中的應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā?通過(guò)菌株形態(tài)特征和16S rDNA 序列分析鑒定了實(shí)驗(yàn)室分離保存的一株纖維降解菌；研究該菌所產(chǎn)纖維素酶的部分酶學(xué)性質(zhì)和酶譜,并優(yōu)化其產(chǎn)纖維素酶的條件；利用體外發(fā)酵和尼龍袋法測(cè)定菌株N3所產(chǎn)粗酶液對(duì)3種飼料(麩皮、麥草、燕麥)粗纖維的降解率；利用RB亮藍(lán)脫色試驗(yàn)檢測(cè)該菌的木質(zhì)素降解能力。【結(jié)果】 經(jīng)鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis N3；N3菌株不產(chǎn)生漆酶，主要向胞外分泌分子質(zhì)量70 ku以上的纖維素酶組分；N3菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60 ℃和5.5；N3菌株以體積比1∶50接種至最適發(fā)酵培養(yǎng)基(碳源為麩皮、氮源為蛋白胨，初始pH為5)，37 ℃培養(yǎng)24 h時(shí)，所產(chǎn)纖維素酶活性最高，可達(dá)3.50 U/mL；菌株N3所產(chǎn)粗酶液對(duì)麩皮的粗纖維降解率最高，對(duì)麥草秸稈的粗纖維降解率最低?！窘Y(jié)論】 分離到的纖維降解菌Bacillus subtilis N3主要分泌分子質(zhì)量70 ku 以上、耐熱的纖維素酶，對(duì)飼料粗纖維具有較強(qiáng)的降解能力。

[關(guān)鍵詞]枯草芽孢桿菌；纖維素酶；酶學(xué)性質(zhì)；纖維素降解；酶譜分析

全世界每年生成的植物性有機(jī)物質(zhì)中，約50%為纖維素物質(zhì)[1]。纖維素作為一種豐富的、可再生資源，已經(jīng)成為飼料工業(yè)、食品工業(yè)、造紙業(yè)、洗滌工業(yè)和紡織品工業(yè)的潛在原料。但這些纖維素物質(zhì)只有一小部分得到了應(yīng)用，絕大多數(shù)被浪費(fèi)，甚至成為環(huán)境污染物[2-3]。因此，如何有效降解纖維素，已成為當(dāng)前國(guó)際研究的重要課題之一。生物法降解纖維素因具有對(duì)設(shè)備要求低，分解后的產(chǎn)物易回收利用，對(duì)環(huán)境污染較小等特點(diǎn)而逐漸受到關(guān)注。目前生物降解法主要是利用纖維素酶降解纖維素,纖維素酶大部分產(chǎn)生于具有纖維素水解系統(tǒng)的微生物，主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌。在不同種類的纖維素酶中，大多數(shù)胞外單一酶由好氧菌產(chǎn)生，而胞外的多酶復(fù)合物則由厭氧菌產(chǎn)生。連接的非催化結(jié)構(gòu)蛋白(腳手架蛋白)能夠在纖維素晶體結(jié)構(gòu)的作用下激發(fā)纖維素酶的活力。

在飼料工業(yè)中添加纖維素酶有助于提高飼料轉(zhuǎn)化率，增加動(dòng)物對(duì)谷物類飼料的消化率，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，拓寬飼料來(lái)源。但由于酶活力易受溫度、酸堿度、產(chǎn)酶量等因素的影響[4-5]，因此，篩選產(chǎn)酶活力高、穩(wěn)定性好的纖維素降解菌是提高纖維素有效利用率的前提。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期保存的一株纖維素降解菌進(jìn)行種屬鑒定、酶學(xué)特性分析、產(chǎn)酶條件優(yōu)化和酶譜分析，并研究其所產(chǎn)粗酶液對(duì)3種飼料(麩皮、麥草秸稈、燕麥秸稈)粗纖維的降解效果，以期為該菌在飼料粗纖維降解中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株試驗(yàn)所用菌株N3為西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院絨毛用羊科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室前期篩選保存的菌株。

1.1.2引物16S rDNA擴(kuò)增引物(通用引物)由南京金斯瑞公司合成，名稱和序列如下：16S-F：5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′,16S-R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.1.3主要試劑和儀器羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖、NaCl、NaOH、H2SO4、剛果紅、酚酞，均購(gòu)自西安沃爾森公司；甲基紅，購(gòu)自楊凌三利化玻儀器公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Taq酶，購(gòu)自Takara公司；酵母提取物、蛋白胨，購(gòu)自O(shè)XOID公司。

Thermo循環(huán)水浴鍋Tech320， HITACH紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)U-3900， Bio-rad PCR儀C1000，酸式、堿式滴定管，數(shù)碼相機(jī)等。用孔徑為50 μm尼龍布(購(gòu)于楊凌新三力化玻)制成9 cm×6 cm的尼龍袋。

1.1.4主要培養(yǎng)基(1) LB液體培養(yǎng)基：取10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母提取物、5.0 g氯化鈉，溶于1 L蒸餾水,121 ℃滅菌30 min。

(2) LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

(3) LC固體培養(yǎng)基：含10 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的LB固體培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌30 min。

(4) 基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(BM培養(yǎng)基)：含10 g/L 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的LB液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2方法

1.2.1菌株的活化與鑒定將保存的菌株劃線接種至LC固體培養(yǎng)基平板，于37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，觀察平板上菌落生長(zhǎng)狀況。挑取形態(tài)正常的單菌落，接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，混勻后，于37 ℃、220 r/min恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，獲得種子液；在挑過(guò)菌的LC固體培養(yǎng)基中加入適量的剛果紅染色液，染色30 min后，用1 mol/L NaCl溶液脫色15 min，觀察水解圈大小，選擇水解圈最大的作為接種菌。

菌株的形態(tài)鑒定[6-7]：將活化后的菌株接種于LC固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察其菌落與菌體形態(tài)，并進(jìn)行剛果紅染色觀察和革蘭氏染色鏡檢。

菌株的16S rDNA擴(kuò)增：提取N3菌株的基因組DNA，以之為模板，用16S rDNA通用引物擴(kuò)增其16S rDNA片段，送桑尼公司測(cè)序，應(yīng)用NCBI Blast 在線分析工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.2纖維素酶活力測(cè)定采用DNS法[8-9]測(cè)定纖維素酶活力。取3支規(guī)格為25 mL比色管，加入2 mL 10 g/L 的CMC-Na，分別置于37 ℃下預(yù)熱2 min，之后迅速加入0.1 mL粗酶液，精準(zhǔn)計(jì)時(shí)5 min后，立即加入2.5 mL DNS，煮沸5 min后冷卻，定容至10 mL，混勻，備檢。對(duì)照組加入沸水中煮沸30 min滅活的粗酶液，其余操作同前。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(用對(duì)照組試液調(diào)0)于540 nm波長(zhǎng)比色，然后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算纖維素酶活力。

酶活單位：按照以上測(cè)定方法，在1 min內(nèi)將羧甲基纖維素分解成1 μmol葡萄糖所需的纖維素酶量為一個(gè)單位酶活，單位為U/mL。

1.2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取1 g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0，0.5，1.0，2.0，4.0 mL于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。(以含有0 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的試液作為對(duì)照組)。再分別吸取上述溶液各2 mL于比色管中，分別加入2.5 mL 3，5-二硝基水楊酸顯色液(DNS)，煮沸5 min。冷卻后，加水稀釋至10 mL。用HITACH紫外分光光度計(jì)U-3900在540 nm波長(zhǎng)下比色(用對(duì)照組試液調(diào)0)，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程。

1.2.4纖維素酶的部分酶學(xué)性質(zhì)分析將供試菌株種子液接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)24 h，然后4 ℃ 、10 000 r/min離心15 min，取上清液即為粗酶液。

酶促反應(yīng)的最適溫度：在含10 g/L CMC-Na的50 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)中加入適量粗酶液，分別于30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85和90 ℃下反應(yīng)5 min，DNS法測(cè)定纖維素酶活性。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

酶促反應(yīng)的最適pH：將10 g/L CMC-Na分別溶于pH 3.5～11.0的緩沖液，即乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH為 3.5，4.0，4.5，5.0,5.5,6.0，6.5)，Tris-HCl緩沖液(pH為7.0，7.5,8.0，8.5)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH為 9.0,9.5,10.0,10.5,11.0)。加入0.1 mL粗酶液，于最適溫度下反應(yīng)5 min，DNS法測(cè)定CMC酶活性。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5酶譜分析利用含有10 g/L CMC的10%分離膠對(duì)供試菌株所產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)[10]。將粗酶液樣品與上樣緩沖液(0.6 mol/L Tris-HCl pH 6.8、體積分?jǐn)?shù)60%甘油、60 g/L SDS、0.6 g/L溴酚藍(lán))按體積比4∶1混合，冰浴2 h備用；同時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白冰浴2 h備用。將已經(jīng)前期處理的備用粗酶液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別上樣，80 V電泳2 h。電泳后，將膠條在含1 g/L Triton X-100的50 mmol/L醋酸緩沖液(pH 5.5)中洗滌30 min除去SDS。將含有標(biāo)準(zhǔn)蛋白的膠條切下，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色備用；其余含有樣品的膠條置于50 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)中，于37 ℃過(guò)夜孵育，經(jīng)10 g/L剛果紅染色30 min后，用1 mol/L NaCl洗脫顯示透明帶。

1.2.6產(chǎn)酶條件優(yōu)化[11-12](1)單因子試驗(yàn)。利用單因子試驗(yàn)篩選該菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)時(shí)間：將菌株N3的種子液按照1∶50的體積比接種于30 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別于37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12，24，36，48和60 h，測(cè)定纖維素酶活力。

碳源: 取30 mL LB液體培養(yǎng)基3份，向其中分別加入麩皮、麥草、燕麥各2.0 g，121 ℃滅菌25 min, 即得不同碳源培養(yǎng)基，備用。將菌株N3的種子液按體積比1∶50接種不同碳源培養(yǎng)基，在最佳培養(yǎng)時(shí)間下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定菌株在不同碳源下所產(chǎn)纖維素酶的活力。

氮源：以篩選的碳源配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用10 g/L蛋白胨、硫酸銨和硝酸鉀作為氮源制備發(fā)酵培養(yǎng)基。將N3菌株種子液按照1∶50的體積比接種至不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在最佳培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，測(cè)定菌株在不同氮源下所產(chǎn)纖維素酶活力。

(2)正交試驗(yàn)。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化供試菌株的培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)基初始pH(B)及接種比例(C)，每個(gè)因素 3個(gè)水平，L9(34)正交表如表 1所示，其他的培養(yǎng)基成分與制備的發(fā)酵培養(yǎng)基成分相同，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.7粗纖維降解率的測(cè)定在最優(yōu)產(chǎn)酶條件下，制備粗酶液。將10 mL粗酶液和含2.0 g飼料(麩皮/麥草/燕麥)，于最適反應(yīng)溫度下220 r/min分別培養(yǎng)12，24，36，48，60 h，將殘?jiān)D(zhuǎn)入已做恒質(zhì)量處理的尼龍袋中。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。利用尼龍袋法[13]測(cè)定飼料及菌株N3降解后殘?jiān)械拇掷w維含量，并計(jì)算粗纖維降解率。

表 1　菌株N3產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化的L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1　Optimized culturing conditions of Bacillus subtillis N3 for enzyme production

1.2.8供試菌株對(duì)木質(zhì)素的降解能力分析利用RB亮藍(lán)脫色試驗(yàn)[14]檢測(cè)菌株對(duì)木質(zhì)素的降解能力。將10.0 mg RB 亮藍(lán)加入至100 mL BM 培養(yǎng)基中，使其充分溶解，鋪平板后接種菌株N3，于30 ℃靜置培養(yǎng)，每天觀察記錄平板脫色情況，根據(jù)菌落周圍是否產(chǎn)生脫色圈判斷有無(wú)木質(zhì)素降解酶(如：漆酶)分泌。

1.3數(shù)據(jù)分析

用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)差異性分析，以P<0.05作為檢驗(yàn)各項(xiàng)數(shù)據(jù)的差異顯著性水平。

2結(jié)果與分析

2.1N3菌株的鑒定

2.1.1形態(tài)鑒定將該菌株接種于LC平板上培養(yǎng)24 h后，可觀察到菌落成橢圓形、灰白色；剛果紅染色發(fā)現(xiàn)菌體周圍有明顯的水解圈(圖1-A)；革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)該菌株呈桿狀，顏色為藍(lán)紫色(圖1-B)，說(shuō)明該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，命名為N3。

圖 1　菌株N3的形態(tài)學(xué)鑒定 A.剛果紅染色;B.革蘭氏染色Fig.1　Morphological identification of N3 A.Congo red staining;B.Gram staining

2.1.216S rDNA序列分析以菌株N3的基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物擴(kuò)增獲得該菌株16S rDNA片段，長(zhǎng)度約為1 400 bp(圖2)。測(cè)序后，應(yīng)用NCBI Blast 在線分析工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌屬細(xì)菌Bacillussubtilissubsp.subtilis str.168的16S rDNA序列(登錄號(hào):NC_000964.2)具有100%的相似度，結(jié)合菌株的形態(tài)鑒定，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌屬，并命名為BacillussubtilisN3。

2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與3,5-二硝基水楊酸(DNS)反應(yīng)，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)得相應(yīng)的吸光度值。利用Excel軟件制作散點(diǎn)圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，其擬合方程為y=14.323x-0.124 3,R2=0.999 5，線性良好。

2.3菌株N3所產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的部分酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1酶促反應(yīng)的最適溫度由圖4可知，菌株N3 所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在該溫度下，酶活性可達(dá)到為2.51 U/mL；在30～60 ℃時(shí)，纖維素酶活性隨溫度的升高不斷增強(qiáng)；60 ℃之后，纖維素酶活性隨溫度的升高呈下降趨勢(shì)，但在60～75 ℃時(shí)，纖維素酶仍有較高的酶活性。

2.3.2酶促反應(yīng)的最適pH由圖5可知，當(dāng)pH為 4.5～8.5時(shí)，菌株N3所產(chǎn)酶的活力較高，其中，當(dāng)pH為 5.5時(shí)，纖維素酶活性最強(qiáng)，達(dá)到3.04 U/mL。該結(jié)果表明，該菌所產(chǎn)纖維素酶具有較寬的pH范圍，尤其是對(duì)偏酸性環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)。

圖 2菌株N3的16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1～4.為擴(kuò)增片段

Fig.2Amplification of N3 16s rDNA

M.DL2000 DNA Marker;1-4.Products of 16S rDNA PCR

圖 3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.3Standard curve of glucose

圖 4　反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶酶活性的影響Fig.4　Cellulase activities under different reaction temperatures

圖 5　pH值對(duì)纖維素酶酶活性的影響Fig.5　Cellulase activities under different pH values

2.4酶譜分析

利用SDS-PAGE和剛果紅染色法分析菌株N3所產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的分子質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)剛果紅染色再脫色后，膠條上分子質(zhì)量大于70 ku的部分顏色較分子質(zhì)量小于70 ku的部分淺(圖6, 膠條1)，證明N3菌株所產(chǎn)分子質(zhì)量為70 ku以上的纖維素酶降解了羧甲基纖維素底物。

圖 6　菌株N3所產(chǎn)纖維素酶的酶譜分析 M.Blue plus II protein Marker；1.菌株N3所產(chǎn)纖維素酶Fig.6　Zymogram analysis of cellulase from N3 M.Blue plus II protein Marker;1.Cellulase from N3

2.5菌株N3產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.5.1不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響由圖7可以看出，菌株N3的纖維素酶活力曲線與其生長(zhǎng)曲線的變化規(guī)律相似，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)；培養(yǎng)24 h時(shí)，菌體所產(chǎn)酶活力最高，而在培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響變小。

2.5.2不同碳源對(duì)酶活力的影響分別以麥草、麩皮和燕麥作為碳源(2.0 g/30 mL)，其他成分不變進(jìn)行最適碳源的篩選，在37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng) 24 h后測(cè)定纖維素酶活力，結(jié)果如圖 8所示。由圖8可以看出，不同碳源對(duì)菌體產(chǎn)酶活力有顯著影響(P<0.05)，其中以麩皮作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時(shí)，菌體接種其中所產(chǎn)纖維素酶的活性最高，為3.24 U/mL。因此，以麩皮為菌株N3產(chǎn)纖維素酶的碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖 8　不同碳源對(duì)N3所產(chǎn)纖維素酶活力的影響 圖注上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖9同F(xiàn)ig.8　Enzyme production of N3 with different carbon origins Different letters indicate significant difference atP<0.05.The same for figure 9

2.5.3不同氮源對(duì)酶活力的影響由圖9可知，以蛋白胨為氮源培養(yǎng)時(shí)，N3所產(chǎn)纖維素酶活性最高，為2.93 U/mL，顯著高于以硫酸銨和硝酸鉀為氮源時(shí)的纖維素酶活性(P<0.05)。因此，以蛋白胨為氮源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖 9不同氮源對(duì)N3所產(chǎn)纖維素酶活力的影響

Fig.9Enzyme production of N3 with different nitrogen origins

2.5.4培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH及接種比例對(duì)酶活力的影響為提高菌株產(chǎn)酶能力，在最適氮源、碳源和發(fā)酵時(shí)間下，應(yīng)用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化菌株N3發(fā)酵產(chǎn)酶的條件。為此，選取培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)基初始pH(B)和接種比例(C)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選3個(gè)水平，每個(gè)試驗(yàn)做3次平行。結(jié)果表明(見(jiàn)表2)，培養(yǎng)溫度(A)對(duì)菌株N3產(chǎn)纖維素酶的影響最為顯著，菌株N3產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件A2B1C2，即當(dāng)菌株N3以1∶50比例接種至pH為5的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h時(shí)，菌株所產(chǎn)酶的活力最強(qiáng)，可達(dá)到3.50 U/mL。

表 2　不同培養(yǎng)溫度、初始pH、接種比例下該菌株產(chǎn)纖維素酶活力的比較Table 2　Cellulase activities of Bacillus subtilis N3 at different temperature,initial pH and ratio of inoculation

2.6菌株N3對(duì)粗纖維降解率的測(cè)定

由圖10可知，菌株N3所產(chǎn)纖維素酶對(duì)麩皮粗纖維的降解率最高，對(duì)麥草秸稈粗纖維的降解效果最差。

圖 10　菌株N3對(duì)飼料粗纖維的降解效果Fig.10　Degradation rates of crude fiber under different culture times

2.7菌株N3對(duì)木質(zhì)素降解能力的測(cè)定

結(jié)果(圖11)發(fā)現(xiàn)，菌株N3經(jīng)過(guò)4 d的脫色反應(yīng)，菌體周圍仍無(wú)脫色圈產(chǎn)生，表明N3不分泌木質(zhì)素降解酶(漆酶)。

圖 11　菌株N3對(duì)木質(zhì)素降解能力的測(cè)定 A.脫色第1天，未發(fā)現(xiàn)脫色現(xiàn)象；B.脫色第4天，未發(fā)現(xiàn)脫色現(xiàn)象Fig.11　Determination of lignin decomposing capacity of N3 A.Decolorizating in day 1,no decolonization phenomenon was observed；B.Decolorizating in day 4,no decolorization phenomenon was observed

3討論

在微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程中，微生物的產(chǎn)酶量與其所處生長(zhǎng)階段有關(guān)。通常微生物在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)產(chǎn)酶活性迅速上升，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)產(chǎn)酶活性達(dá)到最高，之后逐漸下降。這主要是因?yàn)樵谏L(zhǎng)的穩(wěn)定期后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的逐漸積累，細(xì)菌死亡速率大于增殖速率，從而使菌株在培養(yǎng)穩(wěn)定期后產(chǎn)酶活力逐漸下降[15-17]。本試驗(yàn)中，菌株N3對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為0～24 h，菌株N3產(chǎn)酶活力在此時(shí)段迅速上升；在培養(yǎng)24 h左右，細(xì)菌N3進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，此時(shí)具有最高的纖維素酶活性，說(shuō)明菌株N3在此期間產(chǎn)酶能力最強(qiáng)；發(fā)酵24 h后，細(xì)菌發(fā)酵液的酶活開(kāi)始緩慢下降，說(shuō)明酶的分解速度已大于產(chǎn)生的速度，所以菌株N3的最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為24 h。碳源和氮源是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的重要影響因素，本試驗(yàn)所選取的3種碳源中，以麩皮作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時(shí)，菌株N3所產(chǎn)酶的活性最高，這是因?yàn)辂熎さ臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最為豐富，尤其是植物性蛋白質(zhì)的含量高達(dá)14%左右[18]，這為菌株產(chǎn)酶提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，從而獲得較高的纖維素酶活力；在以蛋白胨為氮源時(shí)，N3所產(chǎn)酶活性最高，這可能是因?yàn)榈鞍纂四軌蛱峁┯袡C(jī)氮，而硫酸銨和硝酸鉀只能夠提供無(wú)機(jī)氮元素；以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基所產(chǎn)酶活最低，這可能與滅菌前培養(yǎng)基發(fā)生反硝化反應(yīng)，造成氮元素的揮發(fā)和流失有關(guān)[19]。相比較而言，在大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)，考慮到成本，選擇硫酸銨為氮源更經(jīng)濟(jì)。

細(xì)菌性纖維素降解菌一般不具備完整的纖維素酶系，通常只能分泌1～3種組分[20-23]。本試驗(yàn)通過(guò)酶譜分析，觀察到一條清晰的水解條帶，說(shuō)明該菌株可能主要分泌一種胞外內(nèi)切纖維素酶組分。這為今后該酶基因的克隆、構(gòu)建酶高效表達(dá)系統(tǒng)、進(jìn)一步深入研究其酶學(xué)性質(zhì)提供了重要依據(jù)[24]。

纖維素酶在具體應(yīng)用過(guò)程中，需耐受一定的高溫，而且纖維素物質(zhì)的分解都是在少氧或缺氧環(huán)境中進(jìn)行[25]，因此篩選纖維素酶活高的厭氧及兼性厭氧細(xì)菌具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而高耐熱的細(xì)菌源纖維素酶也更利于實(shí)際操作和工業(yè)生產(chǎn)。許多細(xì)菌源纖維素酶的最適溫度在50 ℃左右[24]。本試驗(yàn)中，菌株N3所產(chǎn)纖維素酶的最適溫度為60 ℃，且在60～75 ℃時(shí)仍具有較高的酶活性，表明N3所產(chǎn)的纖維素酶具有較強(qiáng)的耐熱性，這為今后克隆其耐熱纖維素酶基因或純化耐熱纖維素酶直接應(yīng)用于動(dòng)物飼料提供了理論依據(jù)[26]。

本試驗(yàn)在研究菌株N3所產(chǎn)粗酶液對(duì)飼料粗纖維降解率時(shí)，應(yīng)用了尼龍袋法，該方法雖不能完全模擬動(dòng)物體內(nèi)的消化環(huán)境，但可以在一定程度上反映飼料中粗纖維在動(dòng)物體內(nèi)的總體消化情況[20]，這有利于生產(chǎn)中該酶制劑的科學(xué)添加。

木質(zhì)素是自然界第2位最豐富的有機(jī)物，木質(zhì)素的降解主要依賴木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶共同作用來(lái)完成，而目前研究最多的是漆酶，且近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶對(duì)環(huán)境污染問(wèn)題的治理起著重要的作用[14]。研究證實(shí)，許多枯草芽孢桿菌能分泌漆酶[27-28]。本試驗(yàn)利用RB亮藍(lán)脫色反應(yīng)定性檢測(cè)了菌株N3分泌漆酶的能力，發(fā)現(xiàn)菌株N3周圍均無(wú)脫色圈產(chǎn)生，表明該菌株不產(chǎn)生能夠降解木質(zhì)素的漆酶。

4結(jié)論

經(jīng)鑒定，供試?yán)w維素降解菌為枯草芽孢桿菌屬，命名為BacillussubtilisN3。菌株N3不分泌木質(zhì)素降解酶(漆酶)，主要分泌分子質(zhì)量約為70 ku以上的內(nèi)切纖維素酶組分。N3所產(chǎn)酶具有較強(qiáng)的耐熱性，最適溫度為60 ℃，最適pH為5.5，對(duì)飼料粗纖維具有較強(qiáng)的降解能力。菌株N3的最佳產(chǎn)酶條件為：接種量為1∶50(體積比)，分別以麩皮和蛋白胨為碳源和氮源，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5， 37 ℃培養(yǎng)時(shí)間24 h，在上述條件下，N3菌株所產(chǎn)纖維素酶的活力最高，約為3.50 U/mL。

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DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-06-0816:2010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.003

[收稿日期]2014-11-13

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31072060；31372343)；國(guó)家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-40-13)；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)(20130305905)

[作者簡(jiǎn)介]王堯悅(1992-),女,陜西臨潼人,在讀碩士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail:18792629437@163.com [通信作者]楊雨鑫(1977-),男,河南信陽(yáng)人,副教授，博士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。 E-mail:yxyang@nwsuaf.edu.cn

[中圖分類號(hào)]S821.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)07-0016-09

Identification of a cellulose-decomposing strain and its application for degrading different cellulosic materials

WANG Yaoyue,CAO Pinghua,CHEN Yulin,YANG Mingming,YANG Yuxin

(CollegeofAnimalScience&Technology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract：【Objective】 A cellulose-decomposing strain was identified,its optimal cultivating conditions for cellulase production were determined and the crude fiber utilization rate was tested to provide basis for its application.【Method】 A cellulosic decomposing bacterium was identified by morphology and 16S rDNA gene sequences.Then,the enzymatic properties of Bacillus subtilis N3 were studied and cultivation conditions for cellulase production were optimized.Degradation of three feedstuffs (wheat bran,wheat straw,oat straw) by cellulose from the strain N3 was conducted.The lignin decomposing capacity of the strain was also tested using brilliant blue RB method.【Result】 The strain was identified and named Bacillus subtilis N3.The optimal temperature and pH for the CMCase activity of the crude enzyme were 60 ℃ and 5.5,respectively.Zymogram analysis showed that one CMCase with molecular weight of 70 ku was primary secreted by Bacillus subtilis N3.The optimal conditions of producing cellulase were 24 h,37 ℃,wheat bran,peptone,initial pH 5.0 and 1∶50 for initial inoculums.The average activity of CMCase activity reached 3.5 U/mL.The highest degradation rate of crude fiber was observed for wheat bran,while the lowest degradation rate was for wheat straw.In addition,Bacillus subtilis N3 failed to produce laccase and could not degrade lignin.【Conclusion】 Cellulose-decomposing strain Bacillus subtilis N3 mainly secreted a cellulase with molecular weight of 70 ku and its degradability of crude fiber was strong.

Key words:Bacillus subtilis;cellulase;enzymatic property;cellulose degradation;zymographic analysis

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