利用正交試驗法優(yōu)化團花不定芽分化培養(yǎng)基

黃浩++蒙愛東

摘要：為了獲得團花不定芽分化的最佳激素組合和外植體類型，以團花20～30 d無菌苗的子葉、下胚軸和真葉為外植體材料，采用L9（34）正交試驗表，2，4-D、2-iP、6-BA為正交試驗的3因素，進行直接誘導(dǎo)不定芽分化試驗。結(jié)果表明，以真葉為外植體，不定芽分化率最高，為73.3%，激素組合為MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA；下胚軸的不定芽分化率次之，最高為66.6%；子葉的不定芽分化率最低，最高值僅為40.0%。試驗結(jié)果可為工廠化生產(chǎn)優(yōu)良團花種苗，并可為團花遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：團花；組織培養(yǎng)；正交試驗；不定芽

中圖分類號： Q813.1文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0078-03

收稿日期：2015-05-18

基金項目：廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題（編號：重200907）。

作者簡介：黃浩（1972—），男，廣西柳州人，助理研究員，主要從事藥用植物育種和栽培研究。E-mail：hmouse@163.com。

通信作者：蒙愛東，教授，從事藥用植物育種和組織培養(yǎng)。E-mail：mengaidong@126.com。團花[Neolamarckia cadamba（Roxb.）Bosser]為茜草科（Rubiaceae）團花屬（Neolamarckia Bosser）植物，為亞洲熱帶十分罕見的闊葉速生樹種。由于團花生長迅速，樹干通直，因而被譽為“奇跡樹”，早在20世紀(jì)70年代就受國內(nèi)外普遍關(guān)注。其木材淡黃色，紋理通直，不易開裂和變形，是較好的家具、建筑裝飾等用材。早在印度古醫(yī)“阿優(yōu)吠陀”經(jīng)中，就有用樹皮治療疾病的記載；樹皮含有豐富的生物堿類，其中 3α-二氫卡丹賓和3β-二氫卡丹賓為治療高血壓藥物“鉤藤總堿”的有效成分，具有強而持久的降壓作用，其效價已經(jīng)接近利血平[1]。樹葉含較高蛋白質(zhì)，可作動物飼料；花是良好的蜜源。因用途廣泛而具有較高開發(fā)價值和較大應(yīng)用前景[2-4]。

團花在中國僅有1種[5]，主要分布于廣東、廣西、云南海拔50～1 100 m的山谷溪旁或雜木林下；在云南省海拔 1 080 m 以下的亞熱帶地區(qū)有集中分布[5-6]，喜溫不耐寒。國內(nèi)外學(xué)者主要開展團花的樹皮藥用成分[1，7-11]、引種和栽培[12-18]生物技術(shù)[19-21]研究，并取得較好的進展。盡管利用大田苗頂芽或側(cè)芽通過以芽繁芽的組織培養(yǎng)方式[22-23]進行團花植株再生研究已獲得一定的成效，由于僅作為繁殖優(yōu)良植株的目的，無法利用該不再生體系進行進一步的分子試驗如遺傳轉(zhuǎn)化研究。本試驗擬利用正交試驗設(shè)計，通過器官直接分化方式對團花3種不同外植體進行不定芽誘導(dǎo)研究，以期優(yōu)化出較好的外植體和激素組合。本試驗不僅可快速獲得大量健壯不定芽，也可為團花遺傳轉(zhuǎn)化特別是轉(zhuǎn)抗寒或其他抗性基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和試劑

成熟、飽滿的團花種子，采自廣西藥用植物園本草綱目園。經(jīng)洗凈晾干后于低溫種子柜保存。

NaClO溶液500 mL塑料瓶包裝，天津市津宇精細化工有限公司生產(chǎn)；滅菌工作溶液配制：將50 mL NaClO原液加入到950 mL無菌水中搖勻；2，4-D、2-iP、6-BA、瓊脂、蔗糖購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1浸種和無菌幼苗的獲得用小袋包好種子，放入裝有約100 mL無菌水的250 mL玻璃組培瓶中，在37 ℃恒溫振蕩箱振蕩浸泡24 h。在無菌超凈臺上，將包著種子的小袋浸于NaClO工作溶液中滅菌15 min，再用無菌水徹底沖洗5次，最后將種子播于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中（培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，誘導(dǎo)不定芽分化時前30 d采用暗培養(yǎng)，之后進行光培養(yǎng)（光周期為14 h），人工光照強度2 000 lx。）20～30 d后，即可得到含1對子葉和第1對真葉、高度為5～10 mm的無菌苗。

1.2.2外植體的獲得外植體分別為無菌苗子葉、真葉、下胚軸。在無菌超凈臺中，子葉、真葉（均含葉柄）可用鑷子從上述無菌幼苗小心剝下，不含子葉節(jié)的下胚軸直接用解剖刀切取。每種外植體均按L9（34）正交試驗表進行單獨的正交試驗。

1.2.3試驗設(shè)計正交試驗設(shè)計采用L9（34）正交表，將培養(yǎng)基中的3個激素2，4-D、2-iP、6-BA設(shè)為正交試驗的3因素，每因素設(shè)3水平，為避免在試驗過程中人為因素導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差，因素水平數(shù)（激素濃度）在試驗表中不完全按數(shù)值大小遞增或遞減順序排列，而按隨機化方法排列，空列作為方差分析的誤差列[24]。試驗因素和水平見表1，試驗結(jié)果見表 2。

1.2.4培養(yǎng)基培養(yǎng)基均以MS作為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g/L，添加激素后調(diào)整pH值內(nèi)5.8，然后在 0.1 MPa、121 ℃高溫滅菌20 min，自然冷卻凝固，放置1 d后使用。

1.3統(tǒng)計與數(shù)據(jù)處理

外植體接種后40 d，統(tǒng)計不定芽分化率，同時觀察不定芽的生長情況。采用直觀分析和方差分析法對數(shù)據(jù)進行分析。每種外植體重復(fù)3次，每次15個外植體，分化率為3次重復(fù)的平均值。

不定芽分化率=（長出不定芽的外植體個數(shù)/外植體總數(shù)）×100%。

數(shù)據(jù)處理和作圖用Excel 2007完成。

2結(jié)果與分析

2.1不定芽分化率和直觀分析

不同外植體的不定芽分化率結(jié)果見表 2。從極差項的結(jié)果可看出，在3個不同的外植體中，生長素2，4-D極差項均為最大值，表明2，4-D對3個外植體的不定芽分化影響最大。影響子葉直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、2-iP（或6-BA）、6-BA（或2-iP），最優(yōu)激素組合為0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，與試驗號4吻合，子葉的不定芽分化率最高達40%。影響下胚軸直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、2-iP、6-BA，最優(yōu)激素組合為0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+2.0 mg/L 6-BA，與試驗號1吻合，下胚軸的不定芽分化率最高達40%。影響真葉直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、6-BA、2-iP，最優(yōu)激素組合應(yīng)為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，沒有試驗號與其吻合。

2.2不同激素誘導(dǎo)不定芽分化率比較

2.2.1不同激素誘導(dǎo)子葉不定芽分化率不同激素誘導(dǎo)子葉不定芽分化率見圖1。隨著2，4-D、2-iP、6-BA濃度升高，子葉誘導(dǎo)不定芽分化率均出現(xiàn)先增大后下降的趨勢，當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L，2-iP濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為1.5 mg/L時，不定芽分化的效果最佳。

2.2.2不同激素誘導(dǎo)下胚軸不定芽分化率不同激素誘導(dǎo)下胚軸不定芽分化率見圖2，隨著2，4-D、2-iP、6-BA濃度升高，下胚軸誘導(dǎo)不定芽分化率變化較大。當(dāng)2，4-D濃度為0 mg/L，2-iP濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為2.0 mg/L時，不定芽分化效果最佳。此外，不定芽分化率有隨6-BA濃度升高而提高的趨勢，適當(dāng)提高6-BA的濃度，有可能會得到更優(yōu)的誘導(dǎo)不定芽分化組合。

2.2.3不同激素引導(dǎo)真葉不定芽分化率不同激素引導(dǎo)真葉不定芽分化率見圖3，當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L，2-iP濃度為1.0 mg/L，6-BA濃度為1.5 mg/L時，不定芽分化的效果最佳。不定芽分化率有隨2-iP濃度升高而提高的趨勢，

適當(dāng)再提高2-iP的濃度，有可能會得到真葉誘導(dǎo)不定芽分化的更優(yōu)方案。與下胚軸誘導(dǎo)不定芽分化率隨6-BA濃度的升高而提高的趨勢不同。

2.3方差分析

方差分析結(jié)果見表3。

從表3看出，除了2，4-D對子葉誘導(dǎo)不定芽分化具有顯著影響外，2，4-D對其他2個外植體的不定芽誘導(dǎo)無顯著影響；2-iP、6-BA對3種外植體不定芽誘導(dǎo)均無顯著影響。

3討論與結(jié)論

從試驗的總體結(jié)果來看，子葉誘導(dǎo)不定芽分化率較低；從試驗號1到試驗號6，下胚軸誘導(dǎo)分化率最低為33%，最高為66.7%，誘導(dǎo)分化的總體狀況較好；而真葉除了在試驗號4和試驗號6的誘導(dǎo)分化率較高外，其余試驗均低于30%。另外，無論是從子葉、下胚軸還是真葉誘導(dǎo)分化出來的不定芽，生長均較健壯，生長狀況無明顯差異（圖4）。

不同外植體的最佳不定芽分化率并不出現(xiàn)在同一個激素組合（即同一個試驗號），可能是不同外植體組織（或細胞）在相同生長時期具不同生長特性，導(dǎo)致對相同激素組合的響應(yīng)不同。

當(dāng)2，4-D濃度為 0 mg/L 時，下胚軸的不定芽分化率較好；當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L時，子葉和真葉的不定芽分化率較好；當(dāng)2，4-D濃度為1.5 mg/L時，不論2-iP、6-BA濃度如何變化，3個不同外植體不定芽分化的誘導(dǎo)率均很低，可能是高濃度2，4-D對這些幼嫩的外植體產(chǎn)生一定的傷害，導(dǎo)致組織或細胞較難直接分化甚至死亡；而2-iP、6-BA對不定芽分化率影響不如2，4-D的變化顯著。

在誘導(dǎo)真葉直接分化試驗中，從直觀分析和趨勢中均可看出，最好的激素組合應(yīng)為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，理論上應(yīng)比試驗號6的分化率（即最大值73.3%）高，但此激素組合并不在本試驗的激素組合中。在下一步試驗中可對主要因素（主要是2，4-D）的水平作適當(dāng)調(diào)整，選取更優(yōu)水平，以期獲得更高的誘導(dǎo)分化率。

本試驗研究結(jié)果表明，為獲得質(zhì)量較好的不定芽，可用MS+0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+2.0 mg/L 6-BA作為下胚軸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；或用MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA作為真葉的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。這2種方法均可通過直接分化的方式獲得健壯的不定芽，避免通過愈傷組組再分化的途徑獲取再生芽而產(chǎn)生的變異苗的可能；在獲得不定芽后，按鄧小梅等的方法[22-23]選取健壯的芽，進行擴繁、生根和移栽，即可獲得再生小苗。移栽1年后，經(jīng)與初生種子苗對比，在生長性狀上無明顯差異。通過直接分化獲得不定芽，在很大程度上減少了培養(yǎng)周期、人力和物力，也為進一步進行團花遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

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