pGH和IGF-Ⅰ雙基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)雙基因豬的獲得與檢測

姚延珠，吳明明，孫金海

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193）

pGH和IGF-Ⅰ雙基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)雙基因豬的獲得與檢測

姚延珠1，吳明明2，孫金海1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193）

旨在構(gòu)建可高效表達(dá)pGH基因和IGF-Ⅰ基因的雙基因共表達(dá)載體，制備轉(zhuǎn)雙基因（pGH+IGF-Ⅰ）豬，以期探索pGH基因和IGF-Ⅰ基因?qū)ωi生長發(fā)育的影響，為節(jié)糧型高瘦肉率新品種豬的培育奠定理論基礎(chǔ)。從長白豬耳樣中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄RT-PCR獲得pGH基因不含終止密碼子的編碼序列和IGF-Ⅰ基因完整的編碼序列，經(jīng)酶切連接克隆至pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體上，構(gòu)建pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因共表達(dá)載體。將其轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，Q-PCR檢測2個目的基因在PK15細(xì)胞中的表達(dá)情況。將構(gòu)建的雙基因共表達(dá)載體用納米材料包裹后轉(zhuǎn)染長白豬精子，采用精子載體法制備轉(zhuǎn)雙基因豬。PCR及測序鑒定轉(zhuǎn)雙基因陽性個體，Q-PCR檢測2個目的基因在轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)的表達(dá)情況。PCR及測序鑒定追蹤檢測轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)pGH基因和IGF-Ⅰ基因的穩(wěn)定情況。RT-PCR及測序結(jié)果表明，成功克隆了長白豬的pGH基因和IGF-Ⅰ基因的編碼序列。酶切和測序分析表明成功構(gòu)建了雙基因真核共表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后，Q-PCR檢測表明，pGH基因和IGF-Ⅰ基因均在mRNA水平成功表達(dá)。母豬妊娠獲得13頭仔豬，經(jīng)PCR及測序檢測，其中4頭仔豬為轉(zhuǎn)雙基因陽性，轉(zhuǎn)雙基因陽性率為30.76%。Q-PCR檢測外源pGH基因與IGF-Ⅰ基因在轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)成功表達(dá)。1～7月齡均可檢測到外源pGH基因與IGF-Ⅰ基因，證明2個外源基因在轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)穩(wěn)定存在，并未隨著生長而丟失。在轉(zhuǎn)雙基因公豬的精液中均能檢測到2個外源基因，證明外源基因存在穩(wěn)定傳代的可能。

pGH基因；IGF-Ⅰ基因；共表達(dá)；轉(zhuǎn)基因；長白豬

動物生長激素軸在動物的生長發(fā)育中有重要作用，其中下丘腦-GH-IGF-Ⅰ軸對動物的生長發(fā)育和各種機(jī)能的調(diào)控起重要作用。GH-IGF-Ⅰ軸與動物的生長和營養(yǎng)有密切關(guān)系，GH和IGF-Ⅰ均可獨(dú)立亦可共同促進(jìn)動物的生長發(fā)育，對神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼的發(fā)育以及肌肉的生長和脂肪的沉積有密切的調(diào)控作用［1-2］。有研究表明，下丘腦-GH-IGF-Ⅰ軸與疾病恢復(fù)和機(jī)體的長壽保健有關(guān)［3］。豬生長激素（Porcine grow th hormone，pGH）是由豬腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)激素，能夠促進(jìn)機(jī)體生長，并調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)代謝［4-5］。胰島素樣生長因子-Ⅰ（Insulin-like growth factor-Ⅰ，簡稱IGF-Ⅰ），是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，具有類似胰島素的作用，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，刺激骨基質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)骨骼和肌纖維的發(fā)育［6-8］。本試驗(yàn)選取下丘腦-GH-IGF-Ⅰ軸的2個關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建pGH和IGF-Ⅰ雙基因共表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平的表達(dá)驗(yàn)證后，采用精子介導(dǎo)納米載體法制備轉(zhuǎn)雙基因豬，獲得了轉(zhuǎn)雙基因陽性個體，并進(jìn)行了一系列分子水平的檢測。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)所用5袋新鮮長白豬精液（每袋容量80 mL）購自北京浩邦豬人工授精服務(wù)有限責(zé)任公司，所用1頭健康體況良好的經(jīng)產(chǎn)長白母豬來自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)習(xí)基地。

1.2 試驗(yàn)材料

pcDNA3.1（+）載體和PK15細(xì)胞由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。健康長白豬（60日齡）耳組織由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地提供。RNA isoPlus、Taq DNA聚合酶、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、PMD19-T載體、T4連接酶、內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhoⅠ、Hin dⅢ和Bam HⅠ均購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒（Total RNA Miniprep Purification Kit）購自GeneMark公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）購自Thermo公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（EndoFree Maxi Plasm id Kit）購自TIANGEN公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；SYBR GreenⅠMix購自ABI公司；試驗(yàn)中所用其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 pGH基因和豬IGF-Ⅰ基因的克隆及序列鑒定 參照GenBank中pGH基因（序列號：M17704.1）的CDS序列和IGF-Ⅰ基因（序列號：NM214256.1）的CDS序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)2個基因的上、下游引物。引物設(shè)計(jì)時去掉pGH基因CDS序列的終止密碼子，IGF-Ⅰ基因則設(shè)計(jì)可擴(kuò)增完整CDS序列的引物，并分別引入2對酶切位點(diǎn)。所設(shè)計(jì)2對引物及引入的酶切位點(diǎn)信息如表1所示。

表1 克隆pGH基因和IGF-Ⅰ基因所用引物序列及其酶切位點(diǎn)Tab.1 Prim er sequences and restriction enzym e sites in cloning of pGH gene and IGF-Ⅰgene

取健康長白豬（60日齡）耳組織后液氮低溫保存，總RNA的提取按照RNAisoPlus說明書進(jìn)行。根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用步驟獲得2個目的基因cDNA，RT-PCR反應(yīng)條件如下：pGH基因：95℃變性5 min；94℃40 s，58℃40 s，72℃40 s，共35個循環(huán)；最后72℃終延伸10 min；IGFⅠ-基因：95℃變性5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，并用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化兩目的基因片段，連接于PMD19-T載體，獲得重組質(zhì)粒PMD19-T-pGH和PMD19-T-IGF-Ⅰ，分別將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后，挑選經(jīng)PCR鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，送于北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.3.2 pcDNA3.1（+）-pGH-IGFⅠ-雙基因重組載體的構(gòu)建及鑒定 采用限制性內(nèi)切酶Hin dⅢ和Bam HⅠ分別消化重組質(zhì)粒PMD19-T-pGH和pcDNA3.1（+）載體質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒回收pGH片段和pcDNA3.1（+）載體片段，T4連接酶連接獲得pcDNA3.1（+）-pGH重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆后提取pcDNA3.1（+）-pGH重組質(zhì)粒，內(nèi)切酶Hin dⅢ和Bam HⅠ對其進(jìn)行雙酶切鑒定。經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，將pcDNA3.1（+）-pGH重組質(zhì)粒和PMD19-T-IGF-Ⅰ重組質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶Eco RⅠ和XhoⅠ酶切消化，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒回收pcDNA3.1（+）-pGH重組載體片段和IGF-Ⅰ片段，T4連接酶連接后得到pcDNA3.1（+）-pGHIGF-Ⅰ雙基因重組載體。雙基因重組質(zhì)粒圖譜見圖1。

圖1 pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組載體圖譜Fig.1 pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰdoub le genes recom binan t vector p rofile

將pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑選陽性單克隆菌落在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，EndoFree Maxi Plasmid Kit提取質(zhì)粒。所提質(zhì)粒送于北京六合華大基因科技有限公司測序。參照pcDNA3.1（+）載體圖譜多克隆位點(diǎn)的順序和所連接2個目的基因的先后順序，將上述提取的雙基因重組質(zhì)粒分3組，分別進(jìn)行雙酶切鑒定，內(nèi)切酶組合及對應(yīng)所得預(yù)期片段大小見表2。

表2 三組雙酶切鑒定pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組質(zhì)粒Tab.2 Th ree groups of doub le enzym e digestion of pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰrecom binant p lasm id

1.3.3 雙基因重組載體在PK15細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)檢測 將培養(yǎng)的PK15細(xì)胞分3個轉(zhuǎn)染組：只加DMEM培養(yǎng)基的A組（空白對照組），LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空載體的B組（陰性對照組），Lipofectam ineTM2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組載體的C組（試驗(yàn)組）。按照Lipofectam ineTM2000使用說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每組均在相同培養(yǎng)條件下做3個重復(fù)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞傳一代，總RNA提取使用Total RNA Miniprep Purification Kit試劑盒，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，應(yīng)用兩步法Q-PCR對各組pGH mRNA和IGF-ⅠmRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測，引物見表3。2-ΔΔCt法分析各組pGH mRNA和IGF-ⅠmRNA的相對表達(dá)量，用SPSS 17.0軟件對各組表達(dá)量進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

表3 pGH基因、IGF-Ⅰ基因和內(nèi)參β-Actin基因的Q-PCR引物Tab.3 17 prim er sequences of pGH gene，IGF-Ⅰgene andβ-Actin gene

1.3.4 轉(zhuǎn)雙基因（pGH+IGF-Ⅰ）豬的制備 隨機(jī)挑選1頭體況良好的經(jīng)產(chǎn)母豬，發(fā)情后對其進(jìn)行人工授精。精子與納米載體及雙基因載體的處理方法參照吳明明［9］的步驟。

1.3.5 轉(zhuǎn)雙基因（pGH+IGF-Ⅰ）豬的檢測 轉(zhuǎn)雙基因（pGH+IGF-Ⅰ）豬的PCR及測序鑒定：采取初生仔豬的耳組織，酚-氯仿抽提法提取DNA，以抽提的DNA為模板進(jìn)行pGH基因和IGF-Ⅰ基因的PCR檢測，檢測的引物及擴(kuò)增條件與1.3.1中的一致。

Q-PCR檢測轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)pGH基因和IGF-Ⅰ基因的表達(dá)情況：采取2月齡試驗(yàn)豬的耳組織樣，液氮低溫保存。提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行Q-PCR檢測，具體方法和結(jié)果已經(jīng)發(fā)表［10］。

轉(zhuǎn)雙基因豬1～7月齡pGH基因和IGF-Ⅰ基因的檢測：采取轉(zhuǎn)雙基因豬1～7月齡的耳樣，分別進(jìn)行PCR檢測，PCR引物及擴(kuò)增條件見1.3.1。將擴(kuò)增產(chǎn)物送于六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

轉(zhuǎn)雙基因公豬精液中pGH基因和IGF-Ⅰ基因的檢測：待轉(zhuǎn)雙基因公豬性成熟后，采集其精液，提取DNA，進(jìn)行pGH基因和IGF-Ⅰ基因的PCR檢測，PCR引物及擴(kuò)增條件見1.3.1。將擴(kuò)增產(chǎn)物送于六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGH基因和豬IGF-Ⅰ基因的克隆及鑒定

從長白豬耳組織中提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用所設(shè)計(jì)的pGH基因和IGF-Ⅰ基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增片段的大小分別為648，393 bp（圖2），與預(yù)期的兩基因片段大小相符。將其回收純化后分別克隆至PMD19-T載體上，測序結(jié)果分別與GenBank中pGH基因CDS序列（不含終止密碼子）和IGF-Ⅰ基因CDS序列完全一致。

圖2 pGH基因和IGF-Ⅰ基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 RT-PCR products of pGH gene and IGF-Ⅰgene

2.2 pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組載體的鑒定

將pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組載體分別酶切（表2），酶切結(jié)果與表2中預(yù)期大小相符（圖3），其中C組的1 077 bp處為pGH基因和IGF-Ⅰ基因在雙基因重組載體上所對應(yīng)的融合長度。

圖3 酶切鑒定pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組載體Fig.3 Restriction enzym es d igestion of recom binant vector of pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ

將pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，送于北京六合華大基因科技有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件與對應(yīng)重組載體序列比對一致。

2.3 Q-PCR檢測pGH基因和IGF-Ⅰ基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)果

應(yīng)用兩步法Q-PCR對各組細(xì)胞中pGH基因和IGFⅠ-基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組（C組）pGH mRNA表達(dá)量分別是空白對照組（A組）和空載體組（B組）的146，98倍，均明顯高于空白對照組（A組）和空載體組（B組），差異極顯著（P＜0.01），IGF-ⅠmRNA的表達(dá)量分別是空白對照組（A組）和空載體組（B組）的145，98倍，差異極顯著（P＜0.01）（圖4）。證明pcDNA3.1（+）-pGH-IGFⅠ-雙基因重組載體在PK15細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄，pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因重組載體構(gòu)建成功。

圖4 Q-PCR檢測PK 15細(xì)胞中pGH m RNA和IGF-Ⅰm RNA的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of pGH m RNA and IGF-Ⅰm RNA in PK 15 cells detected by Q-PCR

2.4 轉(zhuǎn)雙基因豬PCR檢測及測序結(jié)果

母豬妊娠獲得13頭仔豬，經(jīng)PCR及測序檢測，其中4頭仔豬為轉(zhuǎn)雙基因陽性，轉(zhuǎn)雙基因陽性率為30.76%。pGH基因與IGFⅠ-基因的PCR檢測結(jié)果如圖5所示，均獲得與目的基因大小相符合的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后的序列與GenBank中pGH基因（序列號：M17704.1）的序列和IGF-Ⅰ基因（序列號：NM214256.1）的序列相符合。對轉(zhuǎn)雙基因陽性豬1～7月齡的PCR檢測結(jié)果均為陽性，證明2個外源基因在轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)穩(wěn)定存在，并未隨著生長而丟失。

圖5 pGH基因和IGF-Ⅰ基因的PCR檢測結(jié)果Fig.5 PCR resu lts of pGH gene and IGFⅠ-gene

2.5 Q-PCR檢測pGH基因和IGF-Ⅰ基因在轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)的表達(dá)結(jié)果

以β-Actin作為內(nèi)參基因，通過熒光定量PCR對轉(zhuǎn)雙基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)pGH基因和IGF-Ⅰ基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，對同時期轉(zhuǎn)雙基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)pGH基因和IGF-Ⅰ基因表達(dá)量的差異進(jìn)行分析比較，轉(zhuǎn)雙基因豬pGH mRNA平均表達(dá)水平是同期非轉(zhuǎn)基因豬的1.2倍，IGF-ⅠmRNA平均表達(dá)水平是同期非轉(zhuǎn)基因豬的1.53倍，而且并非每頭轉(zhuǎn)雙基因豬體內(nèi)pGH與IGF-Ⅰ基因的表達(dá)量均高于非轉(zhuǎn)基因豬［10］。

2.6 轉(zhuǎn)雙基因豬公豬精液中pGH基因和IGF-Ⅰ基因的檢測結(jié)果

待轉(zhuǎn)雙基因陽性公豬個體達(dá)到性成熟和體成熟之后，采集其精液，提取精子DNA，進(jìn)行pGH基因和IGF-Ⅰ基因的PCR檢測及測序鑒定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖6所示，均得到與pGH基因（648 bp）和IGF-Ⅰ基因（393 bp）片段大小相符的目的條帶。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果均與pGH基因和IGF-Ⅰ基因序列完全一致。證明所轉(zhuǎn)外源pGH基因和IGF-Ⅰ基因存在穩(wěn)定傳代的可能。

圖6 精液中pGH基因和IGF-Ⅰ基因的PCR檢測Fig.6 PCR detection of pGH gene and IGF-Ⅰgene in sem en

3 討論

3.1 關(guān)于雙基因載體的討論

目前制備轉(zhuǎn)雙基因或多基因動物的方法主要有2種：一是將2種或多種單基因載體混合轉(zhuǎn)染，幾種單基因載體的比例可以調(diào)節(jié)，但需分別構(gòu)建單基因載體，操作繁瑣，試驗(yàn)周期較長；二是通過調(diào)節(jié)啟動子、融合蛋白或插入IRES序列等方法直接構(gòu)建雙基因或多基因共表達(dá)載體，可一次性獲得可同時表達(dá)2個或多個基因的載體。就mRNA水平的表達(dá)驗(yàn)證來看，2013年鞠輝明等［11］構(gòu)建整合型誘導(dǎo)表達(dá)豬生長激素（pGH）載體，添加DOX后36 h的細(xì)胞組中pGH表達(dá)活性較對照組高70多倍，而安磊等［12］于2013年構(gòu)建小鼠Fyn及其多種突變體的載體，Q-PCR檢測試驗(yàn)組目的基因不同突變體的表達(dá)量較對照組高出300～400倍。本試驗(yàn)構(gòu)建的豬pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后，2個目的基因均成功轉(zhuǎn)錄，pGH基因和IGF-Ⅰ基因mRNA的表達(dá)量分別是空白對照組的146，145倍，2個目的基因mRNA的表達(dá)量接近于1∶1，這與2個目的基因融合表達(dá)，共用一個啟動子有關(guān)。

3.2 對所用轉(zhuǎn)基因方法及所得轉(zhuǎn)基因率的分析討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的近30年來，人們嘗試的方法有近10余種，但成熟的技術(shù)并不多。目前，用于制備轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有：DNA顯微注射法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、體細(xì)胞核移植技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法和精子載體法等。目前，較為成熟和公認(rèn)的方法仍然是受精卵原核的顯微注射法。但是應(yīng)用在大動物方面，其成功率較低，一般認(rèn)為不超過2%。胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法可獲得較好的整合率，可使基因整合率在受體動物體細(xì)胞中達(dá)到50%，在生殖細(xì)胞中的整合率也能達(dá)到30%［13］。但該技術(shù)在大動物上的應(yīng)用較晚，技術(shù)難度較大。體細(xì)胞核移植法，理論上基因整合率可達(dá)100%，但該技術(shù)應(yīng)用于豬上的克隆效率較低［14］。反轉(zhuǎn)錄病毒感染法能有效地將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)，且易整合到宿主染色體上，可獲得較高的基因表達(dá)效率［15］。但該法的成功率較低，且通過該方法制備的轉(zhuǎn)基因動物一般表現(xiàn)為嵌合體形式。

精子載體法利用受精的自然過程避免了人為機(jī)械操作對胚胎造成的損傷，轉(zhuǎn)基因效率較高。雖然存在一定的不穩(wěn)定性，但較以上其他幾種轉(zhuǎn)基因方法相比，其成本低廉，技術(shù)操作簡單，且轉(zhuǎn)基因率較高，比較適合應(yīng)用于大型哺乳動物的轉(zhuǎn)基因研究，在大型哺乳動物轉(zhuǎn)基因遺傳育種方面有重要的研究意義和廣闊的應(yīng)用前景。精子載體法的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，但從目前的諸多報(bào)道來看，其轉(zhuǎn)基因率是較高的。且較其他方法相比，其操作技術(shù)相對簡單，無需高昂精密的特殊操作儀器和復(fù)雜繁瑣的操作技術(shù)，成本較低，比較適用于豬等大型轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備研究。目前已經(jīng)成功的制備出了多種轉(zhuǎn)基因動物，其轉(zhuǎn)基因陽性率波動范圍較大，但大部分都較高。這可能也與具體的介導(dǎo)材料或?qū)拥奶幚矸椒ú灰粯右灿嘘P(guān)。

納米材料一般是物理結(jié)構(gòu)上達(dá)到納米級的結(jié)構(gòu)材料，尺寸通常在1～100 nm，由于其特定的大小使納米粒子表現(xiàn)出特殊的光學(xué)、熱學(xué)、力學(xué)和磁學(xué)等特性。因納米基因載體對外源基因具有保護(hù)作用、穿透性強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率高及安全低毒無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，近年來在動植物育種領(lǐng)域引起了越來越多的關(guān)注［16］。

本試驗(yàn)用納米材料包裹精子，成功地用精子載體法制備出轉(zhuǎn)雙基因豬，轉(zhuǎn)雙基因陽性率為30.76%，證明該方法處理精子可獲得較高的陽性率。王守棟等［17］同樣使用納米材料介導(dǎo)的精子載體法成功制備出轉(zhuǎn)CuZnSOD基因豬，PCR檢測陽性率為30.23%，與本試驗(yàn)的結(jié)果相接近，同時也證明了該方法的可行性和高效性。

3.3 本研究的意義

我國地方品種豬生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化效率較低，背膘較厚，胴體中瘦肉少而肥肉多［18］，培育瘦肉率高、節(jié)糧型豬品種是豬遺傳育種領(lǐng)域的目標(biāo)之一。而生長是一個復(fù)雜的過程，它受到各種激素、主動因子、輔助因子之間相互作用的影響，也受到營養(yǎng)條件和環(huán)境因素的影響，其中生長激素軸（生長激素釋放激素、生長抑素、生長激素、生長激素受體、胰島素樣生長因子等）起著主要的作用［19］。下丘腦-GHIGF-Ⅰ軸是一個重要的體內(nèi)分泌代謝軸，對生長發(fā)育的調(diào)控貫穿動物的整個生命過程［20］。本研究針對生長軸的激素分泌特點(diǎn)，以期探索下丘腦-GH-IGF-Ⅰ軸中的關(guān)鍵基因pGH基因和IGF-Ⅰ基因共同對豬生長發(fā)育的生物學(xué)影響，通過RT-PCR法獲得以上2個目的基因的CDS序列，構(gòu)建pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ雙基因真核表達(dá)載體，應(yīng)用精子介導(dǎo)納米載體法成功制備出轉(zhuǎn)雙基因（pGH+IGF-Ⅰ）豬，為pGH基因和IGF-Ⅰ基因的生物學(xué)功能研究及節(jié)糧型高瘦肉率新品種豬的培育奠定理論基礎(chǔ)。

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Construction of Eukaryotic Co-exp ression Plasm id Carrying pGH and IGF-ⅠGene and It′s Transform ation in Land race

YAO Yanzhu1，WU Mingming2，SUN Jinhai1
（1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to explore the effects of pGH and IGF-Ⅰon the growth and development of Landrace，eukaryotic co-expression plasmid containing pGH and IGF-Ⅰwas constructed and transfected into Landrace，which will lay the foundation for the cultivation of new breed of feed-saving grain pigs.Total RNA was extracted from the ear tissue of Landrace pig，and the coding sequence of pGH without term ination codon and complete coding sequence of IGF-Ⅰwere amp lified by RT-PCR and cloned into the pcDNA3.1（+）eukaryotic expression vector after verified by sequencing.The recombinant p lasmid was verified by sequencing and enzyme digestion and then transfected into PK15 cells.Expression of the two genes in PK15 cells was detected by Q-PCR.Transgenic pigs were prepared with sperm-mediated transformation after the sperm were encapsulated by nanometermaterial.Transgenic pigs were identified by PCR and sequencing.The expression of the two target geneswere detected by Q-PCR.Stability of transgene was detected by PCR and sequencing aged from 1 month to 7 month.RT-PCR and sequencing results showed thatthe coding sequences of pGH and IGF-Ⅰof Landrace were successfully cloned.Digestion and sequencing analysis showed the eukaryotic co-expression vector containing pGH and IGF-Ⅰwas successfully constructed，and Q-PCR analysis showed that pGH and IGF-Ⅰwere successfully expressed at the mRNA level after transfected into PK15 cells.As a result，13 young piglets were born，and 4 of them were positive for both two genes detected by PCR and sequencing.As a result，the positive rate was 30.76%.Q-PCR results showed that exogenous pGH and IGF-Ⅰwere successful expressed in transgenic pigs.Exogenous pGH and IGF-Ⅰcould be detected in transgenic positive individuals from aged 1 month to 7 month，which proved the two exogenous genes were stable in transgenic pigs and were not lost in growth process.Exogenous pGH and IGF-Ⅰcould be detected in sperm of transgenic boars showed that exogenous pGH and IGF-Ⅰmay be passaged stable.

pGH；IGF-Ⅰ；Co-expression；Transgene；Landrace

Q78；S828 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-7091（2016）03-0094-07

10.7668/hbnxb.2016.03.014

2016-03-09

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX08006-003）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目

姚延珠（1987-），女，山東昌邑人，碩士，主要從事動物分子遺傳研究。

孫金海（1959-），男，山東濰坊人，教授，博士，主要從事細(xì)胞遺傳和分子遺傳學(xué)研究。