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    長足大竹象取食脅迫下慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及生物信息學(xué)分析

    2020-10-02 03:15張鑫月蔣筱蝶李沅秋羅朝兵
    現(xiàn)代園藝 2020年19期
    關(guān)鍵詞:大竹竹筍結(jié)構(gòu)域

    張鑫月,蔣筱蝶,李沅秋,羅朝兵,,唐 昊,

    (1 樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,四川樂山 614000;2 竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室)

    轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor,TF)通過目標(biāo)基因的啟動子區(qū)域的結(jié)合在激活基因表達(dá)的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?;玖涟彼崂湥╞ZIP)結(jié)構(gòu)域,包含一個堿性氨基酸區(qū)域和一個由60~80個氨基酸殘基構(gòu)成的亮氨酸拉鏈[1-2],是真核生物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,通常與植物的生物或非生物脅迫相關(guān),參與了植物中許多重要的生理生化過程[3]。堿性氨基酸區(qū)域有一個保守的N-x7-R/K基序,負(fù)責(zé)DNA的結(jié)合和核定位,而亮氨酸拉鏈區(qū)由多個亮氨酸殘基及其它疏水性氨基酸(如異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸等)形成的7次重復(fù)[4]。

    目前,通過使用全基因組分析,在多種植物中預(yù)測并確定了大量的bZIP轉(zhuǎn)錄因子,如在擬南芥[1]中發(fā)現(xiàn)了75個bZIP轉(zhuǎn)錄因子,在水稻[5]中鑒定的89個bZIP轉(zhuǎn)錄因子,在高粱[6]中鑒定的92個bZIP轉(zhuǎn)錄因子,玉米[7]中鑒定的125個bZIP轉(zhuǎn)錄因子,二穗短柄草[8]中鑒定的96個bZIP轉(zhuǎn)錄因子,小麥[9]中鑒定的187個bZIP轉(zhuǎn)錄因子等。此外,大量的研究表明,bZIP轉(zhuǎn)錄因子在許多組織和器官的發(fā)育方面具有重要作用,如維管束的發(fā)育、花的誘導(dǎo)和發(fā)育[10-12]、種子的成熟和萌發(fā)[13-14]。同時,其他研究也報道了bZIP轉(zhuǎn)錄因子在脫落酸(ABA)[15]、赤霉素(GA)[16]、乙烯[17]激素水平引起的調(diào)控和對病原體感染[18]、干旱[19]、寒冷[20]、高溫[21]和高鹽[22]的應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

    慈竹(Bambusa emeiensis)是叢生竹類,廣泛分布于我國南方地區(qū),被廣泛應(yīng)用于造紙及園林綠化等領(lǐng)域[23],如在造紙領(lǐng)域,按照竹種對造紙質(zhì)量的影響進(jìn)行分級排序,竹種可以被分為4級,而慈竹為第一級[24]。長足大竹象(Cyrtotrachelus buquet)屬鞘翅目象甲科,是主要的竹林害蟲之一。成蟲期的長足大竹象可將喙完全伸入幼嫩竹筍內(nèi)部,取食竹腔內(nèi)層[25],引起竹腔變黑、腐爛,造成新生竹發(fā)育不良,形成膿包竹及造成大量退筍,這將極大地影響了慈竹的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[26-27]。

    目前尚未有慈竹基因組草圖公布和慈竹在蟲害(長足大竹象)生物脅迫下bZIP轉(zhuǎn)錄因子的分析,因此結(jié)合蟲害(長足大竹象)取食脅迫下慈竹轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果及生物信息學(xué)分析,對慈竹的bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定及分析,以期發(fā)現(xiàn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子在慈竹抗蟲害表征中所發(fā)揮的作用,同時為研究慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 植物和長足大竹象材料的準(zhǔn)備和處理

    新鮮慈竹竹筍樣本采集于四川省樂山市沐川縣。長足大竹象于2017年8月收集于四川省沐川縣,成蟲在出土后3日喂養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中(保持26℃恒溫和70%的濕度,并維持16h的光照及8h的黑暗處理)。在試驗處理前,使長足大竹象處于饑餓狀態(tài)24h。

    取100只經(jīng)饑餓處理后長足大竹象成蟲置于新鮮竹筍上,分為長足大竹象未取食的竹筍部位(Group1)及同一竹筍上長足大竹象取食的竹筍部位(Group3),同一叢竹筍中另外竹筍上長足大竹象完全未取食的竹筍部位(Group2)3個組別,Group1和Group2取樣的部位盡量保持在不同竹筍上近似的部位。實驗的詳細(xì)處理方法參照李沅秋等[28]的試驗方法。

    1.2 慈竹轉(zhuǎn)錄組中bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列的獲得

    提取慈竹竹筍RNA,經(jīng)質(zhì)量檢測后用Illumina HiSeqTM2000平臺測序。將測序得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉低質(zhì)量和冗余的Reads讀段后,采用Trinity軟件對數(shù)據(jù)從頭組裝及拼接,最終得到慈竹的轉(zhuǎn)錄本Transcripts,并從中選取最主要的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene序列,于進(jìn)一步對Unigene數(shù)據(jù)進(jìn)行去冗余處理并得到非冗余Unigene庫。對Unigene序列進(jìn)行基因功能注釋[29-30]。根據(jù)注釋結(jié)果搜索“Basic leucine zipper”,查找與檢索詞相關(guān)的Unigene名稱,手動調(diào)取Transcript.fa中上述Unigene序列,去除掉序列小于200bp的Unigene基因序列信息。

    1.3 慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定及其蛋白質(zhì)的性質(zhì)分析

    利用ORFFinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)功能查找每個基因的ORF,只保留氨基酸殘基數(shù)大于100的相應(yīng)核苷酸序列作進(jìn)一步分析。利用Prot-Param程 序(http://web.expasy.org/protparam/)對bZIP蛋白進(jìn)行相關(guān)性質(zhì)參數(shù)的預(yù)測[31]。

    1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及保守motif的分析

    在Plant Transcription Factor Database(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/.)中下載山羊草(Aegilops tauschiia)bZIP蛋白序列,使用DNAMAN6.0及MEGA 7.0軟件對慈竹及山羊草的bZIP蛋白進(jìn)行多序列比對,然后在MEGA 7.0軟件中的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建方法中選用鄰接法并設(shè)置1000次重復(fù)bootstrap檢驗、Poisson模型構(gòu)建bZIP蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹[32-33]。利用在線網(wǎng)站(http:// meme-suite.org/index.html)并使用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置[34]對bZIP蛋白進(jìn)行motif的分析。

    1.5 慈竹bZIP表達(dá)模式

    根據(jù)慈竹中鑒定出的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)豐度值,將值導(dǎo)入MeV 4.9.0分析軟件中,制作熱圖并進(jìn)行聚類分析[35]。

    2 結(jié)果分析

    2.1 bZIP蛋白的性質(zhì)分析

    根據(jù)ORFFinder查找結(jié)果,篩選出10個大于100個氨基酸的ORF序列。這些bZIP蛋白的ORF的氨基酸含量差別較大,最長ORF的氨基酸數(shù)從149(comp719_seq1)到641(comp9572_seq1);相對分子量位于16221.19 Da (comp719_seq1)到68353.04 Da(comp9572_seq1)之間;等電點介于 4.56(comp4125_seq0)~9.73(comp10711_seq0)之間;此外,蛋白質(zhì)的親水性總平均值結(jié)果表明慈竹bZIP蛋白均為親水性蛋白質(zhì)(表1)。

    表1 慈竹bZIP蛋白的相關(guān)性質(zhì)

    圖1 慈竹及部分山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的序列比對圖

    2.2 慈竹bZIP蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

    bZIP結(jié)構(gòu)域包含有2部分,一個是包括核定位信號以及可以結(jié)合DNA序列的N-x7-R/K基序在內(nèi)的一段堿性區(qū)域,另一段是亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,具有L-x6-L-x6-L結(jié)構(gòu),參與bZIP蛋白與DNA的二聚化[4]。從NCBI下載6條已知的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列,并從Plant Transcription Factor Database中挑選出20條山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列,利用MEGA7.0和DNAMAN軟件對這36條bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列比對。在這10個新鑒定的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列中,它們的堿性氨基酸區(qū)域內(nèi)的N-x7-R/K位點具有極高的保守型,說明該結(jié)構(gòu)域在bZIP在結(jié)合啟動子區(qū)上起關(guān)鍵的作用。10個新鑒定的bZIP轉(zhuǎn)錄因子中,有9個bZIP轉(zhuǎn)錄因子具有完整的結(jié)構(gòu)域,而comp10711_seq0在核定位信號存在一定的殘缺。此外,對bZIP轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),在堿性氨基酸區(qū)后接的7重重復(fù)的亮氨酸拉鏈區(qū)域,前3個重復(fù)的亮氨酸(L)在相應(yīng)位點上較保守,但在少數(shù)情況下會被纈氨酸(V)和甲硫氨酸(M)等替代(圖1)。

    2.3 慈竹及山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

    從NCBI的protein數(shù)據(jù)庫中以“Bambusa emeiensis bZIP”為索引下載的6條已知的慈竹bZIP序列,20條從Plant Transcription Factor Database中下載的山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列及10條新鑒定的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子,利用MEGA 7.0軟件中CLUSTAL W功能對這36條bZIP蛋白序列進(jìn)行比對,繪制出慈竹bZIP蛋白的進(jìn)化樹(圖2)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果,可以將36條序列分為3組。Group 1含有19條序列(包括慈竹comp10711_seq0、BebZIP4、comp4125_seq0等8條慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子),Group 2含有包括comp8646_seq0、BebZIP3在內(nèi)的4條序列。Group 3共有13條序列(包含BebZIP2、comp_seq1和comp2588等在內(nèi)的6個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子)。

    圖2 慈竹及山羊草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹

    2.4 慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子motif分析

    利用MEME軟件分析慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子的motif(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn):有15個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子含有motif1,結(jié)合motif1的氨基酸代表性序列,可推測其主要包含核定位信號,可以結(jié)合DNA序列的N-x7-R/K基序在內(nèi)的一段堿性區(qū)域及部分亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,這與多序列比對結(jié)果相吻合(圖1)。此外,有1個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子(comp10711_seq0)未檢測到motif1,但其與已經(jīng)鑒定的慈竹BebZIP4的序列對比,可知comp10711_seq0 bZIP結(jié)構(gòu)域存在殘缺,可能是由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接不完整導(dǎo)致的序列不完整。

    圖3 慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子motif分析

    2.5 慈竹bZIP基因表達(dá)分析

    根據(jù)本試驗的結(jié)果(圖4):在不同竹筍的未被取食部位(Group1與Group2),bZIP轉(zhuǎn)錄因子在慈竹中表達(dá)模式基本相同,而在同一根竹筍的取食與未被取食部位(Group1與Group3),而在經(jīng)長足大竹象取食前后出現(xiàn)表達(dá)量的明顯變化,初步說明bZIP轉(zhuǎn)錄因子可能參與了慈竹對蟲害的響應(yīng)。其中comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0、comp2588_seq0,在未取食部位與取食部位,表達(dá)量變化較為明顯,說明這幾個bZIP轉(zhuǎn)錄因子可能對慈竹抵御蟲害有重要作用;此外,comp719_seq1在3組中含量均高,表明可能與竹筍的生長發(fā)育有關(guān)。

    圖4 慈竹bzip基因的表達(dá)模式

    3 討論與結(jié)論

    bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中具有非常重要的作用[18-22]。通過生物信息學(xué)手段對慈竹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,從中新鑒定出10個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子。

    通過系統(tǒng)進(jìn)化樹上的聚類分析,發(fā)現(xiàn)BebZIP3和comp8646_seq0,BebZIP4和comp10711_seq0同源性較高;同源性較高的基因,其功能也可能具有相似性。在早前的慈竹bZIP研究中已鑒定出6個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子,其中BebZIP2、BebZIP5和BebZIP6轉(zhuǎn)錄因子參與了鹽、干旱和ABA引起的非生物脅迫應(yīng)激響應(yīng)[36-38],BebZIP1轉(zhuǎn)錄因子可能參與了慈竹中組蛋白基因的表達(dá),進(jìn)而影響其功能,從而改變慈竹的生長發(fā)育的調(diào)控[36,39-40];BebZIP3轉(zhuǎn)錄因子可能有助于提高慈竹對多種非生物脅迫的適應(yīng)能力[36,41],而BebZIP4的調(diào)控功能尚不清晰。此外,根據(jù)長足大竹象取食慈竹筍前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果,10個新鑒定的慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子在取食處理前后,表達(dá)量各有差異。其中comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0、comp2588_seq0等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量差異極為明顯,推測這幾個慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子與長足大足象取食導(dǎo)致的慈竹應(yīng)激脅迫響應(yīng)相關(guān)。comp2588_seq0在受到長足大竹象取食脅迫后表達(dá)量下調(diào),其具體原因還有待進(jìn)一步分析。comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0表達(dá)量上調(diào),且它們和山羊草的EMT13093、EMT18702具有較高的同源性,而與這2個山羊草同源的水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng),同時作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力傳感器,激活轉(zhuǎn)錄因子BZIP50和伴侶BIP1[42-43],因此推測comp8738_seq0、comp10711_seq0、comp4125_seq0可能也具有類似的調(diào)控作用,即通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)來應(yīng)對長足大竹象的取食脅迫。

    本研究通過對慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測及在長足大竹象取食脅迫下bZIP轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化的分析,將為慈竹bZIP轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)蟲害方面的研究提供一定的借鑒意義。

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