梁山慈竹高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析

王身昌，胡尚連，曹 穎，徐 剛

（1.西南科技大學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽 621010；

2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽 621010）

梁山慈竹高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析

王身昌1，2，胡尚連1，2，曹 穎1，2，徐 剛1，2

（1.西南科技大學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽 621010；

2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽 621010）

分析梁山慈竹及其體細(xì)胞突變體的轉(zhuǎn)錄組，挖掘功能基因并對(duì)其差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析，為梁山慈竹遺傳改良提供理論依據(jù)。利用RNA-Seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行de novo拼接和功能注釋；并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選及COG、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)注釋，此外，基于Swiss-Prot功能注釋結(jié)果，分析纖維素和木質(zhì)素相關(guān)功能基因的表達(dá)量差異。測(cè)序結(jié)果表明，共獲得86 575 631條reads，de novo組裝得到84 741條unigenes，共有49 829條被Nr、COG、GO、KEGG、Swiss-Prot注釋。從梁山慈竹實(shí)生植株（對(duì)照）和體細(xì)胞突變體No.30這2個(gè)測(cè)序樣本中，篩選出3 572條差異表達(dá)unigenes，757條差異表達(dá)unigenes在COG分類體系中具有詳細(xì)的蛋白功能釋義，2 213條差異表達(dá)unigenes在GO數(shù)據(jù)庫具有功能定義，385條unigenes被注釋到94條KEGG Pathways中。纖維素合成相關(guān)纖維素合酶、過氧化物酶、泛素連接酶和熱休克蛋白在梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30中表達(dá)量升高，木質(zhì)素合成相關(guān)MYB4、4-香豆酸CoA連接酶、肉桂醇脫氫酶、肉桂酰-CoA還原酶和漆酶在突變體中表達(dá)量降低。提供了全面的梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組信息，獲得了一批在梁山慈竹纖維素和木質(zhì)素生物合成過程中有重要功能的基因序列。

梁山慈竹；體細(xì)胞突變體；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因

轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程中的分子機(jī)理［1］。轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多個(gè)非模式生物的研究，如藍(lán)莓經(jīng)高通量測(cè)序篩選得到大量與抗氧化劑合成相關(guān)的候選基因，并基于果皮和果肉2個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)基因，初步分析與類黃酮抗氧化劑合成相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄因子［2］；麻竹經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，篩選出與木質(zhì)素合成、生長發(fā)育相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄因子，為麻竹基因組學(xué)研究提供非常有價(jià)值的資源［3］。

梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）是西南地區(qū)一個(gè)重要的叢生經(jīng)濟(jì)竹種，具有抗寒、耐瘠薄、纖維素含量高、材性好等特點(diǎn)，是制漿造紙的優(yōu)良原料［4］。以往對(duì)梁山慈竹的研究主要集中在生長特性［5］、理化特性與纖維形態(tài)［6］、細(xì)胞壁機(jī)械特性［7］等方面，而由于缺乏梁山慈竹生長發(fā)育以及品質(zhì)特性等相關(guān)分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究，通過基因工程手段培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的梁山慈竹研究進(jìn)展緩慢?；谵D(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)，本試驗(yàn)獲得并構(gòu)建了梁山慈竹實(shí)生植株以及體細(xì)胞突變體No.30和No.66［8］的轉(zhuǎn)錄組unigenes庫，并基于梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30纖維素和木質(zhì)素含量均比實(shí)生植株高的特點(diǎn)［9］，篩選出與纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達(dá)基因，為今后梁山慈竹優(yōu)質(zhì)性狀相關(guān)基因的克隆以及功能分析等研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

梁山慈竹unigenes庫的構(gòu)建選用3份材料：梁山慈竹成熟種胚離體誘導(dǎo)再生植株No.30、No.66以及同期生長的梁山慈竹實(shí)生植株（CK），2013年9月于西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院資源圃分別采集No.30、No.66和CK同期生長30 d、高度一致的梁山慈竹竹筍，并分成上、中、下3個(gè)部位，每個(gè)部位分別剪碎并充分混合，然后每個(gè)部位均取等量樣品并充分混勻，液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取 參照RNAprep pure Plant Kit（TIANGEN BIOTECH公司）說明書上的方法提取竹筍總RNA，瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)用于檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.2.2 測(cè)序文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 提取的竹筍總RNA經(jīng)NEBNext Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module（NEB，7490）富集mRNA，緩沖劑（Fragmentation）對(duì)RNA片段化處理。以mRNA為模板，采用隨機(jī)引物法，用NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illum ina（NEB，E6110）和NEBNext Multiplex Oligos for Illum ina（NEB，E7500）構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫。構(gòu)建好的文庫用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫插入片段大小，然后用Library Quantification Kit-Illum ina GA Universal（Kapa，KK4824）進(jìn)行QPCR定量。檢測(cè)合格的文庫在Illumina cbot上進(jìn)行簇的生成，最后用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝及差異表達(dá)基因篩選 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的原始序列經(jīng)過去除雜質(zhì)和冗余處理后，利用Trinity［10］軟件對(duì)經(jīng)過過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行de novo拼接，得到各個(gè)樣本的Contig，隨后根據(jù)Contig結(jié)果，利用paired-end信息做進(jìn)一步的序列拼接，得到各個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄本Transcript，在轉(zhuǎn)錄本聚類單元中選取最主要的Transcript作為各個(gè)樣本的unigenes序列。

差異表達(dá)基因的篩選是建立在同一套參考基因的基礎(chǔ)上，對(duì)各樣本得到的unigenes數(shù)據(jù)通過cd-hit聚類去冗余，采用TGICL的聚類組裝策略最終得到非冗余的梁山慈竹筍期All-unigenes數(shù)據(jù)庫，并通過RPKM［11］（Reads per kilobase per million mapped reads）計(jì)算樣本間的基因表達(dá)差異。差異表達(dá)基因的篩選條件：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate）＜0.01且RPKM值的倍數(shù)變化（Fold Change）在2倍以上。

1.2.4 功能注釋、分類及代謝途徑分析 利用Blast軟件（E-value＜1e-05）將梁山慈竹All-unigenes序列及差異表達(dá)基因序列分別與Nonredundant protein（Nr）、UniProt/Swiss-Prot、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）和Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，獲得梁山慈竹All-unigenes及差異表達(dá)基因的功能注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 Illum ina H iSeqTM 2000測(cè)序和序列拼接

提取筍RNA通過Illum ina平臺(tái)測(cè)序，共得到86 575 631條reads，總堿基數(shù)為17.48 Gb。Q30值均達(dá)到80.00%以上（表1），可見，本次測(cè)序量與測(cè)序質(zhì)量為后續(xù)的數(shù)據(jù)組裝提供很好的原始數(shù)據(jù)。CK以及No.30和No.66經(jīng)高通量測(cè)序，整合得到梁山慈竹unigenes 84 741條，總長度為72.70 Mb， ?平均長度約為857.89 bp，N50長度為1 595 bp。長度為200～300 bp的unigenes所占比例最大，為31.86%；長度大于1 kb的unigenes有23 111條；所占比例為27.27%（表2）。

表1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Summ ary of Sam p le sequencing data

表2 梁山慈竹A ll-unigenes長度分布Tab.2 Distribution of A ll-unigenes length of Dendrocalamus farinosus

2.2 梁山慈竹轉(zhuǎn)錄物A ll-unigenes的功能注釋

為從整體上了解轉(zhuǎn)錄物All-unigenes序列功能信息，對(duì)拼接組裝的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫比對(duì)、注釋。通過NCBI的BlastX比對(duì)，有49 688條轉(zhuǎn)錄物被注釋到Nr數(shù)據(jù)庫，36 907條轉(zhuǎn)錄物被注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（表3）。84 741條轉(zhuǎn)錄物中共有49 829條得到注釋。

2.3 差異表達(dá)基因的分析

2.3.1 差異表達(dá)基因的篩選 梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30纖維素和木質(zhì)素含量均明顯高于CK，基于CK與No.30這2個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選纖維素和木質(zhì)素生物合成相關(guān)差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因的篩選與分析有助于初步了解No.30高纖維素和木質(zhì)素含量產(chǎn)生的機(jī)制并能為相關(guān)基因克隆提供重要基因序列信息。從2個(gè)樣本unigenes庫中共有3 572條差異表達(dá)unigenes被篩選出來，2 655條被注釋到Nr數(shù)據(jù)庫，2 062條被注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（表4）。

表3 梁山慈竹A ll-unigenes功能注釋Tab.3 A ll-unigenes function annotation of Dendrocalamus farinosus

表4 注釋的差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab.4 Summ ary of differen tial expression gene annotated

2.3.2 差異表達(dá)基因的COG分析 COG數(shù)據(jù)庫的目的是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。在COG分類體系中，757條差異表達(dá)unigenes具有詳細(xì)的蛋白功能釋義，共獲得1 086個(gè)COG注釋，涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝等25個(gè)COG功能分類。一般功能注釋（General function prediction only）代表最大的一類，所占比例為25.10%；其次復(fù)制、重組、修復(fù)（Replication，recombination and repair）所占比例為17.17%（圖1）。此外，該轉(zhuǎn)錄組還主要涉及轉(zhuǎn)錄（Transcription）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（Signal transduction mechanisms）、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝（Carbohydrate transport and metabolism）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（Amino acid transport and metabolism）等功能定義。

圖1 差異表達(dá)基因的COG功能分類Fig.1 Differential expression gene COG function classification

2.3.3 差異表達(dá)基因的GO分析 為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能，篩選得到序列注釋到GO數(shù)據(jù)庫，有2 213條差異表達(dá)unigenes具有功能定義，分別注釋到細(xì)胞組分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）、生物過程（Biological process）3個(gè)大的功能類別，而上述3大功能類別又可以被劃分為更詳細(xì)的62個(gè)亞類，分別包含了18，18，26個(gè)功能亞類（圖2）。在細(xì)胞組分功能類型中，細(xì)胞（Cell）和細(xì)胞部分（Cell part）2個(gè)功能亞類所占比例最高；在分子功能類型中，結(jié)合（Binding）和催化活性（Catalytic activity）2個(gè)功能亞類所占比例最高；在生物過程功能類型中，細(xì)胞過程（Cellular process）和代謝過程（Metabolic process）所占比例最高。

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋Fig.2 Differential expression gene GO function annotation

2.3.4 差異表達(dá)基因KEGG Pathway功能注釋基因間的相互作用對(duì)于生物體行使生物學(xué)功能有著非常重要的作用，為了鑒定在代謝或者信號(hào)通路中顯著富集的基因，將差異表達(dá)基因映射到KEGG數(shù)據(jù)庫，得到385個(gè)功能定義，被注釋到94條KEGG Pathways中。差異表達(dá)基因注釋序列最多的10條代謝通路為：嘌呤代謝（Purine metabolism）、光合有機(jī)體碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）、苯丙烷類生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）等（表5）。

表5 差異表達(dá)基因KEGG功能注釋Tab.5 Differential expression genes KEGG function annotation

2.3.5 纖維素和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達(dá)基因分析 依據(jù)差異表達(dá)基因在Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫功能釋義，并根據(jù)RPKM值大小對(duì)纖維素和木質(zhì)素生物合成相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，纖維素合酶、過氧化物酶、泛素連接酶和熱休克蛋白在梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30中表達(dá)量升高，MYB4、4-香豆酸CoA連接酶、肉桂醇脫氫酶、肉桂酰-CoA還原酶和漆酶在突變體中表達(dá)量降低（表6）。

表6 纖維素和木質(zhì)素生物合成相關(guān)差異表達(dá)基因Tab.6 Differential expression gene related to cellulose and lignin biosynthesis

3 討論

伴隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，擬南芥［12］、水稻［13］、毛竹［14］等基因組得到測(cè)序，但是由于價(jià)格昂貴，大多數(shù)植物的基因組并不能得到測(cè)序。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)于挖掘基因以及加深非模式植物生長和發(fā)育的理解提供了新方法。為盡可能完整獲得梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組信息，本試驗(yàn)選用了包括梁山慈竹實(shí)生植株及其體細(xì)胞突變體No.30、No.66在內(nèi)的3份梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序共獲得17.48 Gb數(shù)據(jù)量，reads數(shù)86 575 631條，de novo組裝后獲得84 741條unigenes，其中長度在1 kb以上unigenes有23 111條。這些結(jié)果表明，本研究所采用的雙端測(cè)序（paired-end）的方法，增加了測(cè)序深度，同時(shí)也提高了de novo拼接的效率和準(zhǔn)確性［15］。

梁山慈竹All-unigenes以及差異表達(dá)基因在Nr以及GO等數(shù)據(jù)庫的注釋信息，為基因組數(shù)據(jù)嚴(yán)重匱乏的梁山慈竹開展功能基因組學(xué)研究提供了新的思路和方法。KEGG注釋結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因富集的通路主要有碳的固定、苯丙烷類生物合成等生物化學(xué)途徑，這些途徑與纖維素和木質(zhì)素生物合成有緊密的聯(lián)系。根據(jù)Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫功能釋義，從梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30植株中發(fā)現(xiàn)2個(gè)具有差異表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，部分MYB類轉(zhuǎn)錄因子通常結(jié)合到木質(zhì)素合成基因啟動(dòng)子區(qū)域的AC元件調(diào)控苯丙烷代謝途徑［16］。有研究表明，MYB4對(duì)苯丙烷代謝途徑表現(xiàn)出不同的調(diào)控效應(yīng)［17-18］，本試驗(yàn)中梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30中MYB4的下調(diào)表達(dá)對(duì)苯丙烷代謝途徑的調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。MYB5則被認(rèn)為主要參與到種皮的發(fā)育過程［19］。在4-香豆酸CoA連接酶、肉桂醇脫氫酶和肉桂酰-CoA還原酶等木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)的同時(shí)，推測(cè)過氧化物酶上調(diào)表達(dá)是其木質(zhì)素含量升高的重要原因。纖維素合酶7在纖維素合成過程中發(fā)揮重要作用［20］，梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30中纖維素合酶7的上調(diào)表達(dá)推測(cè)是其纖維素含量升高的重要原因。熱休克蛋白以及泛素連接酶在細(xì)胞伸長過程中能有效控制過氧化氫以及活性氧的含量［21］，這2種基因在突變體中表達(dá)量的升高可能賦予其更好的纖維特性。以上相關(guān)蛋白功能還有待進(jìn)一步克隆驗(yàn)證。

植物組織培養(yǎng)是植物科學(xué)研究的一個(gè)重要手段，廣泛用于提高植物抗脅迫能力［22］、珍稀瀕危物種保護(hù)［23］、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提高［24］等多個(gè)方面。以往對(duì)于體細(xì)胞變異的研究主要采用RAPD、形態(tài)觀察、染色體計(jì)數(shù)等方法［25-27］，但是對(duì)于基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化一無所知；此外，竹子作為一種非木材類造紙資源，其纖維素含量、纖維質(zhì)量以及木質(zhì)素含量成為關(guān)注重點(diǎn)，RNA高通量測(cè)序技術(shù)在梁山慈竹及其體細(xì)胞突變體No.30上的應(yīng)用以及纖維素、木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的篩選為竹類遺傳改良研究提供了珍貴的資源。

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H igh-throughput RNA-seq and Analysis on Differential Expressed Gene from Dendrocalamus farinosus

WANG Shenchang1，2，HU Shanglian1，2，CAO Ying1，2，XU Gang1，2
（1.Lab of Plant Cell Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China；2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province，Mianyang 621010，China）

The transcriptome from the shoots of Dendrocalamus farinosus and its somatic mutantwas sequenced using the RNA-Seq technology to elucidate its functional gene and analyze its differential expressed gene，providing a theoretical basis for its genetic improvement.The sequencing data was assembled by de novo assembly and the differential expressed gene screened was annotated in COG，GO and KEGG database.In addition，the differential expression of gene related to cellulose and lignin biosynthesis was analyzed，basing on the Swiss-Prot function annotation.The sequencing results showed that a total of 86 575 631 reads were produced and assembled into a total of 84 741 unigenes by de novo，among which 49 829 were annotated in Nonredundant protein，Cluster of Orthologous Groups of proteins，Gene Ontology，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes and Swiss-Prot database.Besides，a total of 3 572 differential expressed unigenes were identified from the plant of seeds（CK）and the somatic mutant No.30.Of these differential expressed genes，757 unigenes had a detailed protein functions in the COG classification system，2 213 unigenes had the function definition in the GO database，385 unigenes were annotated to 94 KEGG Pathways.The expression of genes encoding CesA，Prx，Ubiquitin-conjugating enzyme and Heat shock proteins increased in somatic mutant No.30，while，the expression of genes encoding MYB4，4CL，CAD，CCR and LAC decreased.Our data provide themost comprehensive transcriptom ic resource for Dendrocalamus farinosus and the tran-script sequences with important function related to cellulose and lignin biosynthesis were found，which provide the most precious information resources for the further research on bamboo.

Dendrocalamus farinosus；Somatic mutant；Transcriptome；Differential expressed gene

Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-7091（2016）03-0065-07

10.7668/hbnxb.2016.03.010

2016-03-10

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31400257；31400333）；四川省“十三五”育種公關(guān)資助項(xiàng)目；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心基金項(xiàng)目（12zxsk07；13zxsk01）；西南科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（15ycx092）

王身昌（1989-），男，山東菏澤人，在讀碩士，主要從事植物遺傳與品種改良研究。

胡尚連（1966-），女，河北秦皇島人，教授，博士，主要從事植物生理與生物技術(shù)研究。