DEP結(jié)構(gòu)域的功能研究進展

王曉江(綜述)，廖之君，林德馨(審校)

(福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，福州350004)

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本組成單位。除少量無序化蛋白質(zhì)外，絕大部分蛋白質(zhì)是由一個或多個結(jié)構(gòu)域組成的。根據(jù)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫定義，結(jié)構(gòu)域可以獨立地復制和折疊。通過研究物種中結(jié)構(gòu)域的分配情況，發(fā)現(xiàn)有1235個不同的結(jié)構(gòu)域，由于結(jié)構(gòu)域是物種進化的單元，在不同復雜物種中結(jié)構(gòu)域數(shù)目差別很小，大約有34%的結(jié)構(gòu)域被大部分物種共享，這些結(jié)構(gòu)域大部分參與了轉(zhuǎn)錄、翻譯和新陳代謝的途徑［1］。DEP 結(jié)構(gòu)域(dishevelled，Egl-10 and pleckstrin domain)是一個高度保守的結(jié)構(gòu)域，并且在人類的一些疾病相關蛋白的功能研究中涉及到此結(jié)構(gòu)域，為了進一步探討它的生物學作用，現(xiàn)就DEP結(jié)構(gòu)域的功能進行綜述。

1 DEP結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)組成分析

DEP結(jié)構(gòu)域是一個由接近100個氨基酸組成的蛋白模序。通過序列比對和基因樹重建發(fā)現(xiàn)有6個亞家族存在。人類基因組中至少有67種基因編碼該結(jié)構(gòu)域。它有H1、H2、H3三個α螺旋構(gòu)成其核心結(jié)構(gòu)。在鼠的Epac和人的Pleckstrin的DEP結(jié)構(gòu)域中都含有這種保守的核心區(qū)域。其中H1、H2被β發(fā)卡結(jié)構(gòu)隔開，H3在兩個β的后面。三個螺旋結(jié)構(gòu)形成了一個疏水性的核心。通過疏水性的作用力來穩(wěn)定DEP結(jié)構(gòu)域［2］。通過磁共振光譜學分析DEP結(jié)構(gòu)域的功能，其中α螺旋與G蛋白信號調(diào)節(jié)有關，在Pleckstrin蛋白中的DEP結(jié)構(gòu)域被PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homologous domain)包圍，通過結(jié)構(gòu)分析和互補性分析發(fā)現(xiàn)DEP結(jié)構(gòu)與PH結(jié)構(gòu)域的N端相互作用［3］。

2 DEP結(jié)構(gòu)域的細胞膜錨定功能

DEP結(jié)構(gòu)域能夠通過不同機制與膜結(jié)合。許多蛋白中含有DEP高度同源的結(jié)構(gòu)域，比如:Dishevelled(Dvl)、Epac1、Epac2、G 蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白(regulator of G protein signaling，RGS)、Sst2 和哺乳動物中RGS 蛋白 R7 亞家族［4］(RGS6、7、9、11)。其中，Dvl蛋白中的DEP結(jié)構(gòu)域功能研究最早，它包括三個保守的結(jié)構(gòu)域:DIX(Dis/Axin homologous domain)、PDZ(PSD-95 and ZO-1 domain)、DEP，Dvl蛋白是細胞中的一個非常重要的調(diào)節(jié)蛋白。N末端DIX結(jié)構(gòu)域主要跟經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路有關，PDZ與胞質(zhì)面Wnt蛋白受體Fz的尾部結(jié)合，DEP參與Dvl蛋白由胞質(zhì)到胞膜的錨定。并且和非經(jīng)典的細胞極性(noncanonical planar cell polarity，PCP)信號通路有關［5］。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路活化需要Dvl蛋白多聚化，連同F(xiàn)z的共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白6一起形成一個超級復合體——Wnt-Fz-低密度脂蛋白受體相關蛋白6-Dvl。通過Fz的C末端結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域親和力比較弱［6］，需要DEP結(jié)構(gòu)域的協(xié)助作用。因此，DEP結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛纬山?jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典的PCP通路都發(fā)揮重要作用。

2.1 靜電吸引 募集Dvl蛋白的過程最初是依靠一種靜電吸引作用。DEP結(jié)構(gòu)域在保守位點處有賴氨酸和酪氨酸。另外臨近于C末端還有5個酪氨酸，它們被磷酸化后帶正電荷，而胞質(zhì)內(nèi)側(cè)面帶負電荷，這種細胞內(nèi)的相互作用對胞內(nèi)的pH值比較敏感，主要受細胞內(nèi)Na+/H+交換體Nhe2的影響［7］。當pH值降低時，膜表面的負電荷減少，會使Dvl蛋白的附著困難。同樣的當DEP結(jié)構(gòu)域聚集著大量酸性氨基酸時也會對質(zhì)膜產(chǎn)生排斥反應。

2.2 假設蛋白模體介導 另一種細胞膜錨定方式是通過假設蛋白模體的介導作用與細胞膜的結(jié)合。DEP結(jié)構(gòu)域與假設蛋白模體都能與細胞膜上的網(wǎng)格蛋白配體2蛋白(clathrin adaptor protein 2，AP-2)的亞基μ2有微弱的結(jié)合力，并且假設蛋白與富含酪氨酸的DEP結(jié)構(gòu)域結(jié)合。AP-2是由 α、β2、σ2、μ2四個亞基組成。DEP結(jié)構(gòu)域通過假設蛋白模體的介導作用，與μ2亞單位的C末端結(jié)合［8］。DEP結(jié)構(gòu)域與μ2細長的C末端結(jié)合處呈溝槽樣結(jié)構(gòu)，而假設蛋白模體會在與DEP結(jié)合后將μ2亞單位表面的溝槽封閉，這樣會使DEP與μ2的結(jié)合更加牢固。AP-2配體在開放(有活性)和關閉(無活性)形態(tài)中不斷轉(zhuǎn)化。Wnt信號通過Fz和Dvl蛋白激活磷脂酰肌醇4激酶和磷脂酰肌醇5激酶的活性，產(chǎn)生大量磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，通過 α、β2、μ2 亞基使磷脂酰肌醇4，5-二磷酸富集在膜上，并通過磷脂酰肌醇4，5-二磷酸磷酸化μ2連接區(qū)域，使其處于活化狀態(tài)。假設蛋白模體只能在AP-2配體開放狀態(tài)下結(jié)合，而在關閉狀態(tài)下，DEP結(jié)構(gòu)域雖然具有較低的親和力，但然可以維持與AP-2的結(jié)合［9］。在Wnt信號通路激活的情況下，通過網(wǎng)格蛋白介導對Fz和Dvl蛋白的內(nèi)吞，激活PCP信號通路。在開放狀態(tài)下，該復合體的結(jié)合更加牢固，因而能夠確保內(nèi)吞作用的發(fā)生［10］。

3 DEP結(jié)構(gòu)域的信號轉(zhuǎn)導功能

3.1 Dvl蛋白 Dvl蛋白中DEP結(jié)構(gòu)域的C末端可以與G蛋白的βγ亞單位結(jié)合，隨后會激活磷脂酶C、Ca2+和蛋白激酶C信號途徑，破壞Dvl蛋白的空間結(jié)構(gòu)，最終導致 Dvl蛋白降解，關閉 Wnt信號通路［11］。

3.2 T細胞因子4 T細胞因子4(T cell factor 4，TCF4)/β-catenin 復合體是典型的 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵分子，Wong等［12］報道Dvl-DEP結(jié)構(gòu)域能夠阻止Wnt蛋白誘導的TCF4基因的表達。通過磁共振結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，DEP的C末端還可以抑制TCF4基因的活性，并激活 JNK信號通路［13］。鼠蓬亂蛋白DEP結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白也稱為Spats1，是一種新的蛋白，能夠與Dvl-DEP蛋白相互作用，調(diào)節(jié)Wnt信號［14］。有證據(jù)表明，鼠蓬亂蛋白DEP結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白能夠抑制被Wnt1、Dvl2或β-catenin蛋白所激活的Lef-1熒光報告的強度，通過蛋白酶體復合物途徑，促進TCF4的降解，阻斷TCF4與β-catenin的結(jié)合。以上結(jié)果顯示，DEP結(jié)構(gòu)域在Wnt信號通路中同時介導負性調(diào)節(jié)。

3.3 RGS 7家族蛋白 RGS 7家族蛋白包括DEP、GGL和DHEX三個結(jié)構(gòu)域，與Gβ亞單位相互作用形成Gβ5-RGS7復合體［15］，阻止 Ca2+內(nèi)流引起的毒蕈堿三類受體活化。毒蕈堿三類受體第一和第二個環(huán)都非常短而且高度保守，第三個環(huán)很長，而且具有多樣性。DEP結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合到毒蕈堿三類的第三個環(huán)上，位于第345～390個氨基酸位點。單獨的DEP結(jié)構(gòu)域能夠抑制毒蕈堿三類受體活化，并且刪除DEP結(jié)構(gòu)域后，Gβ5-RGS7復合體失去對毒蕈堿三類的抑制作用［16］。

4 DEP結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)小分子GTP酶和下游因子的功能

4.1 G蛋白 DEP結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在大量的信號分子中(包括RGS)，它能夠與膜上突出的可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性的融合蛋白附著蛋白受體家族蛋白結(jié)合，使蛋白定位于膜上發(fā)揮活性作用。RGS蛋白通過DEP結(jié)構(gòu)域介導與G蛋白受體蛋白C末端結(jié)合，使RGS蛋白?？坑诮咏麲蛋白亞單位的位置［17］。通過調(diào)節(jié)G蛋白亞單位尿苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTP)的活性調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導。

4.2 Epac1 Epac1是環(huán)腺苷酸依賴性的鳥嘌呤交換因子，具有1個或2個環(huán)腺苷酸結(jié)合位點、一個DEP結(jié)構(gòu)域和GEF催化位點。通過與環(huán)腺苷酸結(jié)合和分離誘導Epac1發(fā)生活化與失活的轉(zhuǎn)變。當DEP結(jié)構(gòu)域發(fā)生缺失突變，會使Epac1完全喪失膜定位功能。如果Epac1中DEP結(jié)構(gòu)域第82位精氨酸突變，也會使環(huán)腺苷酸誘導的Epac1活性功能喪失［18］。進一步說明了DEP結(jié)構(gòu)域在Epac1活化過程中發(fā)揮著重要作用。

4.3 LRRK2與 Dvl1～3 LRRK2與 Dvl1～3對于軸突和突觸的建立非常重要。編碼富亮氨酸重復激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因發(fā)生突變會導致帕金森病。LRRK2復雜Ras蛋白復合體-復雜Ras蛋白復合體C末端結(jié)構(gòu)域能抑制GTP酶的活性，控制 LRRK2激酶的活性。而 Dvls與LRRK2Ras復雜蛋白C末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似，也能夠與小 GTP酶結(jié)合并調(diào)節(jié) GTP酶的活性［19］。LRRK2與Dvl共表達能夠增加LRRK2穩(wěn)定期蛋白水平，這種作用依賴于DEP結(jié)構(gòu)域的功能。

5 DEP結(jié)構(gòu)域促進細胞極性確立的功能

DEP結(jié)構(gòu)域在PCP信號通路中是必需的。PCP信號通路是一條非經(jīng)典Wnt信號通路。近年來相關研究表明［20］，可以調(diào)控細胞極性排列，完成細胞形態(tài)發(fā)生(如上皮細胞)的細胞極性的確立以及在胚胎形成過程中參與原腸胚/神經(jīng)胚期會聚延伸運動，參與調(diào)控神經(jīng)管閉合過程。通過構(gòu)建包含DEP的結(jié)構(gòu)域(但不含催化位點的小分蛋白)來研究DEP結(jié)構(gòu)域的功能，發(fā)現(xiàn)單獨的DEP結(jié)構(gòu)域有利于紡錘體極性的確定，甚至優(yōu)于Dvl蛋白本身。提示DEP結(jié)構(gòu)域能夠促使紡錘體正確形成，Dvl蛋白通過細胞內(nèi)或細胞間的信號限制了DEP結(jié)構(gòu)域的作用［21］。

6 展望

結(jié)構(gòu)域是蛋白結(jié)構(gòu)和功能的基本單位決定著蛋白質(zhì)的功能。DEP結(jié)構(gòu)域的功能與細胞膜的錨定、信號轉(zhuǎn)導、小分子GTP酶活性的調(diào)節(jié)以及細胞極性的確立等密切相關。并且從生物大分子的結(jié)構(gòu)分析，取得了對細胞功能活動更深入的認識。但是，目前對DEP結(jié)構(gòu)域還存在一些問題沒有解答。從基因組學及蛋白質(zhì)組學上進一步研究將會有重大意義。①從“定性”及“定量”角度分析。由于基因表達的時空特異性，DEP結(jié)構(gòu)域表達是否會選擇性的在某些組織中表達，或者在不同的組織中表達的量存在差異。通過對結(jié)構(gòu)域進行全面的分析，有助于全面認識組織特異性的蛋白質(zhì)特征及其結(jié)構(gòu)基礎。②根據(jù)DEP結(jié)構(gòu)域特點構(gòu)建新型融合蛋白。有望發(fā)現(xiàn)具有重大功能的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域。從結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)、功能等方面著手研究，為解釋生物個體發(fā)生、發(fā)展機理提供了新的視野。

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