高胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞化療敏感性的影響

朱楠楠，穆蘭，李代清

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高胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞化療敏感性的影響

朱楠楠1，穆蘭2，李代清1

目的分析高胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞P-糖蛋白（P-gp）表達(dá)和功能的影響，并初步探討胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞化療敏感性的影響。方法用不同胰島素濃度（0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μmol/L）的全細(xì)胞培養(yǎng)基干預(yù)MCF-7/ADR細(xì)胞，分別采用Real-time PCR法檢測細(xì)胞中P-gp mRNA表達(dá)，Western Blot法檢測細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)水平，羅丹明123熒光實(shí)驗(yàn)測定P-gp的外排功能變化，MTT法檢測MCF-7/ADR細(xì)胞活性及化療敏感性。結(jié)果0.10 μmol/L的胰島素可促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞增殖，0.05及0.10 μmol/L濃度的胰島素可增加MCF-7/ ADR細(xì)胞P-gp mRNA及蛋白水平表達(dá)，并能增加P-gp的外排功能，降低MCF-7/ADR細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性。結(jié)論高濃度胰島素可能通過促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp的表達(dá)和功能，增加乳腺癌細(xì)胞化療耐藥性，從而降低MCF-7/ADR細(xì)胞的化療敏感性。

胰島素；P糖蛋白；抗藥性，腫瘤；表柔比星；MCF-7/ADR細(xì)胞

細(xì)胞與分子生物學(xué)

近20年來，糖尿病發(fā)病率不斷增加［1］。最近有研究表明糖尿病患者中乳腺癌的發(fā)病率較高［2］，糖尿病治療藥物也可能影響乳腺癌患者的預(yù)后［3-4］。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是abcb1編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是能量依賴性ATP超家族的一員［5-6］。P-gp是乳腺癌細(xì)胞抗癌藥物耐藥表型產(chǎn)生的原因，也是乳腺癌患者預(yù)后不良的原因［6-7］。胰島素主要用來調(diào)節(jié)糖尿病患者的高血糖癥狀，但胰島素對糖尿病乳腺癌患者P-gp的表達(dá)及化療耐藥性的影響尚不明確。本研究旨在分析胰島素對乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR P-gp表達(dá)和功能的影響，并初步探討胰島素治療對MCF-7/ADR細(xì)胞化療敏感性的影響。

1材料與方法

1.1材料（1）MCF-7/ADR細(xì)胞及培養(yǎng)試劑。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADR由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院惠贈；胎牛血清、青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、Trypsin胰蛋白酶等均為美國GIBCO公司產(chǎn)品；胰島素購自諾和諾德制藥有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自天津索羅門生物科技有限公司。（2）P-gp基因（abcb1）表達(dá)測定用試劑。E.Z.N.A總RNA分離試劑盒（美國OMEGA公司）；RT-PCR試劑盒（美國LIFE TECHNOLOGIES公司）；引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。（3）P-gp蛋白表達(dá)測定用試劑。SDS-PAGE微型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；PVDF膜（天津博美科生物技術(shù)有限公司）；一抗Anti-P-Glycoprotein Mouse mAb（C219）購自德國默克公司，一抗內(nèi)參α-tublin抗體購自美國Abcom公司，二抗（羊抗鼠）購自美國proteintech公司；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司。（4）羅丹明123實(shí)驗(yàn)。羅丹明123為美國GIBCO公司產(chǎn)品。（5）細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。表阿霉素購自美國輝瑞公司；噻唑藍(lán)（MTT）購自天津索羅門生物科技有限公司。

Tab. 1 The real time PCR oligonucleotide sequences表1　Real-time PCR引物序列

1.2方法

1.2.1 MCF-7/ADR細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理組分別用濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 μmol/L的胰島素孵育細(xì)胞，對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)5～6個平行孔，培養(yǎng)48 h。

1.2.2細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板，通過常用的MTT實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞活性。用不同濃度的（0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μmol/L）胰島素處理細(xì)胞48 h后，再用MTT避光孵育4 h，最后用DMSO溶解終止實(shí)驗(yàn)，用多功能酶標(biāo)儀讀取490 nm下吸光度。

1.2.3 P-gp基因表達(dá)檢測用E.Z.N.A總RNA分離試劑盒提取細(xì)胞RNA，采用RT-PCR法檢測P-gp基因表達(dá)，以βactin為內(nèi)參對照。反應(yīng)體系均為20 μL，逆轉(zhuǎn)錄參數(shù)：65℃，5 min；42℃，1 h；70℃，5 min。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性15 s，60℃，30s，共40個循環(huán)；最終72℃延伸30s。采用Ct值法（2- Ct）分析abcb1基因的相對表達(dá)。其中 Ct=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct管家基因）-對照組（Ct目的基因-Ct管家基因）。

1.2.4 P-gp蛋白表達(dá)檢測收集細(xì)胞裂解液提取蛋白備用。用10%SDS-PAGE膠分離蛋白質(zhì)，然后移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。Anti-P-Glycoprotein Mouse mAb （C219）一抗（1：50）孵育過夜，TBST液洗去一抗，以辣根過氧化物酶（HRP）連接的二抗（羊抗鼠1：5 000）孵育2 h，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒顯示免疫反應(yīng)條帶。α-tublin作為內(nèi)參對照。

1.2.5羅丹明123實(shí)驗(yàn)通過檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的積累來評估P-gp的外排功能。將細(xì)胞以1×104個/孔接種于96孔板，用不同濃度（0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μmol/L）的胰島素干預(yù)細(xì)胞48 h，然后用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2遍，再用1 mg/L羅丹明123孵育細(xì)胞3 h。收集細(xì)胞后，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm下測定羅丹明123的熒光強(qiáng)度值。熒光強(qiáng)度值越低反映P-gp的外排功能越強(qiáng)。

1.2.6細(xì)胞化療敏感性實(shí)驗(yàn)將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞以1× 104個/孔接種于96孔板，通過常用的MTT實(shí)驗(yàn)來檢測細(xì)胞對表阿霉素的化療敏感性。對照組正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，處理組用胰島素（0.10 μmol/L）孵育細(xì)胞48 h后，2組均再用不同濃度的表阿霉素（0、0.5、1、5、10、50 mg/L）處理48 h，然后用MTT避光孵育4 h，最后用DMSO溶解終止實(shí)驗(yàn)，用多功能酶標(biāo)儀在490 nm下讀取吸光度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行比較，方差分析后組間多重比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞活性及P-gp的影響與對照組比較，0.10 μmol/L胰島素可增加MCF-7/ADR細(xì)胞活性（P＜0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示，0.05、0.10 μmol/L胰島素組P-gp基因表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；Western Blot結(jié)果顯示，0.05、0.10 μmol/L胰島素組P-gp蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.05、0.10 μmol/L胰島素組P-gp外排功能增強(qiáng)（P＜0.05），見表2、圖1。

2.2胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞化療敏感性的影響與對照組比較，0.10 μmol/L胰島素可增加不同濃度（0、0.5、1、5、10、50 mg/L）表阿霉素干預(yù)的MCF-7/ADR細(xì)胞活性，降低MCF-7/ADR細(xì)胞的化療敏感性，見表3。

Tab. 2 The effects of insulin on cell viability and P-gp inMCF-7/ADR cells表2　胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞活性及P-gp的影響

Fig.1 The effects of insulin on the expression of P-gp of MCF-7/ADR cells圖1　胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響

Tab. 3 The effects of insulin on chemotherapeutic sensitivity of MCF-7/ADR cells under different concentration of epidoxorubicin表3　不同濃度表阿霉素作用下胰島素對MCF-7/ADR細(xì)胞化療敏感性的影響?。╪=6，x±s）

3　討論

多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）是指腫瘤細(xì)胞長期接觸某一化療藥物時，不僅會產(chǎn)生對此種化療藥物耐藥性，而且可對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性［8］。與MDR相關(guān)的蛋白可通過外排藥物有效地降低細(xì)胞內(nèi)大量藥物的積累和毒性［9］。其中，P-gp的作用最重要，其在腫瘤治療中能外排多種化療藥物，且與MDR有關(guān)［10］。

胰島素主要用來調(diào)節(jié)糖尿病患者的高血糖癥狀，但關(guān)于胰島素對癌細(xì)胞P-gp影響的研究很少。本研究發(fā)現(xiàn)，胰島素能夠增加MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp的表達(dá)和功能，降低表阿霉素對MCF-7/ADR細(xì)胞的毒性；而Wei等［11］發(fā)現(xiàn)，胰島素能夠增加胃癌細(xì)胞P-gp的表達(dá)，促進(jìn)其細(xì)胞生長，并降低5-氟脲嘧啶對細(xì)胞的毒性。另外，Liu等［12］研究認(rèn)為長期使用胰島素會增加腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞P-gp的表達(dá)和功能；胰島素治療也能增加糖尿病大鼠腦紋狀體毛細(xì)血管P-gp的表達(dá)［13］。這些研究均與本研究結(jié)果一致，說明胰島素能促進(jìn)P-gp的表達(dá)及藥物外排功能并降低抗腫瘤化療藥物的療效。本研究還發(fā)現(xiàn)，胰島素能增加MCF-7/ADR細(xì)胞活性，與Gallagher等［4］的研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為胰島素可通過激活胰島素受體促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長、分裂，表明胰島素可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。此外，Bowker等［14］的臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰島素治療的2型糖尿病患者癌癥相關(guān)病死率明顯增高；胰島素在乳腺癌特別是三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［15］。但Nawa等［16］發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠回腸中，胰島素使P-gp的表達(dá)和功能明顯下降。Yeh等［17］發(fā)現(xiàn)胰島素對腎的P-gp表達(dá)卻無影響。這與本研究結(jié)果不一致，原因可能是胰島素對不同的組織或細(xì)胞的影響不同。目前關(guān)于胰島素引起P-gp變化的機(jī)制研究較少。Liu等［18］研究認(rèn)為在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，胰島素可通過胰島素受體介導(dǎo)的蛋白激酶C（PKC）/核因子（NF）-κB通路增加P-gp的表達(dá)。

本研究僅進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，且未進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探討，而此前類似研究較少，因此尚無明確證據(jù)表明胰島素能降低乳腺癌患者化療敏感性。胰島素常用于治療2型糖尿病，尤其是伴隨嚴(yán)重并發(fā)癥的患者。但目前為止，鮮見大規(guī)模研究明確胰島素對腫瘤患者化療療效的影響。故本研究僅提示高胰島素可能通過增加P-gp的表達(dá)和功能促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞的MDR，從而降低乳腺癌細(xì)胞化療敏感性。今后需要更多的研究來探討胰島素對乳腺癌化療患者化療敏感性的影響及其相關(guān)機(jī)制。對于糖尿病乳腺癌患者的治療，有必要考慮胰島素對P-gp的影響，從而減少不良預(yù)后的發(fā)生。

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（2015-10-22收稿2015-11-12修回）（本文編輯李國琪）

Effects of high insulin on chemotherapeutic sensitivity in MCF-7/ADR cells

ZHU Nannan1，MU Lan2，LI Daiqing1
1 Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy，Ministry of Education，Tianjin Medical University Corresponding Author E-mail：Daiqingli68@163.com

Objective To analyse the effects of high insulin on the expression and function of P-glycoprotein（P-gp），and preliminarily investigate the influence of insulin on chemotherapeutic sensitivity in MCF- 7/ADR cells. Methods MCF-7/ADR cells were cultured with different concentrations of insulin（0.001，0.005，0.01，0.05 and 0.1 μmol/L）. Realtime PCR was used to detect the expression of P-gp mRNA. Western blot assay was used to detect the expression level of P-gp. Rhodamine 123 was used to detect the efflux function level of P-gp. Cell viability and chemotherapeutic sensitivity were detected by MTT assay. Results High concentration of insulin（0.1 μmol/L）promoted the proliferation of MCF-7/ADR cells. The concentration of insulin（0.05 and 0.1 μmol/L）accelerated P- gp mRNA and protein expression，which also augmentedthe effluxfunctionof P-glycoproteinandreducedthe chemotherapeutic sensitivitytoepirubicin. Conclusion High concentration of insulin may influence the drug resistance of breast cancer cells by promoting the expression and function of P-glycoprotein of MCF-7/ADR cells.

insulin；P-glycoprotein；drugresistance，neoplasm；Epirubicin；MCF-7/ADR cell

R737.9

A

10.11958/20150257

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81472472）

1天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

朱楠楠（1990），女，碩士在讀，主要從事糖尿病治療對腫瘤耐藥影響方面研究

E-mail：Daiqingli68@163.com