解脲脲原體生物群分布與耐藥性差異研究

張　艷，華　川，李蘇利，宋　娟，王　芊，李　揚

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解脲脲原體生物群分布與耐藥性差異研究

張艷，華川，李蘇利，宋娟，王芊，李揚

解放軍252醫(yī)院，保定071000;

摘要：目的了解本地區(qū)泌尿生殖道感染人群中解脲脲原體感染的生物群分布特點及其耐藥情況。方法采用液體選擇培養(yǎng)基對泌尿道分泌物標本進行培養(yǎng)、鑒定及藥敏；選取解脲脲原體陽性標本進行PCR分群和分型；分析各生物群型別及其耐藥性差異。結果985例檢測標本中，單獨解脲脲原體陽性395例，總陽性率為40.10%，其中女性368例，男性27例，其陽性率分別為42.45%、22.88%，女性陽性率高于男性，其差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=16.550,P<0.01)。395例單獨解脲脲原體陽性標本作PCR分群分型顯示，單獨生物一群陽性278例，陽性率為70.89%；單獨生物二群陽性80例，陽性率為20.25%。單獨生物一群中以單一血清6型(121例，43.21%)、3/14型(96例，35.53%)感染為主。單獨生物二群均為混合血清型感染，基因亞型1(血清型2、5、8、9)和亞型3(血清型7、11)混合感染(49例，61.25%)；基因亞型2(血清型4、10、12、13)和亞型3(血清型7、11)混合感染共檢出(31例，38.75%)。結合藥敏結果發(fā)現(xiàn)，解脲脲原體對喹諾酮類藥物耐藥率較高，對四環(huán)素類藥物較敏感，且多重耐藥現(xiàn)象嚴重。生物一群對司帕沙星的耐藥性高于生物二群，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.701，P=0.017<0.05)，且生物一群對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、阿奇霉素的耐藥性遠高于生物二群，其差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=10.811,χ2=19.103,χ2=7.541，P均<0.01)。進一步結合分型結果發(fā)現(xiàn)，生物一群中單一血清型S6耐藥率最高的抗菌藥為氧氟沙星(76.86%)，S1型耐藥率最高的抗菌藥為羅紅霉素(95.74%)，S3/14型耐藥率最高的抗菌藥為羅紅霉素和阿奇霉素(均為86.46%)。結論泌尿生殖道感染人群中解脲脲原體陽性率較高，女性高于男性，以生物一群單一血清型感染為主；本地區(qū)耐藥形勢嚴峻，生物一群耐藥性高于生物二群；生物一群中各血清型的耐藥性存在不同程度的差異。結合解脲脲原體生物分群分型結果可輔助合理選用抗菌藥物，以避免濫用致耐藥株產(chǎn)生。

關鍵詞：解脲脲原體；生物群；血清型；耐藥性

解脲脲原體是一種介于病毒與細菌之間、能夠獨立存在的微生物。近年來其感染發(fā)生率呈逐年上升趨勢，成為引起泌尿生殖道感染的重要病原體。目前已知解脲脲原體包括兩個生物群[1]，14個血清型：生物一群即微小解脲脲原體(Ureaplasmparvum,Up)，生物二群即解脲解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum,解脲脲原體)。其中血清型1、3、6、14屬于Up，2、4、5、7～13屬于解脲脲原體。目前國內(nèi)已有大量文獻對泌尿生殖道感染患者中解脲脲原體的培養(yǎng)及藥敏狀況進行報道，但對解脲脲原體血清型及其耐藥性的研究較少。因此本文就解脲脲原體的型別分布及其耐藥情況進行研究，旨在為解脲脲原體耐藥性在血清型水平的研究提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1標本來源收集2012年11月至2013年11月我院婦科、皮膚科及泌尿外科門診疑似支原體感染患者的泌尿道分泌物標本985例，其中男性118例，女性867例，患者年齡在20～55歲之間。所有患者均為疑似泌尿生殖道感染，且在采集標本前未用過抗生素或停用抗生素1周以上。

1.2標本采集男性用無菌男性拭子插入尿道2～4 cm處取尿道分泌物；女性用無菌女性拭子在宮頸管內(nèi)1～2 cm處，取宮頸分泌物，取好的標本無菌密封送檢。

1.3標本檢測

1.3.1培養(yǎng)檢測1.2支原體培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗采用珠海麗珠試劑有限公司支原體培養(yǎng)、鑒定、藥敏一體化試劑盒,對分泌物標本進行支原體培養(yǎng)鑒定及藥敏。藥敏試驗包括：四環(huán)素類(多西環(huán)素、米諾環(huán)素)；大環(huán)內(nèi)酯類(交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素)；喹諾酮類(氧氟沙星、左氧氟沙星霉素、司帕沙星)9種抗生素。嚴格按說明書進行操作。

1.3.2解脲脲原體陽性標本PCR檢測—引物合成樣本模板的制備采用煮沸裂解法。PCR引物參照葉向群等設計合成(見表1)。

表1　引物合成序列

1.3.3解脲脲原體陽性標本PCR檢測—PCR擴增及電泳檢測PCR反應體系(25 μL)：模板2 μL，F(xiàn)引物1.5 μL，R引物 1.5 μL，PCR反應液Mix12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像。

上表中，1S1、1S3、1S6、1S14分別代表生物一群血清型1、3、6、14，因血清型3和血清型14的MB基因僅有3個堿基的差異，用PCR無法區(qū)分，故歸為1個基因型。2S1、2S2、2S3分別代表生物二群基因型亞型1、2、3，亞型1包含血清型2、5、8、9，亞型2包含血清型4、10、12、13，亞型3包含血清型7、11(Kong FR，1999) 。

1.4統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析,率的比較采用卡方檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2結果

2.1分離培養(yǎng)結果經(jīng)麗珠支原體培養(yǎng)試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，985例檢測標本中，解脲脲原體陽性395例，總陽性率為40.10%，其中女性368例，男性27例，其陽性率分別為42.45%、22.88%， 女性陽性率高于男性，其差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.550,P<0.01)。

2.2解脲脲原體分群及耐藥結果

2.2.1生物分群395例解脲脲原體陽性標本作PCR檢測，其中單純生物一群陽性278例，單純生物二群陽性80例，生物一群和生物二群均陽性35例，其陽性率分別為70.38%、20.25%、8.86%。另有2例女性標本PCR擴增陰性。(見圖1、2)

M: 2 000 bp marker, positive results are shown in lane 1, 2, 3.

2.2.2不同生物群耐藥情況由表2可見，生物一群耐藥率較高的抗菌藥分別為：阿奇霉素(75.54%)、羅紅霉素(60.43%)、司帕沙星(60.43%)、氧氟沙星(60.00%)；生物二群耐藥率較高的抗菌藥分別為：司帕沙星(75.00%)、阿奇霉素(62.50%)、氧氟沙星(62.50%)、羅紅霉素(62.50%)。經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析，生物一群對司帕沙星的耐藥性高于生物二群，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.701，P=0.017<0.05)，且生物一群對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、阿奇霉素的耐藥性遠高于生物二群，其差異有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=10.811，P=0.001<0.01；χ2=19.103，P=0.000<0.01；χ2=7.541，P=0.006<0.01)。兩大生物群對其余藥物的耐藥性差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。因生物一群和生物二群共同感染病例較少，故暫未對其分析。

M: 2 000 bp marker, positive results are shown in lane1, 2, 3.

表2　兩大生物群耐藥情況比較

Note: *represents there is difference(P<0.05), ** represents there is significant difference(P<0.01)

2.3解脲脲原體分型及耐藥結果

2.3.1生物一群分型278例單獨生物一群陽性標本中，單一血清型共檢出264例(94.96%)，其中血清型6為121例(43.53%)，血清型3/14為96例(35.53%),血清型1為47例(16.91%)。混合血清型共檢出14例(5.04%)。

生物二群分型：80例單獨生物二群陽性標本中，基因亞型1(血清型2、5、8、9)和亞型3(血清型7、11)混合感染檢出49例(61.25%)?；騺喰?(血清型4、10、12、13)亞型3(血清型7、11)混合感染檢出31例(38.75%)。

生物一群和生物二群混合感染其檢出35例，其中生物一群血清型3與2群基因亞型1(血清型2、5、8、9)混合感染21例(60%)，生物一群血清型6與2群基因亞型2(血清型4、10、12、13)混合感染14例(40%)。(見表3)

表3　PCR陽性病例感染模式

2.3.2單一血清型耐藥結果由表4知，S6型耐藥率最高的抗菌藥為氧氟沙星(76.86%)，S1型耐藥率最高的抗菌藥為羅紅霉素(95.74%)，S3/14耐藥率最高的抗菌藥為羅紅霉素和阿奇霉素(均為86.46%)。3種血清型中耐藥率最低的抗菌藥均為米諾環(huán)素。生物一群中3種單一血清型S6、S1、S3/14對9種藥物的耐藥性各不相同，除司帕沙星、左旋氧氟沙星外，它們之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表4)。

進一步將耐藥性差異有顯著統(tǒng)計學意義的血清型間進行兩兩比對后發(fā)現(xiàn)，血清型S1與S3/14對氧氟沙星的耐藥性差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.703，P=0.192>0.05), 血清型S6與S3/14對氧氟沙星的耐藥性差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.308，P=0.021<0.05),其余血清型兩兩之間對各類抗菌藥物耐藥性的差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。因生物二群均為混合感染，故暫未對其血清型進行分析。

表4　生物一群各血清型耐藥情況

Note: *represents there is significant difference among S6, S1 and S3/14(P<0.01).

3討論

我們采用液體培養(yǎng)法檢測泌尿生殖道感染患者解脲脲原體，發(fā)現(xiàn)總陽性感染率為40.10%，且女性患者感染率(42.45%)大于男性患者(22.88%)，其差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.550,P<0.01)，這與文獻報道一致[2-5]。目前人們比較認可的原因可能與男女生理結構特點相關，女性生殖道較短可能更易感染。女性感染患者常因感染初期癥狀不明顯而容易忽視檢查治療，導致病情遷延和交叉感染。此外，女性患者解脲脲原體感染率會隨著年齡的變化而變化，我們發(fā)現(xiàn)女性感染者以20～45歲居多。有研究顯示[6]，30歲左右的育齡期女性感染率最高，而大于50歲的絕經(jīng)后婦女解脲脲原體感染率則明顯下降，這可能與不同年齡段女性的雌激素水平及性生活頻率有關。有人認為解脲脲原體降解產(chǎn)物可能會改變女性生殖道的pH值，有利于其他細菌的感染和繁殖，從而加重感染。

本研究中，將395例解脲脲原體陽性標本進行PCR分型檢測，結果顯示單獨生物一群感染率70.38%，單獨生物二群感染率20.25%，兩生物群混合感染率為8.86%?？梢姳镜貐^(qū)解脲脲原體感染以單獨生物一群感染為主，這與葉向群等[7]報道的粵東地區(qū)、單平囡等[8]報道的紹興地區(qū)的生物群優(yōu)勢分布一致。生物一群感染中以單一血清型(94.96%)感染為主，明顯高于混合血清型(5.04%)。單一血清型感染中又以6型感染率為最高(43.21%)，其次為3/14、1型感染。生物二群感染均為混合血清型感染模式，以血清型2、5、8、9和7、11混合感染為最高(61.25%)。葉南圓等[9]通過對國內(nèi)解脲脲原體分型相關文獻進行聚類分析發(fā)現(xiàn)南京以生物一群中血清型1、生物二群中血清型4居多；北京以生物二群中血清型4型為主，而長春以生物二群中血清型8型報道最多。這說明不同地區(qū)解脲脲原體型別分布有其各自的特征。關于各個型別與致病性的具體關系，各地學者的研究情況不盡相同，目前仍無統(tǒng)一定論。國內(nèi)有學者[10]認為生物一群可導致女性生殖道炎癥、不孕、胎膜早破、早產(chǎn)等，引起男性不育和前列腺炎等疾病。其木格等[11]研究發(fā)現(xiàn)在非衣原體非淋球菌感的染黏液膿性宮頸炎患者中生物二群的陽性率顯著高于健康體檢者。劉巖麗等[12]對輸卵管妊娠患者宮頸分泌物中的解脲原體進行分群檢測，發(fā)現(xiàn)患者組生物二群的感染率明顯高于正常對照組，生物二群的感染可能與輸卵管妊娠的發(fā)生有關。Kong F等[13]認為生物一群為泌尿生殖道的正常菌群，而生物二群與致病性有關。葉南圓等[9]發(fā)現(xiàn)血清1、3、4型的致病力明顯強于其它幾型。而黃珺等[6]研究認為解脲脲原體血清型3可增加宿主發(fā)病的可能性，血清型6與女性泌尿生殖道感染無關。De Francesco等[14]也研究認為血清型6主要有存在于陰道菌群正常的無癥狀女性中。

本研究中藥敏結果顯示，解脲脲原體對氧氟沙星(53.13%)、羅紅霉素(51.72%)、司帕沙星(41.25%)、氧氟沙星(42.50%)耐藥率較高，提示臨床不應再經(jīng)驗性應用這些藥物，以免加劇其耐藥形勢。對米諾環(huán)素(93.33%)、多西環(huán)素(93.13%)敏感率較高，也提示臨床在無用藥禁忌的情況下，可首選這兩種藥物進行治療。

結合我們的生物分群結果得知，生物一群和生物二群耐藥率較高的抗菌藥種類是一致的，包括阿奇霉素、羅紅霉素、司帕沙星、氧氟沙星。然而生物一群對司帕沙星的耐藥性高于生物二群，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且生物一群對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、阿奇霉素的耐藥性遠高于生物二群，其差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。這與葛鎖華等[15]報道的生物二群耐藥較為嚴重的結論有所不同。而丁進亞等[16]研究認為兩大生物群間的耐藥性差異無統(tǒng)計學意義,生物種群與臨床用藥關系不大。這種研究差異可能與樣本構成、樣本量大小及地域性等因素有關。對于本研究人群中出現(xiàn)的兩大生物群混合感染的情況，因例數(shù)有限未對其耐藥性進行分析，不過有報道認為[17]不同型別的混合感染可導致基因重組或基因突變，從而引起耐藥株形成。

進一步結合分型結果得知，不同血清型的耐藥性存在不同程度的差異。生物一群中血清型S6耐藥率最高的抗菌藥為氧氟沙星(76.86%)，S1型耐藥率最高的抗菌藥為羅紅霉素(95.74%)，S3/14耐藥率最高的抗菌藥為羅紅霉素和阿奇霉素(均為86.46%)。3種血清型中耐藥率最低的抗菌藥均為米諾環(huán)素，這也提示我們臨床在無用藥禁忌時可考慮將米諾環(huán)素作為一線用藥。經(jīng)統(tǒng)計分析，除血清型S1與S3/14對氧氟沙星的耐藥性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外,血清型S6(76.86%)對氧氟沙星的耐藥性高于S3/14(62.50%)，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余血清型兩兩之間對試驗所用9種抗菌藥物耐藥性的差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。國內(nèi)有學者[18]曾研究發(fā)現(xiàn)血清型1對多西環(huán)素、氧氟沙星和四環(huán)素的耐藥率差異有顯著性。

綜上，我們對解脲脲原體生物分群分型與耐藥性的關系進行了初步研究，在一定程度上為臨床合理用藥提供依據(jù)。也建議臨床有必要進行解脲脲原體的生物分群分型檢測，以參照結果合理選用抗菌藥物進行治療，盡可能避免耐藥株的產(chǎn)生。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.010

中圖分類號：R37

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0045-06

收稿日期：2015-04-22；修回日期:2015-08-23

Ureaplasma urealyticum serotypes distribution and drug resistance

ZHANG Yan,HUA Chuan,LI Su-li,SONG Juan,WANG Qian,LI Yang

(TheNo.251hospitalofPLA,Baoding071000,China)

Abstract:We investigated the Ureaplasma urealyticum infection and the distribution of its serotypes and genotypes types in patients with urogenital infections in Baoding area. Samples were firstly screened with mycoplasma culture and identification kit, and then the positive cultural samples were subtyped by PCR method. The positive rate of U. urealyticum was 40.10%(395/985). The 395 positive cultural samples were subtyped with PCR, and the positive rate of biovar1 was 70.89% and the positive rate of biovar2 was 20.25%. The serotypes of 278 biovar1 positive samples were identified with PCR; there were 121 samples with serovar 6(43.21%). The serotypes of 80 biovar2 positive samples were genotyped, and the results showed that the rate of mixed genotype 1 and 3 was higher than the others. The biovar1 of U. urealyticum were predominated in patients with urogenital infections in Baoding area. And U. urealyticum serovar 6 and serovar 3/14 were common serotypes. It is significant to investigate the distribution of different serotypes of Ureaplasma in different areas.

Keywords:Ureaplasma urealyticum; biovar; serotype; drug resistance

Email:breeze0827@sina.com