不同溶劑提取的鉤吻粗提物中成分含量的測定

肖　灑，伍　勇，黃亞軍，孫志良，劉兆穎

(湖南省植物功能協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128)

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不同溶劑提取的鉤吻粗提物中成分含量的測定

肖灑，伍勇，黃亞軍，孫志良，劉兆穎*

(湖南省植物功能協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128)

摘要：鉤吻為馬錢科鉤吻屬常綠藤本植物，具有抗腫瘤、免疫調節(jié)、促生長等功效，研究表明其主要活性和毒性成分均為吲哚類生物堿。鉤吻的藥效劑量與中毒劑量十分接近，且致死量低，為給鉤吻廣泛的臨床應用提供理論依據(jù)，分別采用酸性染料比色法、苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法對3種不同溶劑工業(yè)化提取的鉤吻粗取物中生物堿、多糖、蛋白質進行含量測定。結果顯示，鉤吻醇提(950 mL/L乙醇)、酸水提(5 mL/L H2SO4)、水提物中生物總堿含量分別為64.4 g/L、21.5 g/L和5.7 g/L，糖含量分別為264.1 g/L、89.6 g/L和9.3 g/L，蛋白含量分別為44.7 g/L、12.7 g/L和34.6 g/L。

關鍵詞：鉤吻；粗提物；含量測定

鉤吻(Gelsemium)又名斷腸草、豬人參等，是一種傳統(tǒng)的藥用植物，主產于亞洲和北美洲。近年來，病菌的抗藥性越來越強，嚴重危害畜群及人類的健康。鉤吻作為一種具有促進動物生長發(fā)育、增強抗病能力等優(yōu)點的中草藥正逐步為全世界所關注[1]。Yamada Y等[2]從鉤吻中分離得到3個新的鉤吻定型羥基吲哚類生物堿；Takayama H等[3]在泰國鉤吻葉子中分離出2種新的環(huán)稀醚萜；Palit P等[4]發(fā)現(xiàn)鉤吻酊提取物能改善小鼠東莨菪堿誘導的癡呆模型；張振等[5]首次報道在亞洲鉤吻中得到Yohimbane-type類型；劉浩等[6]通過高速逆流法分離制備鉤吻素子；王海波等[7]通過對肝癌HepG2細胞的研究發(fā)現(xiàn)氯通道可能成為鉤吻總堿抗癌靶點之一；袁志航等[8]對鉤吻生物堿促生長的發(fā)展前景進行了探討。

鉤吻有諸多生物學活性，對其生物堿與非生物堿成分的毒性作用研究報道也多[9-10]。本研究通過對3種不同溶劑(950 mL/L乙醇、5 mL/L的H2SO4、水)工業(yè)化提取的鉤吻成分進行含量測定，從而為進一步研究鉤吻的毒性作用機理奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設備UV-5200型紫外分光光度計，PHB-1型pH計，AY220型電子天平，EASY10型純水機。

1.1.2試劑鉤吻素甲，批號：130228，購自上?？禈嘶瘜W品有限公司；溴甲酚綠，批號：F20140218，購自天津傲然精細化工研究所；醋酸鈉，批號：F20110628，冰醋酸，批號：20120822，葡萄糖，批號：F20100330，均購自國藥集團化學試劑有限公司；鉤吻醇提物由本試驗人員于泰谷生物科技有限公司提??；鉤吻酸水、水提物由本試驗人員于湖南農大藥業(yè)有限公司提取。

1.2方法

1.2.1溶液的配制鉤吻素甲標準品溶液的配制：精密稱取鉤吻素甲0.010 0 g,甲醇稀釋至1 mg/mL，即得。

鉤吻醇提物溶液的配制：精密稱取鉤吻醇提物0.423 0 g，甲醇稀釋至10 mg/mL，即得。

鉤吻酸水提物溶液的配制：精密稱取鉤吻酸水提物0.418 0 g，甲醇稀釋至10 mg/mL，即得。

鉤吻水提物溶液的配制：精密稱取鉤吻水提物0.670 3 g，甲醇稀釋至20 mg/mL，即得。

溴甲酚綠試液的配制：取溴甲酚綠0.1 g，加0.05 mol/L氫氧化鈉溶液2.8 mL使溶解，再加水稀釋定容至200 mL，即得。

醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.5)：取醋酸鈉18 g，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀釋至1000 mL，即得。

醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH3.6)：取醋酸鈉5.1 g，加冰醋酸20 mL，再加水稀釋至250 mL，即得。

醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)：取醋酸鈉54.6 g，加1 mol/L醋酸溶液20 mL，再加水稀釋至500 mL，即得。

50 g/L苯酚：80 g苯酚(分析純重蒸餾試劑)加20 g水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲存。50 g/L苯酚臨用前用800 g/L苯酚稀釋。

考馬斯亮藍G-250：稱取100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 mL 950mL/L乙醇中，加入850 g/L磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2.2不同溶劑工業(yè)化提取鉤吻流程

1.2.2.1鉤吻醇提物將10 kg鉤吻放入提取罐中，加950 mL/L乙醇80 L，提取1.5 h，藥液用200目濾網(wǎng)過濾，藥渣再同法提取1次，合并2次提取液，置濃縮罐中濃縮至相對密度1.2左右，減壓干燥后即得。

1.2.2.2鉤吻酸水提物將100 kg鉤吻加800 L 5 mL/L的硫酸溶液，于容量為1 000 L的耐酸提取罐中攪拌提取24 h，藥液用200目濾網(wǎng)過濾，藥渣再同法提取1次，合并2次提取液，用8 mol/L的氫氧化鈉調pH至中性，然后放于濃縮罐中濃縮至相對密度1.2左右，減壓干燥后即得。

1.2.2.3鉤吻水提物將50 kg已經(jīng)用醇提取過的鉤吻放入提取罐中，加400 L水，提取2 h，藥液用200目濾網(wǎng)過濾，藥渣再同法提取1次，合并2次提取液，置濃縮罐中濃縮至相對密度1.2左右，減壓干燥后即得。

1.2.3酸性染料比色法條件的優(yōu)化經(jīng)查閱相關文獻：分別選取pH為3.6、4.5、6.0；醋酸-醋酸鈉緩沖液用量為2、5、7 mL;氯仿用量為5、7、9 mL的溶液建立如表1的正交試驗因素表。具體操作步驟如下：精密吸取濃度為1 mg/mL的鉤吻素甲標準品溶液50 μL于50 mL離心管中，揮干甲醇，分別按照表2正交試驗設計依次加入醋酸-醋酸鈉緩沖液，再加入溴甲酚綠溶液，混勻，最后加入氯仿萃取，在40 min時終止反應，移除上清液得氯仿層，在410 nm處測得吸光值。根據(jù)吸光值選擇測定鉤吻生物堿含量的酸性染料比色法的最優(yōu)反應條件，從而為下步試驗的進行奠定基礎。

表1　正交試驗因素水平表

1.2.4鉤吻素甲標準曲線的建立及其醇提、酸水提、水提物中生物堿含量測定精密吸取鉤吻素甲溶液25,50,100,150,200,250,300 μL于50 mL離心管中，揮干溶液，按正交試驗最佳條件處理，40 min時終止反應，移除上清液得氯仿層，在410 nm處測得吸光值(OD)。以鉤吻素甲用量為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到線性方程。

表2　正交試驗表

分別精密吸取10 mg/mL的鉤吻醇提、酸水提和20 mg/mL的水提物溶液200 μL于50 mL離心管中，揮干溶液，其他處理方法如上，將測得的吸光值代入上述標曲，分別算得3種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中生物堿的含量，每管做3個重復。

1.2.5鉤吻醇提、酸水提、水提物中糖含量的測定準確稱取葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分別吸取0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL置于玻璃管中,各以蒸餾水補至2.0 mL，然后加入50 g/L苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL,搖勻冷卻，室溫放置20 min后于酶標儀492 nm測光密度，以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，得標準曲線。

分別吸取2 mL 0.1 mg/mL的醇提、酸水提和1 mg/mL水提物溶液置于玻璃管中，其他處理方法如上，將測得的吸光值代入上述標曲，分別算得3種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中糖的含量，每管做3個重復。

1.2.6鉤吻醇提、酸水提、水提物中蛋白含量的測定精密吸取濃度為0.1 mg/mL的牛血清蛋白標準品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞試管中，用蒸餾水補足到1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞，反轉混合數(shù)次，放置2 min后，在595 nm下比色測得吸光值，以蛋白含量為橫坐標，吸光值為縱坐標建立起標曲。

精密吸取濃度為1 mg/mL的鉤吻醇提、水提物和5 mg/mL的酸水提物溶液1 mL于具塞試管中，其他處理方法如上，將測得的吸光值代入上述標曲，分別算得3種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中蛋白含量，每管做3個重復。

2結果

2.1正交試驗結果

由表中極差分析可知：影響吸光度因素作用由大到小依次為：緩沖液用量>pH>溴甲酚綠用量>氯仿用量。各因素中以A2B3C3D3為優(yōu)水平，即緩沖液用量7.0 mL，pH為4.5，溴甲酚綠用量為2 mL，氯仿用量為9 mL時選為試驗最佳條件。

表3　正交試驗結果

2.2鉤吻素甲標準曲線及3種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中生物堿含量測定結果

鉤吻素甲線性方程為：y=4.867 6x+0.1260，R2=0.993 5，當鉤吻素甲用量在0.025 mg～0.3 mg范圍內，吸光度與對照品用量呈現(xiàn)良好的線性關系。3種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中生物堿含量測定結果見表4。

表4　生物堿含量測定結果

2.33種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中糖含量測定結果

葡萄糖線性方程為：y=5.249 4x+0.104 2，R2=0.998 9，當葡萄糖濃度在0～0.6 mg/mL范圍內，吸光度與對照品濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。3種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中糖含量測定結果見表5。

表5　糖含量測定結果

2.43種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中蛋白含量測定結果

牛血清蛋白(BSA)線性方程為：y=5.035 0x+0.133 3，R2=0.985 4，當BSA含量在0.02 mg/mL～0.1 mg/mL范圍內，吸光度與對照品含量呈現(xiàn)良好的線性關系。3種不同溶劑提取的鉤吻粗提物中蛋白含量測定結果見表6。

表6　蛋白含量測定結果

3討論

目前生物堿含量測定的方法有：酸堿滴定法、分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、氣相色譜法等[11]。酸堿滴定法測定總生物堿含量時結果誤差較大；薄層色譜法僅用于定性試驗；色譜法對一種或幾種單體生物堿含量進行測定時具有靈敏、準確的優(yōu)點，但鉤吻提取物中生物堿有數(shù)十種，而中國以分離純化的鉤吻生物堿單體只有17種，因此用色譜法對其總生物堿含量測定時結果不準確。相關文獻報道，采用酸性染料比色法對鉤吻生物總堿進行含量測定時發(fā)現(xiàn)此法靈敏度高，重現(xiàn)性好[12-13]。糖含量測定方法有：蒽醌-硫酸法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸比色法、斐林試劑比色法等。其中苯酚-硫酸法操作簡單、快速、靈敏、重復性好，文獻中也多用此法對植物提取物中糖含量進行測定[14-15]。蛋白質含量測定的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、考馬斯亮藍法、BCA法等?？捡R斯亮藍法測蛋白時靈敏度高、測定快速、耗時少、干擾物質少[16-17]。綜上所述，本研究決定分別采用酸性染料比色法、苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法對鉤吻生物總堿、糖、蛋白質進行含量測定，為進一步試驗提供理論依據(jù)。

試驗結果顯示，鉤吻3種不同溶劑提取的粗提物中生物堿含量高低排序為醇提物>酸水提物>水提物。原因分析：生物堿是植物體中一類含氮的堿性有機化合物，多為結晶性固體，易溶于有機溶劑，如甲醇、乙醇、乙醚、苯等，不溶或難溶于水[17]，故鉤吻醇提物中生物堿含量高于水提物中生物堿含量；乙醇是一種親水性的浸出溶劑，易透入藥材組織，能使生物堿更多溶解出來，而酸水提物水溶性雜質(如蛋白質、糖、鞣酸)較多，生物堿的溶出則相對少一些，故鉤吻醇提物生物堿含量要高于酸水提物生物堿含量；一般情況下生物堿不溶或難溶于水，但在酸性條件下，生物堿與酸形成鹽，而生物堿鹽則易溶于水，故鉤吻酸水提物中生物堿含量高于水提物中生物堿含量。

本研究通過后續(xù)小鼠急性毒性試驗發(fā)現(xiàn)鉤吻提取物半數(shù)致死量(LD50)高低排序為水提物>酸水提物>醇提物，進一步論證了鉤吻生物總堿含量的高低與其毒性相關的論點，從而為下步合理應用鉤吻生物堿奠定了一定基礎。

鉤吻3種不同溶劑提取的粗提物中蛋白質含量高低排序為醇提物>水提物>酸水提物。原因分析：蛋白質是一類大分子物質，多數(shù)可溶于水，一般不溶于有機溶劑，但麥角蛋白質卻能溶于較濃的乙醇，這與鉤吻醇提物中蛋白質含量稍高于酸水、水提的結果類似。在酸性條件下，蛋白質可能部分發(fā)生變性，從而使得酸水提物中蛋白質的含量要低于水提物的。

植物體內的蛋白質大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，對其含量進行測定是了解代謝機理的一個重要指標，可為下步研究鉤吻是否通過酶代謝途徑產生毒性這方面考察奠定基礎。

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Content Determination of Ingredients in Three Different Crude Extracts ofGelsemiumelegans

XIAO Sa,WU Yong,Huang Ya-jun,SUN Zhi-liang,LIU Zhao-ying

(HunanCo-InnovationCenterforUtilizationofBotanicalFunctionalIngredients，CollegeofVeterinaryMedicine，HunanAgriculturalUniversity，Changsha，Hunan,410128，China)

Abstract:Gelsemiumelegansis an evergreen liana of Loganiaceae,which has anti-tumor,immunomodulation,promoting growth and other effects.Research showed that the main active and toxic ingredients are indole alkaloids.The efficacy dose and toxic dose ofGelsemiumare very close,and lethal dose is low.To provide a theoretical basis for a wide range of clinical applications toGelsemium,acid dye colorimetry,phenol-sulfuric acid method,Coomassie brilliant blue method were respectively used to determine alkaloids,polysaccharides, proteins of three crude extracts from three different extraction solvents in this study.The results showed that total alkaloids contents of ethanol extract (95% ethanol),acid extract (0.5% H2SO4),water extract ofGelsemiumwere 6.44%,2.15%,0.57%,sugar contents were 26.41%,8.96%,0.93%,protein contents were 5.91%,1.36%,4.23% ,respectively.

Key words:Gelsemium; crude extracts;content determination

收稿日期：2015-11-19

作者簡介：肖灑(1990-)，男，湖南常德人，主要從事獸醫(yī)藥理與毒理學研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.7

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0072-05