痛瀉要方對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎IL-6、IL-4 mRNA血清含量的影響

北京門頭溝疾病預(yù)防控制中心

劉海濤　張　麗△(北京102300)

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痛瀉要方對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎IL-6、IL-4 mRNA血清含量的影響

北京門頭溝疾病預(yù)防控制中心

劉海濤張麗△(北京102300)

提要目的：觀察痛瀉要方治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)白細(xì)胞介素6(IL-6)和白細(xì)胞介素4(IL-4)含量變化，探討其治療UC的作用機(jī)制。方法: 將UC大鼠動(dòng)物模型隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組(SASP)和痛瀉要方組，觀察大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)，檢測(cè)IL-6、 IL-4含量變化。結(jié)果: 痛瀉要方能有效改善UC大鼠結(jié)腸組織的病理?yè)p傷，與模型組比較， 痛瀉要方組IL-6水平顯著減低， IL-4水平升高。結(jié)論: 痛瀉要方治療潰瘍性結(jié)腸炎療效明顯，其治療作用與調(diào)節(jié)UC大鼠炎性因子密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞痛瀉要方; 潰瘍性結(jié)腸炎;白細(xì)胞介素6；白細(xì)胞介素4；腹痛；腹瀉；黏液膿血便

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病變位于直腸和結(jié)腸的慢性非特異性炎癥，其臨床表現(xiàn)以腹痛、腹瀉為主，腹瀉多為黏液膿血便。[1]UC的常規(guī)治療停藥后易復(fù)發(fā), 用藥副反應(yīng)多, 部分頑固性病例療效不佳。[2]近些年來(lái)，中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎取得一定進(jìn)展，[3]其中，痛瀉要方能明顯減輕潰瘍性結(jié)腸炎黏膜損傷，促進(jìn)潰瘍修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)從痛瀉要方對(duì)UC大鼠IL-6和IL-4 mRNA血清水平變化的角度，探討痛瀉要方治療UC與炎性因子IL-6和IL-4的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性健康SPF級(jí)SD大鼠40只, 體質(zhì)量( 180±20) g，購(gòu)自北京通華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 中藥成分及藥物組成痛瀉要方依據(jù)方劑學(xué)《丹溪心法》原方取白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)，比例為6︰4︰3︰2。將白術(shù)、陳皮、防風(fēng)加10倍水以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回流提取揮發(fā)油2 h，過(guò)濾，藥物殘?jiān)偌?倍水，繼續(xù)提取1 h。藥物殘?jiān)倥c白芍加8倍量水煎煮。收集揮發(fā)油，低溫密封貯藏。所得的水提液加75%乙醇等量混合，靜置24 h，過(guò)濾，濃縮，貯藏。水提濾液與揮發(fā)油合并，制備成混懸液。柳醋氮磺胺吡啶腸溶片(SASP, 批號(hào): 20150206), 購(gòu)自上海中西三維藥業(yè)有限公司。制成0.203 g/mL 的混懸液。

1.3方法

1.3.1UC模型建立：大鼠UC模型的制備采用Morris等[4]報(bào)道方法, SD大鼠禁食(不禁水)48 h后, 腹腔麻醉大鼠后，手提大鼠尾部，使大鼠倒立，將100 mg/kg TNBS和0.25 mL乙醇(50%)溶液緩緩注入大鼠結(jié)腸部位，距肛門緣7～8 mm。正常對(duì)照組注入等體積的0.9%氯化鈉生理鹽水。實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥：造模成功的SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為痛瀉要方組、柳氮磺胺吡啶(SASP)陽(yáng)性藥組、模型組和正常對(duì)照組, 每組10只。給藥途徑為灌胃給藥，痛瀉要方組按照2.0 g/kg給藥，陽(yáng)性藥SASP混懸液組按0.5 g/kg給藥, 正常對(duì)照組和模型組按0.9%氯化鈉生理鹽水10 mL/kg灌胃, 每日1次, 連續(xù)10天。[5]

1.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評(píng)分：給藥10 d后，處死SD大鼠后觀察結(jié)腸黏膜損傷情況，按文獻(xiàn)[6]評(píng)分記錄結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)。

1.4.2大鼠血清IL-6，IL-4水平的測(cè)定：給藥10 d后，處死SD大鼠后行主動(dòng)脈取血，EDTA抗凝，離心機(jī)3 000 r/min，離心5 min后收集血清，IL-6、IL-4血清檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。

1.4.3大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-4 mRNA水平測(cè)定：結(jié)腸組織用TRlzol試劑提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)IL-6、IL-4 mRNA水平，β-actin為內(nèi)參。引物序列為：β-actin上游引物5'-CACCCTTCCTTCTTGGGTAT-3',下游引物5'- TGGCATAGAGGTCTTTACGG-3'; IL-4上游引5'-CAGAAAAAGGGACTCCATGCACCG-3' ，下游引物5'-TTGCGAAGCACCCTGGAAGCC-3'; IL-6上游引物5'-ACCACGGCCTTCCCTACTTC -3',IL-6下游引物5'-CATTTCCACCATTTCCCAGA -3'。反應(yīng)條件如下： 50 ℃ 30 min；93℃ 30 s，56℃ 350 s，72℃ 1 min， 循環(huán)40次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有資料用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)結(jié)果觀察大鼠結(jié)腸組織病理變化發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸黏膜有發(fā)生黏連，結(jié)腸壁增厚、腫脹的現(xiàn)象，可見(jiàn)糜爛、充血，局部可見(jiàn)潰瘍面。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，痛瀉藥方和SASP組大鼠結(jié)腸組織損傷指數(shù)均降低(P<0.01)；SASP組與痛瀉藥方組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05) 。詳見(jiàn)表1。

2.2大鼠血清IL-6、IL-4水平結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清IL-6水平明顯升高( P<0.05) ，IL-4水平明顯降低( P<0.05)；與模型組比較，SASP組、痛瀉藥方能明顯降低血清IL-6水平(P<0.05)，升高IL-4水平(P<0.05)；SASP組和痛瀉藥方組差異無(wú)顯著性(P> 0.05) 。詳見(jiàn)表2。

組別例數(shù)劑量/g·kg-1結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)正常對(duì)照組10—0.00±0.00 模型組10—4.25±0.23## SASP組100.53.05±0.12**痛瀉藥方組102.03.12±0.22**

注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01； 與模型組比較，**P<0.01

表2各組大鼠IL-6、IL-4血清水平比較結(jié)果

組別例數(shù)IL-6/ng·L-1IL-4/ng·L-1正常對(duì)照組1095.21±11.2143.24±0.92模型組10121.01±11.56#25.23±0.15#SASP組1076.21±8.56*35.05±0.12*痛瀉藥方組1078.01±7.46*35.12±0.22*

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

2.3大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-4的mRNA表達(dá)水平結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠IL-6 mRNA水平明顯升高(P<0.05) ，IL-4 mRNA水平明顯降低(P<0.05)； 與模型組比較，SASP組、痛瀉藥方能明顯降低大鼠IL-6 mRNA水平 (P<0.05) ，升高IL-4 mRNA水平 (P<0.05); SASP組和痛瀉藥方組組間比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3各組大鼠IL-6、IL-4 mRNA表達(dá)比較結(jié)果

組別例數(shù)IL-6/β-actinmRNAIL-4/β-actinmRNA正常對(duì)照組100.631±0.012 0.835±0.012 模型組100.983±0.015# 0.531±0.011# SASP組100.521±0.018*0.685±0.018*痛瀉藥方組100.513±0.012*0.695±0.015*

注：與正常對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

3討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種累及腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，病變以炎癥和潰瘍?yōu)橹?，病變部位多局限于結(jié)腸和直腸的黏膜及黏膜下層。氨基水楊酸制劑和糖皮質(zhì)激素是目前常用藥物，但治療效果往往不理想，易反復(fù)發(fā)作、容易惡化和癌變，給患者帶來(lái)極大痛苦，本病已經(jīng)被列為難治性消化病之一。[7]近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在中醫(yī)辨證論治思想的指導(dǎo)下，中醫(yī)藥治療UC療效顯著。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，[8]痛瀉要方對(duì)肝氣郁結(jié)，肝郁脾虛UC患者治療效果明顯。

IL-6主要由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌，其作用主要表現(xiàn)為對(duì)多種細(xì)胞促炎作用和誘導(dǎo)肝組織產(chǎn)生急性反應(yīng)蛋白等。IL-4是一種抗炎因子，通過(guò)刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞，下調(diào)炎性介質(zhì)包括TNFα和IL-1等，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。[9-10]

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UC動(dòng)物模型的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠IL-6 mRNA水平和血清水平顯著升高，IL-4 mRNA水平和血清水平顯著降低; 而經(jīng)過(guò)治療后的SASP組、痛瀉藥方組大鼠IL-6 mRNA水平和血清水平顯著降低，IL-4 mRNA水平和血清水平顯著上升，說(shuō)明促炎因子的大量聚集, 抑炎因子的減少與潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)展相關(guān)，這與劉建平等[11]報(bào)道的泄?jié)峤舛痉綄?duì)UC模型治療效果一致。痛瀉要方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用與調(diào)節(jié)UC炎性因子相關(guān)，其通過(guò)抑制多種炎癥細(xì)胞因子的釋放和表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，但其炎癥細(xì)胞因子的激活通路有待進(jìn)一步研討。

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(2016-04-11收稿)

Effect of Tongxie Yaofang on IL-6 and IL-4 mRNA Contents in UC Rats

Mentougou Center for Disease Control and Prevention, Beijing

LIUHai-taoZHANGLi(Beijing 102300)

AbstractObjective: To observed the IL-6 and IL-4 mRNA content changes in UC rats treated with Tongxie Yaofang, and to explore its functional mechanism. Methods: The UC rats were randomly divided into control group, model group, SASP group and Tongxie Yaofang group. The colonic mucosal injury index was observed, and the IL-6 and IL-4 mRNA contents detected. Results: Tongxie Yaofang could improve effectively the pathological injury of colonic issues in UC rats. Compared with model group, IL-6 of Tongxie Yaofang group decreased significantly and IL-4 increased. Conclusion: Tongxie Yaofang is effective in treating UC, whose therapeutic action is closely related to regulating the inflammatory factors in UC rats.

Key wordsTongxie Yaofang; UC (ulcerative colitis); IL-6; IL-4; abdominal pain; diarrhea; mucopurulent feces

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5615(2016)02-0004-03

△北京航天中心醫(yī)院(北京100049)