扶正化瘀膠囊的TLC鑒別和丹酚酸B含量測定方法研究

潘一峰+李慶喆+涂馭斌

摘 要 目的：完善扶正化瘀膠囊的質量標準。方法：建立了其主要組分丹參、桃仁和五味子的薄層層析鑒別方法；采用反相液相色譜法（RP-HPLC），在C18色譜柱上，以甲醇-乙腈-水-甲酸（30：10：59：1）為流動相，檢測波長286 nm，測定了丹酚酸B的含量。結果：薄層圖譜斑點清晰，空白對照無干擾。丹酚酸B在4.83～145.05 μg/ml范圍內有較好的線性關系。平均回收率（n=9）為99.33%，RSD為1.76%。結論：本方法操作簡便、快速，結果可靠，重復性好，可作為該產品的質量控制方法。

關鍵詞 扶正化瘀膠囊 薄層層析 反相液相色譜 丹酚酸B

中圖分類號：TQ460.72 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）13-0029-04

Study on the methods for the TLC identification and the content determination of salvianolic acid B and other components in Fuzheng Huayu capsules

PAN Yifeng*， LI Qingzhe， TU Yubin（Shanghai Huanghai Pharmaceutical Co. LTD.， Shanghai 200942， China）

ABSTRACT Objective： To improve the quality standard for Fuzheng Huayu capsules. Methods： Salviae miltiorrhizaea， Persicae semen， Schisandrae chinensis fructus in these capsules were identified by TLC. The contents of salvianolic acid B were determined by RP-HPLC on a C18 column with a mobile phase of methanol-acetonitrile-water-formic acid （30：10：59：1） at wavelength of 286 nm. Results： The spots on TLC were clear and accurate. The standard curve of salvianolic acid B was linear over the range of 4.83～145.05 μg/ml with an average recovery of 99.33% （RSD 1.76%）. Conclusion： The methods are convenient， reliable and accurate for the quality control of Fuzheng Huayu capsules.

KEY WORDS Fuzheng Huayu capsules； TLC； RP-HPLC； salvianolic acid B

扶正化瘀膠囊是上海中醫(yī)藥大學王玉潤教授、劉平教授和肝病研究所在幾十年臨床實踐基礎上研制的抗肝纖維化藥，具有活血祛瘀，益精養(yǎng)肝功能。主要用于乙型肝炎肝纖維化屬“瘀血阻絡，肝腎不足”證者，癥見脅下痞塊，脅肋疼痛，面色晦暗，或見赤縷紅斑，腰膝酸軟，疲倦乏力，頭暈目澀，舌質暗紅或有瘀斑，苔薄或微黃，脈弦細。扶正化瘀膠囊由丹參、桃仁、絞股藍、五味子、松花粉、發(fā)酵蟲草菌粉六味藥組成，于2002年8月獲批新藥證書，其質量標準于2005年轉為正式標準[WS3-459（ Z-79）-2005（ Z） ][1]。但是，該標準欠完善，鑒別項目中缺少五味子、桃仁等藥味的鑒別。另外，該標準中用原兒茶醛作為丹參的鑒別，以丹參素鈉作為丹參的含量測定，而近年的研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B 作為丹參中含量最高的水溶性活性酚酸類化合物，被普遍認為是丹參發(fā)揮療效作用的主要物質之一， 其對肝臟抗纖維化有較好的療效，藥理藥效的研究報道也很多[2-6]；同時，經體內試驗研究表明，丹酚酸B也是扶正化瘀膠囊入血成分之一[7]。目前中國藥典中典型的丹參制劑品種有丹參片、復方丹參片、復方丹參滴丸、丹參注射液等，鑒于原鑒別標準中測定的原兒茶醛、丹參素鈉則可能是丹酚酸B的降解產物[8]，因此我們變更以丹酚酸B作為丹參鑒別和含量測定的依據。

根據上述原因，以中國藥典相關研究試驗方法為參考依據，我們建立了丹參、桃仁、五味子的薄層鑒別方法和丹酚酸B的含量測定方法，以便有助于提高該產品的質量控制標準。

1 材料和方法

1.1 材料

扶正化瘀膠囊（上海黃海制藥有限責任公司），陰性對照樣品為自制。對照藥材和對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供，批號如下：丹酚酸B對照品（含量測定用，批號：111562-200504）； 丹參對照藥材120923-200610；丹酚酸B對照品111562-201111；苦杏仁苷對照品110820-200403；五味子甲素對照品110764-200408；五味子對照藥材120922-200606。

硅膠G薄層板和硅膠GF254薄層板、流動相所用甲醇、乙腈（色譜純）均購自美國Merck公司；甲酸為色譜純（96%，美國Tedia公司）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1200，Agilent公司），超聲波清洗器（SK7200LHC，上海科導超聲儀器有限公司），電子天平（XP-105，梅特勒-托利多）；色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3 TLC鑒別

1）丹參 取扶正化瘀膠囊內容物2 g，加水50 ml，加鹽酸0.1 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g，同法制備，作為對照藥材溶液。再取丹酚酸B對照品，加甲醇制成0.5 mg/ml溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[9]，吸取上述二種溶液各3 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2：3：4：0.5：2）為展開劑，展層后取出，晾干，以含2%三氯化鐵的乙醇溶液噴霧，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰[10]。

2）五味子 取扶正化瘀膠囊內容物5 g，加氯仿20 ml，水浴回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取五味子對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。再取五味子甲素對照品，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[9]，吸取上述二種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展層后取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視[10]66。

3）桃仁 取扶正化瘀膠囊內容物5 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水3 ml溶解，加于D101型大孔吸附樹脂柱吸附（內徑1.5 cm，柱高12 cm），以水30 ml洗脫，棄去水液，再用20%乙醇30 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干（75～85 ℃），殘渣加甲醇1 ml溶解，作為供試品溶液。另取桃仁藥材2 g，同法制成藥材溶液。再取苦杏仁苷對照品，加甲醇制成2 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗[9]，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（65∶40∶10）的下層溶液為展開劑，展層后取出，晾干，以含10%硫酸的乙醇溶液噴霧，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰[10]277。

4）陰性樣品制備 6味藥材（丹參、五味子、桃仁、絞股藍、松花粉、發(fā)酵蟲草菌粉）分別缺丹參、五味子或桃仁，按扶正化瘀膠囊提取工藝進行提取，將提取物與輔料配制成的扶正化瘀膠囊陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備，分別用作丹參、五味子或桃仁的陰性對照。

1.4 丹酚酸B含量測定

1.4.1 RP-HPLC測定丹酚酸B

流動相：甲醇-乙腈-水-甲酸=30：10：59：1，流速：1 ml/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μl，檢測波長286 nm，進行RP-HPLC測定。

1.4.2 溶液制備

1）對照品母液 取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加純水制成每1 ml含193.40 μg/ml。對照品母液依次稀釋成不同濃度的對照品溶液，含量（μg/ml）分別為：4.83、9.67、19.34、38.68、58.02、77.36、96.70、145.05。

2）供試品溶液 取扶正化瘀膠囊內容物適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置25 ml容量瓶中，加入水約20 ml，超聲處理 （功率350 W，頻率50 kHz） 20 min，放冷，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3）空白對照 取五味藥材桃仁、五味子、絞股藍、松花粉、發(fā)酵蟲草菌粉，按扶正化瘀膠囊提取工藝進行提取，將提取物與輔料配制成的扶正化瘀膠囊空白樣品0.1 g，按照供試品溶液的制備方法制備。

1.4.3 提取時間的確定

精密稱定本品研細后的粉末約0.1 g，按上述供試品溶液的制備方法制備。分別超聲處理10、20、30、40 min，測定丹酚酸B峰面積。據計算，峰面積與稱樣量的比值（A/m）分別為4.478、4.531、4.533、4.531， 其中，超聲10 min的A/m相對其它時間較小，而超聲20、30、40 min的A/m相互間較接近，故超聲時間定為20 min。

1.4.4 重復性試驗

取本品，按照供試品溶液的制備方法制備供試液，按含量測定方法分別測定6次。

1.4.5 精密度試驗

取上述重復性試驗的一個樣品，連續(xù)進樣測定6次，通過峰面積計算精密度。

1.4.6 準確度試驗

加樣回收試驗：精密稱取已測定丹酚酸B含量的供試品（批號：110101，規(guī)格：0.3 g）9份，每份約0.1 g，精密加入高、中、低濃度的丹酚酸B對照品溶液，按照上述供試品溶液制備方法制備和測定，每個濃度測定3次。

1.4.7 穩(wěn)定性考察

取本品，按照供試品制備項下的制備方法制成供試品溶液，分別在室溫放置0、1、2、4、8、12 h進樣，測定峰面積，考察供試品溶液在12 h內的穩(wěn)定性。

1.4.8 檢測限和定量限

分別按信噪比（S/N）等于3和10時，將相應濃度的樣品注入液相色譜儀，確定樣品的檢測限和定量限。

2 結果

2.1 3種樣品的TLC鑒別

丹酚酸B、五味子和桃仁的供試品和對照品在TLC的相應的位置上均顯示相同顏色的斑點。專屬性試驗表明，不含這3種樣品的陰性對照無干擾（圖1）。

2.2 丹酚酸B含量測定

2.2.1 專屬性試驗

供試品和丹酚酸B對照品的RP-HPLC保留時間相同，丹酚酸B與其他成分的色譜峰分離良好，而空白對照在丹酚酸B的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)（圖2） 。

2.2.2 線性關系的考察

以丹酚酸B（μg/ml）為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得回歸方程為Y= 10.64X-11.57，相關系數r= 0.999 96，表明丹酚酸B在4.83～145.05 μg/ml范圍內有較好的線性關系，可作為該產品質量控制的含量測定方法。

2.2.3 重復性試驗

重復性試驗的結果表明，RP-HPLC測定本品中丹酚酸B含量的重復性良好，RSD%為1.52%（<2%）（表1）。

2.2.4 精密度試驗

精密度試驗結果表明RP-HPLC測定丹酚酸B的精密度較好，RSD%為0.17%（<2%）（表2）。

2.2.5 穩(wěn)定性考察

分別在室溫放置0、1、2、4、8、12 h時進樣，測得的峰面積分別為465.3、467.1、470.8、465.6、467.1和465.0，RSD%為0.46%（<2%），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.2.6 準確度試驗

加樣回收試驗結果表明，RP-HPLC測定本品中丹酚酸B回收率在95%～102%范圍內，平均回收率99.33%，符合《中國藥典》2015年版四部指導原則9101的要求[9]374。

2.2.7 檢測限和定量限

分別按信噪比（S/N）等于3和10及進樣量10 μl時，確定樣品的檢測限和定量限分別為0.5 μg/ml和1.5 μg/ml。

3 討論

原質量標準對丹參中原兒茶醛進行鑒別，而原兒茶醛是丹酚酸B的降解產物，因此考慮以丹酚酸B作為對照進行鑒別[7]。薄層鑒別方法的展開劑參考了《中國藥典》2015版一部中丹參鑒別方法[10]。該方法操作簡便，干擾小，穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

五味子以果實和種子入藥，有效成分為木脂素類化合物[11]，參照《中國藥典》2015版一部中五味子藥材的鑒別[10]66，以五味子甲素為對照品。藥典方法中供試品用氯仿溶解，分離效果和重復性較差。最后改用甲醇溶解供試品后點樣，操作簡便，干擾小，分離效果和重復性都好。

桃仁中化學成分有苷類（如苦杏仁苷、野櫻苷等），脂質、糖類、蛋白質、氨基酸、苦杏仁酶、尿囊索酶，精油等，其中苦杏仁苷為主要藥效成分[12-13]，參考其它文獻[14-15]在實驗過程中對供試品的處理，用石油醚、乙醚對樣品粉末進行脫脂；正丁醇、乙酸乙酯對樣品液進行萃取；但TLC顯示溶劑拖尾嚴重、雜質較多，仍無法有效分離，顯色劑顯色后無法準確判斷結果。最后用大孔吸附樹脂對供試品溶液進行純化，并考查了不同乙醇濃度的洗脫液中目標成分的含量，最后采用20%乙醇洗脫，硅膠G薄層板展開，以氯仿-甲醇-水（65∶40∶10）的下層溶液為展開劑，含10%硫酸的乙醇溶液加熱顯色的條件最優(yōu)。

我們統(tǒng)計了28批規(guī)格為0.3 g和23批規(guī)格為0.5 g扶正化瘀膠囊的丹酚酸B含量數據，另外考慮到丹酚酸B在貯存中可能會氧化或分解，從而含量會有一定的降低，因此我們認為扶正化瘀膠囊質量標準中含量測定項下的含量限度應暫定為每粒膠囊含丹酚酸B不得少于2.10 mg（每粒裝0.3 g）或不得少于3.50 mg（每粒裝0.5 g）較為合適。

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