應用不對稱PCR提高PRRSV-CSFV-JEV共檢芯片的雜交效率

張　仙，鄧　靜，常曉霞，楊國淋，馬　銳，滑　翔，趙玉佳，歐陽達，文心田,2，黃小波,2,曹三杰,2，文翼平,2，伍　銳,2

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應用不對稱PCR提高PRRSV-CSFV-JEV共檢芯片的雜交效率

張仙1，鄧靜3，常曉霞1，楊國淋1，馬銳1，滑翔1，趙玉佳1，歐陽達1，文心田1,2，黃小波1,2,曹三杰1,2，文翼平1,2，伍銳1,2

1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，動物傳染病與基因芯片實驗室，雅安625014；2.四川農業(yè)大學人獸共患病研究室與豬病防治研究中心，成都611130；3.四川華神獸用生物制品有限公司，四川畜科生物制品有限公司，成都610299

摘要：目的比較采用普通RT-PCR和不對稱PCR分別進行樣品的直接熒光標記，應用于cDNA芯片雜交，分析其對芯片雜交效率的影響。方法以本實驗室建立保存的重組質粒和病毒為模板，進行不對稱RT-PCR引物濃度優(yōu)化，應用普通RT-PCR與不對稱RT-PCR進行直接熒光標記，將標記的產物與制備的cDNA芯片雜交，在相同條件下完成雜交后芯片的洗滌與掃描，記錄掃描圖片與數據。結果與普通RT-PCR標記方法相比，應用不對稱RT-PCR技術標記單鏈靶基因，能特異有效提高芯片的雜交效率。結論應用不對稱RT-PCR技術對樣品進行熒光標記后，與cDNA芯片雜交能提高芯片的雜交效率，有利于cDNA芯片的檢測應用。

關鍵詞：不對稱PCR；cDNA芯片；標記

Supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of China(No. 201203056)

基因芯片技術是近年來新興起的一種生物高新技術，該技術可以同時定量或定性的檢測成千上萬個基因信息，具有無選擇性、客觀、高通量的特點。已有的資料表明隨著基因組數據的增多、分子生物學的快速發(fā)展，基因芯片技術在疾病診斷[1]、新藥開發(fā)[2]、基因組研究[3]等生物科學領域中廣泛應用。

基因芯片的雜交原理是點制在固相載體上的核苷酸探針與其標記互補的樣本核酸雜交。單鏈DNA由于不存在互補雙鏈的競爭性結合，其雜交效率及檢測靈敏性高。單鏈DNA制備的方法主要包括：磁珠捕獲法[4]、人工合成法、M13噬菌體擴增法[5]和不對稱PCR法[6]。不對稱PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA。不對稱PCR法操作簡便，成本低而應用比較廣泛[7-9]。本研究選用直接引物標記進行常規(guī)PCR和不對稱PCR靶基因擴增，雜交后根據掃描圖片及數據分析不對稱PCR對cDNA芯片雜交效率的影響。

1材料與方法

1.1重組質粒菌T/ PS9，PRRSV 5’UTR，US-type；T/Yll，PRRSV ORF6，US-type；T/CSF1，CSFV 5’UTR；T/PS9，CSFV/PS8；T/PRM，JEV；T/JEV，JEV 均由本實驗室構建并保存。

1.2引物探針制備和靶基因擴增引物參照本實驗室張煥容[10]，肖馳[11]報道的方法設計的特異性引物(表1)，定位基因的擴增參照曹三杰[12]報道的方法設計引物(表2)，引物由寶生物工程有限公司合成，其中反向引物合成兩條，一條無標記，一條5’端用Cy3標記修飾。

表1　探針制備和靶基因擴增引物

表2　定位基因引物

1.3PRRSV-CSFV-JEV共檢芯片的制備將保存的探針基因重組質粒菌(T/Yll、T/ PS9、T/PS8、T/CSF1、T/PRM、T/JEV)分別進行復蘇，然后按照Omega小量質粒提取試劑盒說明方法提取質粒。將提取的質粒作1∶50稀釋后作為模板進行PCR擴增，同時按照曹三杰[10]的報道，以λDNA為模板進行定位探針的PCR擴增，擴增產物采用乙醇醋酸鈉法進行純化。將純化好的探針濃度稀釋至500 ng/μL，然后用點樣緩沖液將探針濃度調整至250 ng/μL。按照設計好的檢測陣列的排布(每張基片設置4個相同的9×9點陣，如圖1)和性能參數，用晶芯?SmartArrayerTM16微陣列芯片點樣儀在氨基基片上進行接觸式點樣。點制完成的基片在預設為80 ℃的PCR儀中烘焙8 h，紫外交聯(lián)30 min，然后60～80 ℃重新水化10 s后，1 000 r/min；0.2%的SDS劇烈清洗3 min后，再用蒸餾水清洗2 min后離心干燥，密封、4 ℃保存。

1 and 9: Positive quality; 2: Negative control; 3: PRM; 4: JEV;5: PS8; 6: CSF1; 7: PS9; 8: Y11.

1.4基因芯片的有效性檢測單獨以λDNA為模板進行常規(guī)的PCR擴增標記，再以保存的T/Yll、T/PS9、T/PS8、T/CSF1、T/PRM、T/JEV重組質粒為模板進行PCR擴增標記，將標記產物與制備的共檢芯片進行初步的雜交檢測，驗證基因芯片的有效性。

1.5病毒核酸的提取采用天根總RNA提取試劑盒(柱)對處理的組織樣本進行總RNA提取，并將提取的RNA反轉錄為cDNA，反轉錄產物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6單鏈和對照樣品的制備用dd H2O將未進行熒光標記的引物(即上游引物)進行稀釋，使得PRM、JEV、CSFV、PS8、Y11、PS9基因的反向引物和非熒光標記引物比例分別為50∶1、40∶1、80∶1、80∶1、20∶1、10∶1，用濃度不同的引物分別進行PCR擴增，反應體系為：10×Ex buffer(Free Mg2+)25.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，10.0 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL，5 U/μL Ex Taq 0.3 μL，非熒光標記的上游引物1 μL，5′端Cy3標記的下游引物1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O加至25 μL。擴增條件為： 94 ℃ 變性3 min； 94 ℃ 變性30 s，56.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保持。

1.7芯片雜交及洗滌取制備保存的基因芯片，95～100 ℃雙蒸水中變性1～2 min。其間上下抽提以免在玻片表面形成氣泡，立即置95%乙醇中快速冷卻后離心干燥，將芯片置于雜交艙中，于芯片點樣區(qū)加入預雜交液25 μL，將蓋玻片輕放其上，以免形成氣泡，使預雜交液均勻覆蓋芯片區(qū)，將芯片置于密封的濕盒內于44 ℃下預雜交1 h。吸除預雜交液，將利用單重PCR的標記好的核酸樣品和多重PCR標記的核酸樣品分別于95 ℃變性3 min 后，立即置冰中冷卻5 min，再與一定量預冷的雜交緩沖液混勻，取該混合液20～40 μL 加到芯片區(qū)，以蓋玻片輕放其上，將芯片放入雜交艙內于一濕盒內避光雜交，于48 ℃雜交溫度下雜交2 h 時間。雜交完全后，在50 ℃預熱的洗液1、洗液2、洗液3、雙蒸水依次洗滌3 min，1 000 g離心干燥后備用。

1.8掃描及結果分析本實驗選用的標記物為Cy3，故選用綠色532 nm單通道熒光，掃描圖像以JPG格式保存，掃描數據以數據分析軟件LuxScan3.0獲取信息，分析結果以*.LSR文件格式保存。本研究引入SNRm(樣點信號值的以2.0為底的對數與背景信號值對數的比值)，來判定每個樣點的雜交結果，信號值大于1 000并且SNRm值高于2.0則判定為陽性，否則為陰性。

2結果

2.1探針質粒鑒定結果各探針基因重組質粒菌(T/Yll、T/PS9、T/PS8、T/CSF1、T/PRM、T/JEV)分別進行復蘇，提取的質粒分別擴增出了預期大小的片段(Y11：155 bp、JEV：238 bp、PRM：451 bp、PS8：248 bp、PS9：179 bp、CSFV：143 bp)，2%瓊脂糖凝膠電泳如圖2所示：

M: 100 bp Ladder DNA Marker; Lane 1: Y11; Lane 2: JEV; Lane 3: PRM; Lane 4: PS8; Lane 5: PS9: Lane 6: CSF1.

2.2基因芯片的有效性檢測結果以λDNA定位基因為模板進行靶基因擴增標記，將擴增產物與雜交緩沖液以1∶1混合后與點制芯片雜交。掃描后，圖像(圖3A)和數據顯示，陽性質控λDNA定位基因雜交斑點明顯可見，信號值大于1 000，SNRm值高于2.0，陰性對照和其它探針斑點不明顯或沒有，表明制備的基因芯片、陽性定位基因質量可靠。6個探針基因的全部探針與基因芯片雜交后，相應的探針位點均可以看到明顯的雜交斑點，陽性對照斑點明顯，信號值均大于1 000，SNRm值高于2.0，表明制備的共檢芯片、選用探針基因質量可靠(圖3B)。

A：陽性定位基因的有效性檢測；B：探針基因的有效性檢測

2.3探針質粒雜交結果由圖4(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)所示cDNA芯片與雙鏈熒光標記樣品雜交后，其相應的探針均出現了陽性信號。圖4(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)所示cDNA芯片與單鏈熒光標記樣品雜交后，其相應的探針也均出現了陽性信號，但信號明顯強于常規(guī)PCR標記雜交(表3)。

3討論

目前，臨床上常用的檢測方法主要有3種：病原分離、血清學方法和分子生物學方法。血清學檢測如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫組化(IHC)和熒光抗體試驗(FAT)等；分子生物學檢測聚合酶鏈式反應(PCR)、原位雜交(ISH)、基因芯片檢測和環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)等。基因芯片被首次研究報道是在1995年，從此之后得到了快速的發(fā)展和應用[13]?；蛐酒鶕结樀牟煌煞譃楣丫酆塑账嵝酒蚦DNA芯片，寡聚核苷酸芯片由于探針較短，靈敏性更高，但是容易產生假陽性；cDNA芯片由于探針和靶基因是互補的片段，因此準確性更高[14]。

A: Conventional PCR result of PRM gene; a: asymmetric PCR result of PRM gene; B: Conventional PCR result of JEV gene; b: asymmetric PCR result of JEV gene; C: Conventional PCR result of PS8 gene; c: asymmetric PCR result of PS8 gene; D: Conventional PCR result of CSF1 gene; d: asymmetric PCR result of CSF1 gene; E: Conventional PCR result of PS9 gene; e: asymmetric PCR result of PS9 gene; F: Conventional PCR result of Y11 gene; f: asymmetric PCR result of Y11 gene.

表3　常規(guī)PCR與不對稱PCR的雜交結果

基因芯片在動物疫病的診斷方面有其獨特的優(yōu)勢。1)同時對多個樣品進行平行檢測；2)分析過程中可以根據研究目的選用多色熒光(最多為4種)還是單色熒光對樣品進行標記；3)檢測所需樣本量小，減少試劑損耗；4)靈敏度高，特異性強；5)研究的整個過程可完全自動化，使檢測結果更為客觀、準確。

由于生物芯片技術發(fā)展時間較短，很多技術還處于初級研發(fā)階段，要成為實驗室研究或臨床可以普遍采用的技術仍有諸多關鍵問題亟待解決。如：1)基因芯片的特異性的提高；2)增加信號檢測的靈敏度；3)簡化樣品制備和標記操作；4)設備與操作人員的要求較高；5)應用標準的統(tǒng)一等。本研究致力于提高信號檢測的靈敏度而進行不對稱PCR標記與常規(guī)PCR標記進行比較。

基因芯片的雜交原理是點制在固相載體上的核苷酸探針與其標記互補的樣本核酸雜交。穩(wěn)定的DNA雙鏈與探針基因雜交時存在競爭性抑制，影響探針和靶基因的結合能力和穩(wěn)定性，進一步影響cDNA芯片的分辨能力和結果的可信度。另外，高溫解鏈后的單鏈PCR產物，一部分單鏈直接又復性成雙鏈，一部分引物與單鏈靶序列復性，在TaqDNA聚合酶作用下又合成雙鏈，兩種反應相互競爭進一步導致單鏈靶基因的量減少。因此直接合成只用于雜交的一條鏈用于雜交可以排除雙鏈的的干擾，提高雜交效率。

Wang等[15]運用不對稱PCR方法分析了關于提高芯片雜交效率的研究，結果顯示，在相同條件下不對稱PCR標記方法相對于常規(guī)PCR更能擴增出大量的熒光標記的產物。孟祥賢等[16]應用金納米顆粒介導不對稱PCR，產生了大量的單鏈。不對稱PCR技術可以通過調節(jié)上下游引物的量、引物的退火溫度(Tm值)以及引物的長度的不同來擴增大量的單鏈DNA。而其中應用最廣也最為關鍵的是限制性引物與非限制性引物的比例，因為應用不對稱PCR雖可以獲得大量的單鏈DNA，但非限制性引物的量多或少均可以影響PCR的擴增效果，所以摸索出引物最適比例，對提高雜交效率十分重要。

本研究在本實驗室前期研究的基礎上選用直接引物標記進行常規(guī)PCR和不對稱PCR靶基因擴增。不對稱PCR電泳結果、芯片掃描圖像和數據分析顯示，應用不對稱PCR技術對樣品進行標記后，芯片的雜交效率有所提高。PRM、JEV、CSFV、PS8、Y11、PS9基因的反向引物和非熒光標記選用的引物比例分別為50∶1、40∶1、80∶1、80∶1、20∶1、10∶1，這是在本研究進行之前經過長期摸索而探索的條件。研究結果顯示在上述條件下雜交檢測信號值和信噪比均為最強。相對于常規(guī)PCR，不對稱PCR擴增可以明顯提高雜交效率。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.011

通訊作者：文心田，Email：xintian@sicau.edu.cn

中圖分類號：Q789

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0051-05

Corresponding author:Wen Xin-tian, Email:xintian@sicau.edu.cn

收稿日期：2015-04-27；修回日期:2015-08-17

Enhancing the hybridization efficiency of the PRRSV-CSFV-JEV microarray by asymmetric PCR

ZHANG Xian1,DENG Jing3,CHANG Xiao-xia1,YANG Guo-lin1,MA Rui1,HUA Xiang1,ZHAO Yu-jia1,OUYANG Da1,WEN Xin-tain1,2,HUANG Xiao-bo1,2,CAO San-jie1,2,WEN Yi-ping1,2,WU Rui1,2

(1.LaboratoryofAnimalInfectiousDiseaseandMicroarray/KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China；2.LaboratoryofZoonosisandSwineDiseasePreventionResearchCenter,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;3.SichuanHuashenVeterinaryBiologicalProductsCo.,Ltd,SichuanXukeBiologicalProductsCo. ,Ltd.,Chengdu610299,China)

Abstract:Microarray is wildly used in every field of biology as a tool of molecular biology research, with advantages of accuracy, fast and high-throughput. The hybridization efficiency is the critical factor of the microarray technology. We studied the hybridization efficiency of two fluorescence labeling methods by microarray hybridization. On the basis of our laboratory research, we selected T/PRRS-PS9, T/Yll, T/CSF1, T/PS8, T/PRM, and T/JEV as template, to optimize the concentration of asymmetric RT-PCR primer. The templates were come from recombinant plasmids which were established and saved in our laboratory. The templates would be amplified by traditional PCR and the amplification would be the probes of the cDNA microarrays. The samples used to be labeled by fluorescence, we amplified and labeled the samples from clinic by means of asymmetric PCR and traditional PCR labeling technology, they hybridized with the cDNA microarrays we prepared respectively, followed by washing, scanning and analysis. Results indicated that compared to the traditional RT-PCR labeling method, the asymmetric RT-PCR labeling method showed superior results with enhance hybridization efficiency. The hybridization efficiency could be enhanced by asymmetric PCR labeling method, which improving the detection applicability of microarray technology.

Keywords:asymmetric PCR; cDNA microarray; fluorescence labeling

國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(No.201203056)