環(huán)孢素A對(duì)肝細(xì)胞中磷酸化AKT蛋白表達(dá)的影響

楊 柳，劉曉軍，王宏宇，曹 永，馬永華，徐 春

（武警總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100039；2.武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039）

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環(huán)孢素A對(duì)肝細(xì)胞中磷酸化AKT蛋白表達(dá)的影響

楊 柳1，劉曉軍2，王宏宇1，曹 永1，馬永華1，徐 春1

（武警總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100039；2.武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039）

【摘要】目的 觀察環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）對(duì)肝細(xì)胞磷酸化AKT（phosphorylated AKT，P-AKT）表達(dá)的影響，探討CsA導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制。方法 本研究分兩部分：（1）體外研究：用不同濃度CsA（0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L）作用于人肝細(xì)胞（HL7702細(xì)胞）48 h，用Western blot方法檢測(cè)P-AKT蛋白的表達(dá)水平。（2）體內(nèi)研究（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）：建立環(huán)孢素A誘發(fā)的大鼠糖尿病模型，用免疫組化方法分析P-AKT蛋白在糖尿病大鼠肝細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果 （1）各濃度（0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L）CsA組與對(duì)照組相比，HL7702肝細(xì)胞中的PAKT蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）。（2）環(huán)孢素A引起大鼠血糖升高，在服用環(huán)孢素A的第5個(gè)月，大鼠平均血糖為9.28 mmol/L，說明環(huán)孢素A誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型建立成功，糖尿病大鼠肝細(xì)胞中P-AKT蛋白的表達(dá)明顯低于服藥前和正常對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論 服用治療劑量的環(huán)孢素A導(dǎo)致大鼠血糖升高，環(huán)孢素A抑制大鼠肝細(xì)胞中P-AKT的表達(dá)，環(huán)孢素A抑制人肝細(xì)胞HL7702中P-AKT的表達(dá)，提示影響PI3K/AKT信號(hào)通路可能是環(huán)孢素A導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】環(huán)孢素A；胰島素抵抗；移植后糖尿病；AKT；P-AKT

移植術(shù)后糖尿病 （post-transplantation diabetes mellitus，PTDM）作為器官移植術(shù)后最為常見和最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，受到人們的廣泛關(guān)注。PTDM的高發(fā)病率（2%～53%）以及帶來的一些諸如術(shù)后反復(fù)感染、移植物失活、心腦血管疾病發(fā)生率增加等問題，顯著影響移植后患者的愈合、生活質(zhì)量和長(zhǎng)期存活率。大量臨床數(shù)據(jù)和研究表明年齡、性別、種族、家族史、術(shù)后急性排斥反應(yīng)、免疫抑制劑、病毒感染等都是導(dǎo)致PTDM的危險(xiǎn)因素，其中年齡、性別、種族和家族史等因素都是不可控的，而免疫抑制劑作為一個(gè)可調(diào)控的獨(dú)立危險(xiǎn)因素就顯得尤為重要［1，2］。器官移植患者術(shù)后使用的免疫抑制劑主要可分為糖皮質(zhì)激素和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）兩大類。目前認(rèn)為糖皮質(zhì)激素主要是通過促進(jìn)肝糖原異生和加重外周胰島素抵抗導(dǎo)致血糖升高，而CNI導(dǎo)致血糖升高的機(jī)制尚不清楚，目前的研究提示，CNI導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷、凋亡，減少胰島素（insulin，Ins）的合成和分泌，產(chǎn)生胰島素抵抗（insulin resistance，IR）［3-8］。胰島素受體后水平信號(hào)傳導(dǎo)障礙是IR發(fā)生最常見和最重要的環(huán)節(jié)，胰島素主要是通過磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）途徑行使調(diào)控糖代謝的功能［9，10］。因此，PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)障礙應(yīng)是IR發(fā)生的主要原因。AKT是一種絲/蘇氨酸激酶（serine-threonine kinase），因與蛋白激酶A和蛋白激酶C有很高的同源性，故又稱為蛋白激酶B （protein kinase B，PKB），其處于PI3K/AKT信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，通過磷酸化和去磷酸化來控制反應(yīng)進(jìn)行，主要負(fù)責(zé)由PI3K始動(dòng)的生物信息的傳導(dǎo)，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、胰島素分泌等多種生理過程中起著重要作用［11-13］。我們?cè)?jīng)用臨床劑量的環(huán)孢素A（CNI的代表藥之一）喂大鼠，在服藥3個(gè)月后出現(xiàn)血糖的升高，環(huán)孢素A

誘發(fā)的糖尿病大鼠表現(xiàn)出胰島素B細(xì)胞的壞死和胰島素的抵抗［5］。為進(jìn)一步研究環(huán)孢素A導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制，本研究1.通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，分析環(huán)孢素A對(duì)正常人肝細(xì)胞（胰島素主要靶細(xì)胞之一）中磷酸化AKT（phosphorylated AKT，P-AKT）和AKT表達(dá)的影響，2.通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分析環(huán)孢素A誘發(fā)的糖尿病大鼠肝臟組織P-AKT的表達(dá)，獲得環(huán)孢素A干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的證據(jù)，揭示鈣調(diào)磷酸酶抑制劑升高血糖的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：

1.1.2.1 動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性4周大鼠20只，體重（200.0±10.0）g，來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK（軍）2014-005】。大鼠飼養(yǎng)在相同的鼠隔離系統(tǒng)內(nèi)，居住環(huán)境經(jīng)過無(wú)菌處理，溫度22℃±3℃；12 h白天，12 h夜晚（早7：00開燈）。標(biāo)準(zhǔn)的鼠糧：含鈣0.98%，含磷0.75%，含維生素D3 1500 IU/kg，含鎂0.3%；自來水。組織取材于武警總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.1.2.2 藥物：環(huán)孢素（CsA）由諾華公司提供。將藥品用蒸餾水溶解，稀釋至25 mg/mL，備喂養(yǎng)用。

1.2 方法

1.2.1 通過細(xì)胞培養(yǎng)觀察不同濃度的環(huán)孢素A對(duì)人肝細(xì)胞（HL7702細(xì)胞）表達(dá)磷酸化AKT和AKT的影響：

1.2.1.1 藥物濃度及實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、DMSO組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組僅加細(xì)胞培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的CsA（0.1 μmol/L、l μmol/L、5 μmol/L）。因CsA粉劑不溶于水，根據(jù)CsA粉劑說明書，采用DMSO溶解，需增加DMSO組，DMSO組只加細(xì)胞培養(yǎng)液和 DMSO，由于 CsA各組（0.1 μmol/L、l μmol/L、5 μmol/L），分別含DMSO的濃度為0.001‰、0.01‰、0.05‰，故 DMSO組中 DMSO的濃度最終稀釋至0.05‰。

1.2.1.2 細(xì)胞蛋白的提取和蛋白濃度的測(cè)定：將HL7702細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中，置入三氣組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

吸取原培養(yǎng)液，每孔加入含不同濃度CsA（0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L）的培養(yǎng)液、單純培養(yǎng)液或含DMSO的培養(yǎng)液2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。去除六孔板培養(yǎng)液，PBS洗滌兩遍。加入80 μL裂解液，充分裂解10 min。10 000～14 000 r/min離心10～15 min，取上清液，得到HL7702細(xì)胞蛋白。將濃度為1 μg/μL的BSA按0、1、2、4、8、12、16、20 μL分別加入EP管中，補(bǔ)加高純水到20 μL。將每蛋白樣品取5 μL加入 BCA工作液，在水浴箱（60℃），30 min。在酶標(biāo)儀上測(cè)定562 nm波長(zhǎng)的吸光度值，計(jì)算蛋白濃度。

采自2016年3月至2016年8月進(jìn)入上海港的DEMETER、LISA和TINA 3艘分別裝自地中海、印度洋和波斯灣3個(gè)海域的國(guó)際船舶的7個(gè)水艙的壓載水水樣見表1。

1.2.1.3 Western blotting法檢測(cè)P-AKT和AKT蛋白的表達(dá)：（1）SDS-PAGE電泳：在加樣孔內(nèi)點(diǎn)入上樣蛋白（取細(xì)胞蛋白50 μg，與等體積2×SDS上樣緩沖液混合，沸水中加熱變性5 min，1 000 r/min離心5 min）和標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 5 μL，50 V電壓30 min，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠與濃縮膠交界處時(shí)，更換電壓至90 V，繼續(xù)電泳90 min。（2）轉(zhuǎn)膜。（3）封閉。（4）免疫反應(yīng)：① 取出已封閉的膜，浸于一抗（抗P-AKT抗體或抗AKT抗體）稀釋液中，過夜，用TBST洗3次，每次5 min。② 將膜再浸于1∶5000二抗稀釋液中，室溫孵育1 h，然后用TBST洗3次，每次5 min。（5）Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，并分析數(shù)據(jù)。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：

1.2.2.1 環(huán)孢素A誘發(fā)的糖尿病大鼠模型的建立：經(jīng)過1周的適應(yīng)生活，將大鼠隨機(jī)分2組，每組10只，對(duì)照組：蒸餾水1 mL/（kg.d），環(huán)孢素A組：環(huán)孢素A 25 mg/（kg.d）。均經(jīng)胃管灌注給藥，根據(jù)我們以往實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)間為5個(gè)月，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)環(huán)孢素A組大鼠因灌胃給藥損傷死亡2只。測(cè)定兩組給藥前及給藥第5個(gè)月的空腹血糖，用放射免疫分析法測(cè)定血清胰島素（INS）水平，根據(jù)以下公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和胰島素敏感指數(shù)（HOMA-β）：HOMA-IR=空腹胰島素 ×空腹血糖/22.5，HOMA-β=20×空腹胰島素/（空腹血糖-3.5），其中空腹胰島素單位為mU/ L，空腹血糖單位為mmol/L。

1.2.2.2 用免疫組化方法測(cè)定大鼠肝細(xì)胞P-AKT的表達(dá)：制備肝臟組織石蠟切片，進(jìn)行P-AKT的免疫組化染色。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。給藥前兩組大鼠的血糖、胰島素分泌指數(shù)、胰島素抵抗指數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；給藥后兩組大鼠的血糖、胰島素分泌指數(shù)、胰島素抵抗指數(shù)的比較采用協(xié)方差分析，以給藥前水平作為協(xié)變量，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠P-AKT表達(dá)強(qiáng)度比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人肝細(xì)胞（HL7702細(xì)胞）磷酸化AKT的表達(dá)強(qiáng)度比較采用單因素方差進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間的兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的環(huán)孢素A對(duì)HL7702細(xì)胞中AKT 和P-AKT蛋白表達(dá)的影響

不同濃度的環(huán)孢素 A作用48 h后，通過Western blot方法檢測(cè)HL7702肝細(xì)胞中AKT和PAKT蛋白的表達(dá)結(jié)果，如表1所示：在AKT蛋白的表達(dá)中，各濃度CsA組分別與對(duì)照組相比，均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在P-AKT蛋白的表達(dá)中，0.1 μmol/L、1 μmol/L和5 μmol/L CsA組分別與對(duì)照組相比，P-AKT蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）。

2.2 環(huán)孢素A對(duì)大鼠血糖、胰島素抵抗指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)的影響

給藥前兩組大鼠空腹血糖差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)過程中環(huán)孢素A組大鼠因灌胃給藥損傷死亡2只。給藥5個(gè)月后環(huán)孢素A組剩余8只大鼠空腹血糖均大于7.0 mmol/L，平均血糖為9.28 mmol/L，糖尿病發(fā)生率為100%，糖尿病模型建立。協(xié)方差分析結(jié)果顯示：給藥5個(gè)月后與對(duì)照組相比，環(huán)孢素組血糖顯著增高（P＜0.05），給藥前的血糖對(duì)給藥后血糖無(wú)顯著影響；給藥5個(gè)月后與對(duì)照組相比，環(huán)孢素組胰島素抵抗指數(shù)顯著增高（P＜0.05），給藥前胰島素抵抗指數(shù)對(duì)給藥后胰島素抵抗指數(shù)無(wú)顯著影響；給藥5個(gè)月后與對(duì)照組相比，環(huán)孢素組胰島素敏感指數(shù)顯著降低（P＜0.05），給藥前胰島素敏感指數(shù)對(duì)給藥后胰島素敏感指數(shù)無(wú)顯著影響（表2）。

2.3 環(huán)孢素A對(duì)大鼠肝臟P-AKT表達(dá)的影響

分別在100倍和200倍光學(xué)顯微鏡下觀察兩組大鼠肝臟組織中P-AKT的免疫組化表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)可見褐黃色顆粒散在分布。通過χ2檢驗(yàn)，得出P ＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

3 討論

環(huán)孢素A（CsA）是一種由真菌代謝產(chǎn)生的含11個(gè)氨基酸的環(huán)形多肽類物質(zhì)，通過抑制神經(jīng)鈣蛋白，作用于T細(xì)胞活化過程中的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制T細(xì)胞的增殖和分化，達(dá)到免疫抑制的效果，于20世紀(jì)80年代起開始廣泛應(yīng)用于器官移植術(shù)后。臨床數(shù)據(jù)顯示環(huán)孢素A可以增加器官移植術(shù)后糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1］，本研究給SD大鼠服用臨床治療劑量的環(huán)孢素A，在服藥5個(gè)月，大鼠血糖持續(xù)升高，達(dá)到糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，成功建立了環(huán)孢素A誘發(fā)的糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠的胰島素抵抗指數(shù)明顯增加，說明環(huán)孢素A具有增加胰島素抵抗的作用。

表1 不同濃度的環(huán)孢素A作用肝細(xì)胞HL7702后，P-AKT、AKT蛋白的表達(dá)（-±s）Tab.1 Expression of P-AKT and AKT of HL7702 hepatocytes after CSA administration in different concentrations（±s）

表1 不同濃度的環(huán)孢素A作用肝細(xì)胞HL7702后，P-AKT、AKT蛋白的表達(dá)（-±s）Tab.1 Expression of P-AKT and AKT of HL7702 hepatocytes after CSA administration in different concentrations（±s）

組別Groups　AKT/ACTIN　P-AKT/ACTIN　P-AKT/AKT對(duì)照組Control　1.407±0.056　0.414±0.047　0.294±0.023 0.05‰DMSO　1.412±0.045△　0.411±0.043△　0.291±0.021△0.1 μmol/L CSA　1.414±0.052△　0.303±0.060*　0.214±0.036#1 μmol/L CSA　1.391±0.040△　0.205±0.045#　0.147±0.028#5 μmol/L CSA　1.403±0.063△　0.200±0.063#　0.142±0.039#

注：與對(duì)照組比較，△P＞0.05，*P＜0.05，#P＜0.01。

Note.Compared with the control group，△P＞0.05，*P＜0.05，#P＜0.01.

表2 給藥前后血糖、胰島素抵抗指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)的比較Tab.2 Comparison of the blood sugar，insulin resistance index，and insulin sensitive index before and after drug administration

表3 磷酸化AKT在大鼠肝臟組織中的免疫組化表達(dá)Tab.3 Phosphorylated AKT expression in the rat liver tissues.Immunohistochemical staining

AKT是PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)被激活后，可以活化多種底物，產(chǎn)生胰島素的代謝效應(yīng)，AKT激活的主要機(jī)制是磷酸化，而它的磷酸化和去磷酸化，需要Thr308和Ser473兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)來調(diào)節(jié)。Thr308位于AKT的催化域，該位點(diǎn)的激活只增加大約10%的AKT激酶活性；而Ser473位于AKT的調(diào)節(jié)域，是 AKT完全磷酸化所必需的位點(diǎn)［14］。當(dāng)Thr308和Ser473兩個(gè)位點(diǎn)的全都磷酸化時(shí)，AKT達(dá)到最大激活狀態(tài)。本研究分析的是Ser473磷酸化AKT。當(dāng)胰島素通過血液循環(huán)到達(dá)肝臟、骨骼肌、脂肪等靶組織后，作用于細(xì)胞膜上的胰島素受體，使胰島素受體酪氨酸位點(diǎn)自磷酸化，磷酸化激活的胰島素受體使胰島素受體底物-1 （insulin receptor substrate 1，IRS-1）發(fā)生磷酸化，IRS-1上磷酸化的酪氨酸與磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）結(jié)合，活化的PI3K再使4，5-二磷酸脂酰肌醇（PIP2）變?yōu)榱字＜〈?，4，5-三磷酸（PIP3），但PIP3并不能直接激活A(yù)KT，它僅可以使AKT聚集到靶細(xì)胞膜上，發(fā)生構(gòu)象的改變，進(jìn)而可以被磷酸肌醇依賴性激酶 1（phosphoinositide-dependent kinase，PDK1）激活，PDK1可使AKT的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)磷酸化，使 AKT完全激活，隨后被磷酸化的AKT（P-AKT）從細(xì)胞膜上釋放出來，轉(zhuǎn)移到胞漿內(nèi)，引起各底物的磷酸化反應(yīng)，最后發(fā)揮胰島素在靶組織的生理學(xué)效應(yīng)。

在環(huán)孢素A誘發(fā)的糖尿病大鼠的肝細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)P-AKT的表達(dá)明顯低于用藥前和正常對(duì)照組。在體外培養(yǎng)的人肝細(xì)胞HL7702中加入CsA，我們同樣發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中磷酸化AKT（P-AKT）蛋白的表達(dá)降低，且隨著CsA濃度的增加，P-AKT的脫磷酸化越來越明顯。提示CsA是肝細(xì)胞AKT磷酸化的負(fù)調(diào)節(jié)因素，并且AKT的磷酸化水平和CsA的濃度成反比。

磷酸化的AKT主要通過以下五個(gè)底物途徑參與發(fā)揮胰島素的代謝調(diào)節(jié)作用［15，16］：（1）使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（主要是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4）從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的作用。（2）使糖原合酶激酶3（GSK3）Ser位點(diǎn)磷酸化，抑制GSK3活化，激活糖原合成酶（glycogen synthetase，GS），活化的GS能夠促進(jìn)糖原合成、抑制糖異生。（3）可使叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）磷酸化后出核失活，解除對(duì)糖異生基因PEPCK和G6P的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，抑制肝臟的糖異生。（4）使 PDE3B激活，降低cAMP的水平，抑制PKA對(duì)脂肪酶的激活，抑制脂肪分解。（5）使轉(zhuǎn)錄因子PGC-1磷酸化，抑制肝細(xì)胞糖異生以及脂肪酸氧化。

本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到環(huán)孢素A抑制肝細(xì)胞P-AKT的表達(dá)，為揭示環(huán)孢素A引起胰島素抵抗的機(jī)制提供了一條線索。

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〔修回日期〕2016-02-23

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）06-0018-05

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.004

［基金項(xiàng)目］武警總醫(yī)院科研項(xiàng)目（編號(hào)：WZ20130403）。

［作者簡(jiǎn)介］楊柳（1986-），女，碩士研究生，專業(yè)：內(nèi)分泌代謝疾病。Email：yl13949648250@163.com。

［通訊作者］徐春（1967-），女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，專業(yè)：內(nèi)分泌代謝疾病。Email：wjxuchun@sina.com。expression of P-AKT（P＜0.05，P＜0.01，and P＜0.01）.2.After 5 months of therapy，the fasting blood glucose level of rats in the cyclosporine group was 9.28 mmol/L，indicating that cyclosporine-induced diabetic rat models were established.The insulin sensitivity index in the cyclosporine group was lower than that in the control group（P＜0.05）. The expression of P-AKT in liver in the cyclosporine group was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.Conclusions Therapeutic dose of cyclosporine has hyperglycemic effects on rats.Cyclosporine can reduce the expression of phosphorylated AKT in hepatic tissue in rats and also decrease the expression of P-AKT in human hepatocyte HL77022 cells，which indicate that cyclosporine may cause insulin resistance by interfering PI3K/AKT signal transduction pathway.

Effects of cyclosporine A on the expression of phosphorylated AKT in human hepatocytes in vitro and rat hepatocytes in vivo

YANG Liu1，LIU Xiao-jun2，WANG Hong-yu1，CAO Yong1，MA Yong-hua1，XU Chun1
（Department of Endocrinology，2.Department of Pharmacology，the General Hospital of the Armed Police Forces，Beijing 100039，China）

【Abstract】Objective To observe the effects of cyclosporin A on the expression of phosphorylated AKT in hepatocytes，and to investigate the mechanism of insulin resistance caused by cyclosporin A.Methods This study included two parts.1.In vitro experiment：Human hepatocyte HL77022 cell line was cultured at different concentrations of cyclosporin A（0.1 μmol/L，1 μmol/L，5 μmol/L）for 48 hours.The expressions of phosphorylated AKT（P-AKT）in HL77022 cells were measured by Western blot assay.2.Rat in vivo experiment：SD rats were randomly divided into 2 groups.The rats in the control group were administrated with distilled water 1 mL/Kg/d.The rats in the cyclosporine group were administrated with cyclosporine 25 mg/Kg/d.The total experiment time was 5 months.The levels of fasting blood glucose and insulin were tested at the end of the experiment.The insulin resistance index and insulin sensitivity index were calculated.The expression of P-AKT in the rat hepatocytes was measured by immunohistochemistry.Results 1.Each group of the HL7702 cells treated by CsA（0.1 μmol/L，1 μmol/L，5 μmol/L）showed a significantly decreased

【Key words】Cyclosporin A；Insulin resistance；Post-transplantation diabetes mellitus；AKT；P-AKT