PKHD1突變致兒童門脈高壓4例病例報(bào)告

顏艷燕 龔敬宇 施鶯燕 陸 怡 張梅紅 謝新寶 王建設(shè) 林 錦

·論著·

PKHD1突變致兒童門脈高壓4例病例報(bào)告

顏艷燕1,2龔敬宇2施鶯燕3陸 怡4張梅紅2謝新寶4王建設(shè)4林 錦1

目的 通過二代測序探討兒童不明原因門脈高壓的遺傳病因，以提高臨床認(rèn)識(shí)。方法 2012至2016年3月在復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院收治的4例不明原因的兒童門脈高壓病例，均進(jìn)行全外顯子測序或肝病基因Panel的高通量測序，對臨床表現(xiàn)進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果 4例患兒中，男1例，女3例，發(fā)病年齡3.3～6.4歲。主要臨床表現(xiàn)為上消化道出血3例，脾腫大4例，肝腫大2例；肝內(nèi)膽管擴(kuò)張1例；轉(zhuǎn)氨酶輕度升高2例。4例患兒影像學(xué)上均有腎臟病變，肝臟合成功能和腎功能均正常。二代基因測序及Sanger驗(yàn)證，4例患兒均在PKHD1基因上發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變，其中無義突變和經(jīng)典剪切位點(diǎn)突變各1個(gè)，缺失突變(移碼突變)和錯(cuò)義突變(少見位點(diǎn))各3個(gè)。例1外顯子32 上第4 481位堿基A缺損造成移碼突變和外顯子51的前1位內(nèi)含子區(qū)堿基G突變?yōu)锳影響剪切位點(diǎn)；例2外顯子24上第2 507位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第836位上的纈氨酸變?yōu)楸彼?，外顯子58上第9 568位堿基C突變?yōu)門，導(dǎo)致編碼第3 190位谷氨酰胺的密碼子變成終止密碼子。例3外顯子12上第847位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第283位上的苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔怙@子58上第9 455位密碼子A缺失導(dǎo)致移碼突變。例4外顯子61上第10 315位堿基G突變?yōu)門，導(dǎo)致第3 429位上的天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，外顯子27上第3 028至3 039位堿基缺失，并插入AGGT導(dǎo)致移碼突變。最終4例患兒均確診為常染色體隱性遺傳性多囊腎病。結(jié)論P(yáng)KHD1基因突變引起的常染色體隱性遺傳性多囊腎病是我國兒童門脈高壓的重要病因，二代基因測序是確診的有效手段。

門脈高壓； 多囊腎； 常染色體隱性遺傳； 基因； 兒童

1 病例資料

2012 年至2016年3月在復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院收治4例不明原因的兒童門脈高壓病例。表1顯示，男1例，女3例，發(fā)病年齡3.3～6.4(4.7)歲。生后均無窒息搶救史，生長發(fā)育無特殊記載，否認(rèn)毒物接觸史。例4患兒父親為乙肝病毒攜帶者，余父母均體健，否認(rèn)近親結(jié)婚及家族遺傳病史?；純壕驮\因上消化道出血2例，脾腫大1例，上消化道出血伴肝脾腫大1例。肝臟腫大2例，均為劍突下可達(dá)5 cm，4例脾臟腫大，左側(cè)肋緣下4～13 cm。移動(dòng)性濁音陽性1例，腹壁靜脈顯露明顯1例。 4例心肺及神經(jīng)系統(tǒng)查體均未見異常。

實(shí)驗(yàn)室檢查：2例患兒病程中有1次ALT輕度升高史，3例偶有血膽汁酸升高，余肝功能指標(biāo)均未見異常。血常規(guī)RBC(2.49～4.52)×1012·L-1；Hb 62.2～118 g·L-1；WBC(1.7～7.89)×109·L-1； PLT(36～245)×109·L-1。4例腎功能指標(biāo)(尿常規(guī)、尿素、肌酐和尿酸)均未見異常。2例病程中凝血酶原時(shí)間稍延長，1例活化部分凝血酶原時(shí)間稍升高。4例乙肝兩對半、丙肝、梅毒、HIV抗體、EB病毒及CMV抗體、銅藍(lán)蛋白、自身抗體等均未見異常。例1曾行骨髓穿刺術(shù)排除了骨髓疾病。

影像學(xué)檢查：例2～4行胃鏡檢查顯示食管胃底靜脈曲張，4例腹部CT及增強(qiáng)以及例1、3和4的磁共振胰膽管成像(MRCP)增強(qiáng)均可見食管胃底靜脈曲張征象(圖1A、B)。例3腹部B超顯示肝劍突下5 cm,但MRCP顯示肝臟肝裂增寬，體積略縮??；余3例MRCP均顯示肝臟腫大。例2和例3腹部B超發(fā)現(xiàn)肝臟左右葉比例失調(diào)，其中例2腹部CT和MRCP顯示肝臟右葉萎縮、左葉及尾狀葉增大伴肝內(nèi)膽管擴(kuò)張明顯(圖1C、D、E、F)。例3腹部B超曾顯示門靜脈主干部分海綿樣變性。B超顯示，4例均可見脾腫大、均可見雙側(cè)腎臟回聲增強(qiáng)， 3例伴腎臟強(qiáng)回聲光點(diǎn)；MRI顯示，例1、3和4雙側(cè)腎臟腫大，4例均發(fā)現(xiàn)腎臟有囊性信號(hào)改變。

表1 4例門脈高壓患兒的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

注 ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(參考值：7～40 U·L-1)；TBA：總膽汁酸(參考值：0～10 μmol·L-1)；PT：凝血酶原時(shí)間(參考值:12～14.8 s)；APTT：活化部分凝血酶原時(shí)間(參考值:28～44.5 s)

圖1 影像學(xué)圖像

2 基因檢測及結(jié)果

經(jīng)患兒父母知情同意后，留取患兒及其父母外周血1～1.5 mL(EDTA抗凝)，提取DNA，行二代基因測序。例1行人類全基因外顯子組測序(測序由上海天昊生物科技有限公司完成)，例2～4行包含代謝性肝病相關(guān)的多基因panel測序(測序由北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司和北京易德東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心完成)。測序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)分析后篩選出可疑致病突變，并對分析所得突變進(jìn)行患兒及其父母的Sanger測序驗(yàn)證。PKHD1基因與GenBank序列(NM_138694 )進(jìn)行比較。

搜索千人基因組數(shù)據(jù)庫(URL: http://www.1000genomes.org/)了解錯(cuò)義突變位點(diǎn)在人群的頻率。錯(cuò)義突變通過Mutation Taster[1]軟件進(jìn)行致病性預(yù)測，通過Polyphen-2[2]和SIFT[3](http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/，http://sift.jcvi.org/)軟件進(jìn)行氨基酸替換的致病性預(yù)測。在http://www.uniprot.org/uniprot/網(wǎng)頁上查詢PKHD1編碼的fibrocystin蛋白質(zhì)序列每一段氨基酸的功能，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫對人類和其他種屬的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。

表2 4例PKHD1基因檢測結(jié)果

注 1)核苷酸序列比對的參考序列是NM_138694 ；2)突變已在Liu等[9]的文獻(xiàn)中報(bào)道

4例均在PKHD1基因上發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變(表2)，無義突變和經(jīng)典剪切位點(diǎn)突變各1個(gè)，缺失突變和錯(cuò)義突變各3個(gè)；3個(gè)缺失突變均是移碼突變，3個(gè)錯(cuò)義突變均是少見位點(diǎn)，其致病性預(yù)測見表3。Mutation Taster顯示3個(gè)缺失突變和1個(gè)無義突變均會(huì)發(fā)生NMD(nonsense-mediated mRNA decay)作用。例1發(fā)現(xiàn)外顯子32 上第4 481位堿基A缺損造成移碼突變，外顯子51的前1位內(nèi)含子區(qū)堿基G突變?yōu)锳影響剪切位點(diǎn)，兩種突變致病性明確。例2發(fā)現(xiàn)外顯子24上第2 507位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第836位上的纈氨酸變?yōu)楸彼幔煌怙@子58上第9 568位堿基C突變?yōu)門，導(dǎo)致編碼第3 190位谷氨酰胺的密碼子變成終止密碼子；其中無義突變致病性明確，而錯(cuò)義突變經(jīng)Polyphen-2 和SIFT均預(yù)測氨基酸改變?yōu)橹虏⊥蛔儭?/p>

表3 PKHD1基因錯(cuò)義變異功能預(yù)測

注 MAF：千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫的最小等位基因頻率；Mutation TasterP值范圍為0～1，P值大小與致病性成正比；Polyphen-2分值范圍為0～1，分值大小與致病性成正比；SIFT分值范圍為0～1，分值大小與致病性成反比

圖2 不同物種纖囊素在283、836、3439位置上的氨基酸序列比對圖

例3發(fā)現(xiàn)外顯子12上第847位堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第283位上的苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔煌怙@子58上第9 455位密碼子A缺失導(dǎo)致移碼突變；其中移碼突變致病性明確，而錯(cuò)義突變在Mutation Taster和Polyphen-2均預(yù)測為致病突變。例4發(fā)現(xiàn)外顯子61上第10 315位堿基G突變?yōu)門，導(dǎo)致第3 429位上的天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?；外顯子27上第3 028至3 039位堿基缺失并插入AGGT，導(dǎo)致移碼突變；其中移碼突變致病性明確，而錯(cuò)義突變在3個(gè)預(yù)測軟件上均預(yù)測為致病突變。在蛋白保守性上，3個(gè)錯(cuò)義突變所累及的氨基酸均是高保守的氨基酸(圖2)。

2 討論

門脈高壓癥是由門脈系統(tǒng)血流受阻和(或)血流量增加導(dǎo)致門脈系統(tǒng)內(nèi)壓力升高，并在超過10 mm Hg[4]后所引發(fā)的一系列血流動(dòng)力學(xué)改變的臨床綜合征。門脈高壓的病因多樣，根據(jù)血流受阻部位可分為肝前性、肝性和肝后性。肝前性病因包括肝外門靜脈阻塞(門靜脈血栓形成)和脾靜脈血栓形成等。肝后性病因包括縮窄性心包炎和限制性心肌病等。而肝性病因可再分為竇前性、竇性和竇后性，包括先天性肝纖維化、特發(fā)性門脈高壓癥、維生素A過多癥和肝小靜脈阻塞等[5]。因門脈高壓病因廣泛，故門脈高壓的病因診斷十分困難。與成人相比，遺傳代謝病是兒童門脈高壓的重要病因。

本文報(bào)道的4例兒童期起病的門脈高壓患兒均以脾腫大或/和上消化道出血為就診原因，經(jīng)過二代測序，均在PKHD1基因上發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變。經(jīng)過詳細(xì)的影像學(xué)檢查，均伴有腎臟影像學(xué)異常改變，且患兒父母均否認(rèn)腎臟囊腫病史[6,7]，故患兒可確診為PKHD1基因突變引起的常染色體隱性遺傳性多囊腎病(ARPKD)，PKHD1基因突變引起的ARPKD是我國兒童門脈高壓的重要原因。

ARPKD的發(fā)病率為1∶20 000，人群致病基因的攜帶率為1/70[8]。其致病基因是位于6號(hào)染色體上的PKHD1基因，包含至少86個(gè)外顯子，最長的開放閱讀框由66個(gè)外顯子組成，編碼具有4 074個(gè)氨基酸的單次跨膜蛋白纖囊素(FPC)。FPC在膽管和腎小管上皮細(xì)胞的初級纖毛上高度表達(dá)，但其導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)制仍不明。迄今為止，AachenPKHD1 database (URL: http://www.humgen.rwth-aachen.de)中有748種基因突變，并且均不包括本文報(bào)道的8個(gè)突變位點(diǎn)。本文報(bào)道的突變中，c.9568C>T是無義突變，導(dǎo)致提前生成終止密碼。3個(gè)缺失突變均是框移突變，與無義突變一樣，將產(chǎn)生可被識(shí)別的異常mRNA,發(fā)生NMD作用，是致病性明確的病變。c.8108-1G>A是經(jīng)典的剪切位點(diǎn)突變，將改變mRNA形成過程中的剪切方式，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。3個(gè)錯(cuò)義突變中所累及的均是高度保守氨基酸，其中c.2507T>C是國內(nèi)已報(bào)道的突變位點(diǎn)[9]，c.847T> C突變所影響的氨基酸所在結(jié)構(gòu)是具有蛋白活性的功能域，c.10315G>T突變導(dǎo)致的氨基酸改變雖然不在已知的蛋白活性功能域，但經(jīng)軟件預(yù)測均是致病突變。

因?yàn)镻KHD1基因外顯子多，Sanger測序工作量巨大，因此國內(nèi)ARPKD的一代基因測序診斷較少見。隨著分子診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，二代基因測序的費(fèi)用不斷降低，在遺傳咨詢的需求下，具有高通量優(yōu)勢的二代基因測序成為診斷和鑒別ARPKD 與其他肝腎囊性纖維化病的有力手段。本文3例(例2～4)為1個(gè)雜合突變合并1個(gè)嚴(yán)重的缺失或無義突變，這與基因型與臨床型相關(guān)性的分析中認(rèn)為多數(shù)能渡過新生兒期的患兒至少有1個(gè)錯(cuò)義突變一致[10]。例1檢測到傳統(tǒng)意義上的2個(gè)嚴(yán)重突變：缺失和剪切位點(diǎn)突變，但患兒臨床表現(xiàn)為較輕的兒童期ARPKD，與通常認(rèn)為的合并有兩個(gè)嚴(yán)重致病突變會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的表型而致圍生期死亡的觀點(diǎn)不同[11,12]。因此在遺傳咨詢上，仍需警惕少數(shù)患兒盡管合并有2個(gè)嚴(yán)重突變，但在臨床上可表現(xiàn)為較輕的臨床表現(xiàn)。

ARPKD患兒的肝、腎受累程度差異大，兒童期起病多以肝臟受累為主，本文4例臨床上無腎功能受損表現(xiàn)，而僅有腎臟影像學(xué)異常。ARPKD患兒肝臟的臨床表現(xiàn)，文獻(xiàn)報(bào)道渡過新生兒期的ARPKD患兒中40%～50%有門脈高壓的表現(xiàn)；60%在5歲內(nèi)出現(xiàn)脾大；21%～52%出現(xiàn)肝脾腫大的體征；5%～37%出現(xiàn)食管靜脈曲張，16%～26%合并Caroli病[13-17]。ARPKD患兒幾乎均有不同程度的肝臟受累，因膽管板發(fā)育障礙表現(xiàn)為先天性肝纖維化、Caroli病以及同時(shí)合并前兩者的Caroli綜合征，并且這3種表現(xiàn)被認(rèn)為是疾病進(jìn)展過程中的不同嚴(yán)重程度的不同表現(xiàn)[18]。本文例2患兒在影像學(xué)上可見明顯的肝內(nèi)膽管囊狀擴(kuò)張，但是未行肝穿刺檢查，無法判斷是否合并先天性肝纖維化。根據(jù)患兒門脈高壓的臨床表現(xiàn)顯著推測患兒為ARPKD合并Caroli綜合征的可能性大。因此，臨床上對于表現(xiàn)為不明原因脾大、門脈高壓或肝內(nèi)膽管擴(kuò)張的兒童，需高度警惕該病，必要時(shí)行肝穿刺檢查。如果患兒肝臟病理上表現(xiàn)為特征性的先天性肝纖維化[19]，應(yīng)予患兒腎功能及腎臟的影像學(xué)檢查以協(xié)助診斷，并行基因檢測以明確疾病。

綜上所述，對于臨床表現(xiàn)為門脈高壓、脾腫大或肝內(nèi)膽管擴(kuò)張的患者，需警惕PKHD1基因突變引起的ARPKD，需要仔細(xì)進(jìn)行腎功能和腎臟影像檢查，并進(jìn)行包括PKHD1基因在內(nèi)的二代基因測序。

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(本文編輯：張崇凡)

PortalhypertensioncausedbyPKHD1mutationsinchildren: 4casesreport

YANYan-yan1,2,GONGJing-yu2,SHIYing-yan3,LUYi4,ZHANGMei-hong2,XIEXin-bao4,WANGJian-she4,LINJin1

(1DepartmentofNeonatology,SecondAffiliatedHospital,YuyingChildren'sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027; 2DepartmentofPediatrics,JinshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai201508; 3DepartmentofRadiology,Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102; 4DepartmentofInfectiousDisease,Children'sLiverCenter,Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China)

Corresponding Author：WANG Jian-she, E-mail: jshwang@shmu.edu.cn ; LIN-Jin, E-mail: Jing.Lin@mssm.edu

ObjectiveUsing the next generation sequencing to explore the etiology of Chinese children with portal hypertension, which was hard to be diagnosed by routine examinations.MethodsThe whole exome sequencing and hepatic panel were used to explore the cause of four children with portal hypertension hospitalized in Jinshan Hospital of Fudan University from 2012 to March 2016. The clinical features were summarized retrospectively.ResultsThe patients consisted of one male and three females, and their ages of onset ranged from 3.3 to 6.4 years with average age of 4.65 years. The main clinical features included upper gastrointestinal hemorrhage in three patients, splenomegaly in four patients, hepatomegaly in two patients, intra-hepatic bile duct dilation in one patient, elevation of serum alanine aminotransferase in two patients. Kidney lesions were detected by imaging in all patients, whereas both hepatic synthetic function and kidney function were tested to be normal. Finally, diverse compound heterozygous mutations were identified inPKHD1 gene in all patients by the next generation sequencing and confirmed by Sanger sequencing. The identifiedPKHD1 gene mutations included one nonsense mutation, one typical splicing site mutation, three deletion mutation induced frameshift mutations, and three rare missense mutations. c.8108-1G>A and c.4481delA p.N1494fs were identified in case 1, c.9568C>T p.Q3190X and c.2507T>C p.V836A were identified in case 2, c.9455delA p.N3152fs and c.847T>C p.F283L were identified in case 3, c.10315G>T p.D3439Y and c.3028-c.3039delGGAGAAGACCTCinsAGGT p.G1010fs were identified in case 4. All four children were diagnosed with autosomal recessive polycystic kidney disease. ConclusionAutosomal recessive polycystic kidney disease is an important cause of noncirrhotic portal hypertension in children, and the next generation sequencing is an effective method for diagnosis.

Portal hypertension; Polycystic kidney; Autosomal recessive; Gene; Children

新一輪上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(A類)：ZK2015A04；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：81570468

1 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院新生兒科 溫州， 325027；2 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院兒科 上海，201508；3 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院放射科 上海，201102；4 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院感染傳染科，兒童肝病中心 上海，201102

王建設(shè)， E-mail: jshwang@shmu.edu.cn；林錦，E-mail:jing.lin@mssm.edu

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.06.011

2016-08-19

2016-10-18)