改良組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞

陳 芳，劉 琴，王麗平，陳利峰，張 宜

（1.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070；2.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430070）

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改良組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞

陳 芳1，劉 琴1，王麗平1，陳利峰2，張 宜1

（1.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070；2.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430070）

【摘要】目的 通過(guò)改良組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法，建立一種簡(jiǎn)單，可行的兔成纖維樣滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。方法 無(wú)菌條件下取正常兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剔凈后剪成碎塊，用滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分，碎片接種于培養(yǎng)皿，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)特征。取第3代對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用CCK-8法繪制其生長(zhǎng)曲線，并用免疫熒光法檢測(cè)波形蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 體外培養(yǎng)的兔成纖維樣滑膜細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形纖維樣，細(xì)胞生長(zhǎng)力較旺盛，生長(zhǎng)曲線為典型的“S”型，免疫熒光檢測(cè)顯示第3代細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)波形蛋白。結(jié)論 改良組織塊法可以分離培養(yǎng)出兔成纖樣維滑膜細(xì)胞，方法簡(jiǎn)便，成功率高，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

【關(guān)鍵詞】改良組織塊法；兔成纖維滑膜細(xì)胞；分離；培養(yǎng)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的慢性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其確切的病因還不完全確定，該病主要侵犯全身各處關(guān)節(jié)，致殘率很高，嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康。關(guān)節(jié)囊分為內(nèi)外兩層，外層為結(jié)締組織，內(nèi)層較疏松，稱(chēng)為滑膜，滑膜表面有2～4層扁平或立方形的上皮樣結(jié)締組織細(xì)胞，即為滑膜細(xì)胞，成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）為滑膜中最主要的細(xì)胞，它參與滑膜增生和組織蛋白酶的分泌，與RA晚期關(guān)節(jié)損傷有著密切的關(guān)系［1，2］。關(guān)節(jié)滑膜是RA發(fā)病的靶器官，滑膜過(guò)度增生、增厚是造成關(guān)節(jié)損傷的主要病理基礎(chǔ)之一［3，4］。因此，建立FLS的體外培養(yǎng)方法是探尋RA發(fā)病機(jī)制與體外篩選藥物的重要手段。本研究應(yīng)用改良組織塊法，體外分離培養(yǎng)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞，并從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、波形蛋白免疫熒光染色等方面予以鑒定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料和方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康新西蘭大白兔3只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，清潔級(jí)，由武漢市新洲區(qū)萬(wàn)千佳禾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供【SCXK（鄂）2011-0011】，本實(shí)驗(yàn)在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK（鄂）2014-0082】。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)：新西蘭大白兔一只，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸濕膝關(guān)節(jié)，去皮，1%碘伏與75%酒精依次消毒，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離，找出關(guān)節(jié)囊，用手術(shù)剪分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出平滑光亮的滑膜層組織，將滑膜組織放入含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的PBS中。移入超凈臺(tái)中，用含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的PBS 洗3次，用滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分，剪成1 ～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿7～8塊滑膜組織塊，溫箱內(nèi)放置5 min后，加入1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后每皿輕輕補(bǔ)加1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)并照相。4～5 d后進(jìn)行首次換液，12～14 d后細(xì)胞達(dá)到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶進(jìn)行1∶2傳代。

1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：取第3代細(xì)胞，按1 ×103/孔接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d后隨機(jī)取出一組，按照CCK-8試劑盒操作說(shuō)明，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)每孔A值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3細(xì)胞鑒定：取第3代細(xì)胞，按1×105/孔接種含有爬片的6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定液于4℃固定30 min。PBS洗3次，0.5%Triton X-100室溫通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，滴加足夠量的vimentin一抗（1∶100稀釋?zhuān)┎⒎湃霛窈校?℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，吸水紙吸干爬片上多余液體，滴加稀釋好的熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗小鼠IgG（1∶100稀釋?zhuān)?，濕盒?0℃ ～37℃孵育1 h，PBS洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察

改良組織塊貼壁接種3～4 d后，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)組織塊周?chē)写罅康牧咙c(diǎn)，少量細(xì)胞生長(zhǎng)，有長(zhǎng)梭形、圓形和不規(guī)則的多角形，但以長(zhǎng)梭形為主（圖1A）。7～8 d后，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主，仍然存在少數(shù)多角形和圓形細(xì)胞（圖1B）。9～10 d后用1 mL槍頭輕輕吸出組織塊。15～20 d，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，達(dá)到90%融合，形態(tài)為以典型的長(zhǎng)梭形為主（圖1C）。培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞傳至P3時(shí)，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形且分布均勻（圖1D）。

圖1　原代兔成纖維樣滑膜細(xì)胞培養(yǎng)（×10）Note：A.Primary culture for 3-4 days；B.Primary culture for 7-8 days；C.Primary culture for 15-20 days；D.The third passage cells.Fig.1 Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes（×10）

2.2免疫熒光觀察

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，改良組織塊法分離得到的細(xì)胞表達(dá)中胚層組織特征性波形蛋白，用千屏圖像采集系統(tǒng)分析細(xì)胞的陽(yáng)性率達(dá)98%以上（圖2）。

2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖2　免疫熒光檢測(cè)兔成纖維樣滑膜細(xì)胞胞漿中波形蛋白表達(dá)情況（A×10；B×40）Fig.2 The expression of vimentin in rabbit fibroblast-like synoviocytes by immunofluorescence staining（A×10；B×40）

通過(guò)CCK-8法檢測(cè)P3兔成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖能力，繪制出來(lái)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)典型的“S”形（圖3）。傳代后第一天細(xì)胞數(shù)量有所減少，經(jīng)過(guò)2 d潛伏期后在4 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增殖，第7天進(jìn)入平臺(tái)期后，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，最后達(dá)到衰老。

圖3　兔成纖維樣滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of rabbit fibroblast-like synoviocytes

3　討論

原代細(xì)胞培養(yǎng)主要有機(jī)械分散法、組織塊培養(yǎng)法和酶消化法。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，從新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)中分離得到滑膜組織，剪成1～5 mm3大小，在組織塊置于3.5 cm培養(yǎng)皿之前，用滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分，溫箱內(nèi)放置5 min后，加入1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后每皿輕輕補(bǔ)加1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，3～4 d后，在光鏡下可見(jiàn)組織塊邊緣有很多圓形的亮點(diǎn)，長(zhǎng)出少數(shù)細(xì)胞形態(tài)多為典型的長(zhǎng)梭形，偶見(jiàn)多角形和圓形，15～20 d即可達(dá)到90%融合，細(xì)胞形態(tài)以典型的長(zhǎng)梭形為主。通過(guò)胰蛋白酶消化傳代后，大量成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞均勻分布。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)出的第3代兔成纖維樣滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“S”形，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5］。傳至5～6代后，細(xì)胞逐漸老化，7 ～8代后活性幾乎喪失，老化停止增殖，建議采用3 ～4代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

成纖維樣滑膜細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記物有：尿二苷磷酸葡萄糖脫氫酶 （uridinediphosphoglucose dehydrogenase，UDPGD），鈣粘蛋白-11（cadherin-11），CD14，CD44，促衰變因子（decay accelerating factor，DAF/CD55/mAb67），脯氨酸羥化酶、Thy-1/ CD90，血管細(xì)胞粘附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1/CD106），波形蛋白（vimentin）等，其中vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羥化酶是各種成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物［6-8］。實(shí)驗(yàn)選用最常用波形蛋白來(lái)鑒定成纖維樣滑膜細(xì)胞。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示P3兔成纖維滑膜細(xì)胞表達(dá)vimentin，與袁琴等人報(bào)道的相符［9］。

滑膜細(xì)胞主要包括巨噬樣滑膜細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞，其中主要為成纖維樣滑膜細(xì)胞［10］。原代培養(yǎng)細(xì)胞多利用自然純化法獲得較高純度的細(xì)胞，即利用成纖維樣滑膜細(xì)胞可以貼壁生長(zhǎng)、貼壁能力較強(qiáng)、增殖速度較快的特性，通過(guò)優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)、多次消化傳代來(lái)去除非成纖維型細(xì)胞和不健康的成纖維細(xì)胞，從而獲得較高純度的成纖維樣滑膜細(xì)胞［11］。千屏圖像采集系統(tǒng)分析免疫熒光檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)vimentin的陽(yáng)性率高達(dá)98%，與丁娟等人分離的人成纖維樣滑膜細(xì)胞vimentin陽(yáng)性率相符［12］，說(shuō)明通過(guò)多次傳代可以得到高純度的兔成纖維樣滑膜細(xì)胞。

該實(shí)驗(yàn)采用改良組織塊法成功分離培養(yǎng)出兔成纖維樣滑膜細(xì)胞，與傳統(tǒng)的組織塊貼壁法相比，最大的優(yōu)點(diǎn)就是大大縮短了組織塊貼壁時(shí)間且操作簡(jiǎn)單，組織塊置于培養(yǎng)皿之前進(jìn)行了吸水處理后，只需要放置培養(yǎng)箱5 min后，就可以很牢固貼在培養(yǎng)皿上，之后加一半培養(yǎng)液即可，24 h候后補(bǔ)加剩下的一半培養(yǎng)液就行了，而傳統(tǒng)組織塊法由于沒(méi)有進(jìn)行吸水處理，組織塊貼壁時(shí)間需要2～4 h，并且貼得不夠牢固，稍微操作不當(dāng)組織塊就會(huì)漂浮起來(lái)，就很難長(zhǎng)出細(xì)胞。但在采用改良組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維滑膜細(xì)胞的過(guò)程中也有一些注意事項(xiàng)：（1）取材比較繁瑣所耗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，取材必須保證無(wú)菌操作下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒；（2）由于取材時(shí)間較長(zhǎng)，最好在冰塊上取材，這樣溫度恒定不喪失組織塊細(xì)胞活性，取材后立即進(jìn)行培養(yǎng)；（3）滑膜組織塊的接種量是也是成功培養(yǎng)出兔成纖維滑膜細(xì)胞的關(guān)鍵，如一個(gè)3.5 cm培養(yǎng)皿加入7～8塊剪碎的組織塊即可，太多組織塊，沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)的空間，太少組織塊，細(xì)胞的量太少，滿足不了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（4）由于滑膜位于關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，在取材的過(guò)程中操作要特別仔細(xì)和小心，否則很容易取錯(cuò)滑膜，導(dǎo)致雜細(xì)胞過(guò)多，實(shí)驗(yàn)不成功。

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〔修回日期〕2016-01-13

綜述與專(zhuān)論

Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes using an improved explant culture method

CHEN Fang1，LIU Qin1，WANG Li-ping1，CHEN Li-feng2，ZHANG Yi1
（1.Department of Medical Experiments，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430070，China；2.Department of Integrated Traditional and Western Medicine，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430070，China）

【Abstract】Objective To establish an easier and better method for primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes（FLS）by modified tissue cell culture.Method Healthy rabbit joint synovial layers were cut into small pieces and siphoned off water attached on the tissue with sterile filter paper and then cultured.The growth status and morphology were observed.The growth curve of the 3rdpassage cells was measured by CCK-8 assay，and the expression of vimentin was detected by immunocytochemistry.Results The FLS cultured in vitro exhibited a spindle-shaped appearance and could rapidly expand.The cell growth curve was typical of S type，and the cells highly expressed vimentin.Conclusions Primary culture of rabbit FLS by the improved explant culture method is successfully established.The method is simple and highly efficient.It provideds a new method for isolation of FLS.

【Key words】Improved explant culture method；Rabbit fibroblast-like synoviocytes；Isolation；Culture

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856（2016）04-0075-04

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.014

［作者簡(jiǎn)介］陳芳（1979-），女，主要研究方向：細(xì)胞生物學(xué)及藥效學(xué)研究，E-mail：wpcf401717@163.com。

［通訊作者］張宜（1966-），男，主任藥師，主要研究方向：藥劑學(xué)及藥物信息學(xué)研究，E-mail：hbpizy@tom.com。