miR-506對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響

劉濤，祖彩華，沈中陽

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miR-506對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響

劉濤1，2，祖彩華3，沈中陽1，2

目的探討微RNA-506（microRNA-506，miR-506）對(duì)肝癌細(xì)胞活性、增殖和侵襲等惡性表型的調(diào)控作用。方法以肝癌細(xì)胞系HepG2和QGY-7703為模型，依處理方式不同分別分為細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)（細(xì)胞對(duì)照）組、pcDNA3空載體對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pcDNA3/pri-506過表達(dá)miR-506（過表達(dá)miR-506）組、pSIH1空載體對(duì)照組及轉(zhuǎn)染pSIH1/ TuD-506抑制miR-506（抑制miR-506）組。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-506的表達(dá)水平。分別用CCK-8實(shí)驗(yàn)、體外集落形成實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的活性、集落形成能力和侵襲能力。結(jié)果在肝癌細(xì)胞系HepG2和QGY-7703中，與對(duì)應(yīng)的空載體對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-506組的細(xì)胞內(nèi)miR-506表達(dá)水平升高，而抑制miR-506組的細(xì)胞內(nèi)miR-506表達(dá)水平降低（P＜0.05）；過表達(dá)miR-506組細(xì)胞活性降低且形成集落的數(shù)量和穿過Transwell微孔的細(xì)胞數(shù)量均減少，而抑制miR-506組細(xì)胞活性升高且形成集落的數(shù)量和穿過Transwell微孔的細(xì)胞數(shù)量均明顯增加（P＜0.05）。與細(xì)胞對(duì)照組相比，pcDNA3空載體對(duì)照組和pSIH1空載體對(duì)照組均不影響以上各指標(biāo)（P＞0.05）。結(jié)論miR-506抑制肝癌細(xì)胞的活性、集落形成能力和侵襲能力等惡性表型，在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用。

微RNAs；肝腫瘤；基因，腫瘤抑制；腫瘤侵潤(rùn)；細(xì)胞活性；miR-506

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，肝癌）是起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)肝癌患者超過500 000例［1］。肝癌具有高增殖活性、高侵襲轉(zhuǎn)移能力和高復(fù)發(fā)率特點(diǎn)，術(shù)后5年生存率僅為20%～30%［2］。探尋肝癌細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制，有助于深入理解肝癌的發(fā)生機(jī)制。微RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA家族。在哺乳動(dòng)物中，miRNA與靶RNA上的miRNA反應(yīng)元件（miRNA response element，MRE）進(jìn)行不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，可促進(jìn)靶RNA的降解或翻譯抑制［3］。研究顯示，幾乎所有的惡性腫瘤細(xì)胞都發(fā)生了miRNA表達(dá)譜的改變，miRNA的表達(dá)失調(diào)能夠影響腫瘤細(xì)胞的惡性表型［4］。目前，miRNA對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響尚未明確。本研究旨在觀察miRNA-506（miR-506）對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響。

1材料與方法

1.1材料肝癌細(xì)胞系HepG2和QGY-7703（天津賽爾生物技術(shù)有限公司），pcDNA3.1（+）質(zhì)粒（pcDNA3）和pSIH1-H1-puro質(zhì)粒（pSIH1）為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成和全基因合成由北京天潤(rùn)奧科生物科技有限公司完成。限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ）、T4 DNA連接酶、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent和mirVana miRNA提取試劑盒（Thermo公司），高糖DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司），細(xì)胞活性檢測(cè)試劑cell counting kit-8（CCK-8，Dojindo公司），孔徑8.0 μm Transwell微孔板（Corning公司），Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）。

1.2方法

1.2.1 miR-506過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/pri-506構(gòu)建以人類基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增miR-506前體片段，并克隆插入pcDNA3載體，構(gòu)建pcDNA3/pri-506質(zhì)粒，引物序列見表1。

Tab. 1 Sequence of primers used in this study表1　引物序列

1.2.2 miR-506“強(qiáng)誘餌”（tough decoy，TuD）型抑制物表達(dá)質(zhì)粒pSIH1/TuD-506的構(gòu)建采用全基因合成的方式，在pSIH1-H1-puro質(zhì)粒中插入TuD-506序列，構(gòu)建pSIH1/ TuD-506質(zhì)粒。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2和QGY-7703分別在含10%胎牛血清的高糖DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞按照Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行。依細(xì)胞處理方式的不同分為細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)（細(xì)胞對(duì)照）組、pcDNA3空載體對(duì)照組、轉(zhuǎn)染pcDNA3/ pri-506過表達(dá)miR-506（過表達(dá)miR-506）組、pSIH1空載體對(duì)照組及轉(zhuǎn)染pSIH1/TuD-506抑制miR-506（抑制miR-506）組。

1.2.4細(xì)胞miRNA提取和miR-506的定量PCR檢測(cè)細(xì)胞miRNA提取按照mirVana miRNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。以miRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并用SYBR Green法進(jìn)行定量PCR，檢測(cè)miR-506和內(nèi)參照U6的水平。逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行。miR-506的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔCt表示，其中ΔCt = CtmiR-506-CtU6。將細(xì)胞對(duì)照組的miR-506表達(dá)水平設(shè)為1，計(jì)算其他各組miR-506的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5細(xì)胞活性檢測(cè)將細(xì)胞按照每孔5×103接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔細(xì)胞加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)的吸光度值（A450），以各組A450的平均值評(píng)估細(xì)胞活性。

1.2.6細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行消化并計(jì)數(shù)，按照每孔100個(gè)細(xì)胞接種于12孔板。培養(yǎng)8～10 d后，細(xì)胞用2%結(jié)晶紫染液染色后進(jìn)行拍照。以集落中細(xì)胞數(shù)＞50作為集落形成的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)各孔集落數(shù)，以各組集落數(shù)的平均值評(píng)估細(xì)胞集落形成能力。

1.2.7 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力將Matrigel基質(zhì)膠40 μL加至Transwell微孔板的上室。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，按照每孔細(xì)胞數(shù)8×10（4HepG2細(xì)胞）或4×10（4QGY-7703細(xì)胞）、體積200 μL制備細(xì)胞懸液，加至Transwell微孔板的上室。下室添加含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液700 μL。37℃培養(yǎng)24 h（HepG2細(xì)胞）或12 h（QGY-7703細(xì)胞）后，將微孔膜置于固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）中固定，2%結(jié)晶紫染液染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野中被染成紫色的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，以各組陽性細(xì)胞數(shù)的平均值評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism v5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同處理?xiàng)l件下miR-506在HepG2、QGY-7703中的表達(dá)水平比較2種轉(zhuǎn)染條件下，細(xì)胞對(duì)照組和pcDNA3、pSIH1空載體對(duì)照組miR-506表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在HepG2 和QGY-7703中，過表達(dá)miR-506組miR-506表達(dá)水平均高于pcDNA3空載體對(duì)照；抑制miR-506組miR-506表達(dá)水平均低于pSIH1空載體對(duì)照組（P＜0.05），見表2。

2.2 miR-506對(duì)HepG2、QGY-7703細(xì)胞系活性的影響2種轉(zhuǎn)染條件下，細(xì)胞對(duì)照組和pcDNA3、pSIH1空載體對(duì)照組細(xì)胞活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在HepG2和QGY-7703中，過表達(dá)miR-506組細(xì)胞活性均低于pcDNA3空載體對(duì)照組，抑制miR-506組細(xì)胞活性均高于pSIH1空載體對(duì)照組（P＜0.05），見表3。

Tab. 2 The miR-506 expression level in HCC cell lines表2　miR-506在HepG2、QGY-7703中的表達(dá)水平（x ±s）

Tab. 3 Effects of miR-506 on cell viability of HCC cells表3　miR-506對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響

2.3 miR-506對(duì)HepG2、QGY-7703細(xì)胞集落形成能力的影響2種轉(zhuǎn)染條件下，細(xì)胞對(duì)照組和pcDNA3、pSIH1空載體對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在HepG2和QGY-7703中，過表達(dá)miR-506組較pcDNA3空載體對(duì)照組細(xì)胞體外集落形成能力均明顯降低，表現(xiàn)為分散的單個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，形成的集落數(shù)目減少；抑制miR-506組較pSIH1空載體對(duì)照組細(xì)胞形成集落的數(shù)目均增加，集落形成能力增強(qiáng)（P＜0.05），見圖1、表4。

Fig. 1 Colonies of HepG2 and QGY-7703 cells in five groups（crystal volet staining）圖1　不同處理情況下HepG2、QGY-7703肝癌細(xì)胞集落圖（結(jié)晶紫染色）

2.4 miR-506對(duì)HepG2、QGY-7703細(xì)胞系侵襲能力的影響2種轉(zhuǎn)染條件下，細(xì)胞對(duì)照組和pcDNA3、pSIH1空載體對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在HepG2和QGY-7703中，過表達(dá)miR-506組較pcDNA3空載體對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力減弱，表現(xiàn)為穿過基質(zhì)膠并變形通過微孔膜到達(dá)Transwell下室的細(xì)胞數(shù)量減少；抑制miR-506組較pSIH1空載體對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為穿過Transwell微孔膜的細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.05），見圖2、表5。

Fig. 2 Invasion of HepG2 and QGY-7703 cells in five groups（crystal violet staining，×100）圖2　不同處理情況下HepG2、QGY-7703細(xì)胞侵襲性表現(xiàn)（結(jié)晶紫，×100）

3　討論

目前，研究已證實(shí)，與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜可發(fā)生明顯改變，發(fā)生表達(dá)失調(diào)的miRNA可影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展［5］。一方面，miRNA在肝癌細(xì)胞中可能起到癌基因的作用，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，例如肝癌中發(fā)生上調(diào)的miR-25能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力［6］。另一方面，一些miRNA在肝癌細(xì)胞中具備抑癌基因的活性，如miR-212可抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［7］。miR-506在肝癌中的功能作用尚不清楚，本研究通過人工改變HepG2和QGY-7703肝癌細(xì)胞內(nèi)miR-506的水平，對(duì)其功能進(jìn)行探究。

與傳統(tǒng)的化學(xué)合成的miRNA反義寡核苷酸（ASO）相比，本研究對(duì)miR-506功能的抑制采用miRNA TuD的特殊結(jié)構(gòu)，其具有對(duì)靶miRNA的抑制效果穩(wěn)定且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)［8］。

本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-506的細(xì)胞經(jīng)CCK-8試劑染色后，代表細(xì)胞活性的A450值減低，而抑制miR-506的細(xì)胞染色后A450值升高，表明miR-506能夠抑制肝癌細(xì)胞的活性，提示高增殖活性是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征。另外，本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-506的肝癌細(xì)胞形成的集落數(shù)量明顯減少，而抑制miR-506的肝癌細(xì)胞形成集落數(shù)增加，表明miR-506對(duì)肝癌細(xì)胞集落形成能力亦具有明顯的抑制作用，提示在體外培養(yǎng)時(shí)，單個(gè)細(xì)胞發(fā)生增殖并形成一個(gè)單克隆來源的細(xì)胞團(tuán)即細(xì)胞集落的能力是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于非腫瘤細(xì)胞的重要特征之一。另有研究認(rèn)為，高轉(zhuǎn)移活性也是腫瘤細(xì)胞惡性程度的指標(biāo)，且肝癌細(xì)胞常具有較高的侵襲和轉(zhuǎn)移活性，是患者預(yù)后不佳的重要原因之一［9］。Transwell通過檢測(cè)穿過微孔的細(xì)胞數(shù)量即可反映細(xì)胞的侵襲活性。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-506的肝癌細(xì)胞中，能夠穿過微孔的細(xì)胞數(shù)明顯減少，而抑制miR-506的肝癌細(xì)胞穿過微孔的數(shù)量明顯增加，表明miR-506也能夠明顯抑制HepG2和QGY-7703細(xì)胞的侵襲能力。

在不同的細(xì)胞中或同一細(xì)胞的不同狀態(tài)下，miRNA可調(diào)控的靶基因種類和程度是存在差別的，由此有研究提出了miRNA功能性靶基因的概念［10］。通常情況下，miR-506在多種腫瘤細(xì)胞中均具有抑癌基因的活性，但其調(diào)控的功能性靶基因可能并不相同。此外，由相同的一個(gè)或多個(gè)miRNA調(diào)控的RNA分子之間能夠以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合共有miRNA的方式發(fā)生相互影響即存在競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA （ceRNA）機(jī)制［11］；該作用機(jī)制的失調(diào)也與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［12］。以上兩方面特點(diǎn)使得miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，而miRNA是這一網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵性分子。本研究則證實(shí)，miR-506對(duì)肝癌細(xì)胞系惡性表型具有抑制作用，表現(xiàn)為對(duì)增殖活性、集落形成能力以及侵襲能力的抑制。

綜上，miR-506在肝癌細(xì)胞中能發(fā)揮抑癌基因的作用，為明確miRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用提供了參考，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

（圖1、2見插頁）

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（2016-01-14收稿2016-02-15修回）（本文編輯陸榮展）

Effects of miR-506 on malignance phenotypes of hepatocellular carcinoma cells

LIU Tao1，2，ZU Caihua3，SHEN Zhongyang1，2
1 Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health，2 Organ Transplant Center，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300384，China；3 First Central Clinical College，Tianjin Medical University Corresponding Author E-mail：shenzy_2014@163.com

Objective To investigate effects of microRNA-506（miR-506）on malignant phenotypes of hepatocellular carcinoma（HCC）cells，including cellular viability，proliferation and invasion. Methods HCC cell lines HepG2 and QGY-7703 were served as model. Five experimental groups were established in this study，including cell control，pcDNA3 blank vector control，miR-506 over-expression，pSIH1 blank vector control and miR-506 suppression groups. Real-time reverse transcription PCR assay was performed to measure miR-506 level. CCK-8，colony formation and Transwell assays were performed to detect viability，colony formation activity and invasion activity of HCC cell lines，respectively. Effects of miR-506 on these indexes were evaluated. Results In HepG2 and QGY-7703 cell lines，miR-506 level increased in the miR-506 over-expression group（P＜0.01），and its level decreased in the miR-506 suppression group（P＜0.05）compared with the related blank vector control groups. In the miR-506 over-expression group，cellular viability was significantly reduced （P＜0.01），cell colony number decreased，and number of cell penetrating Transwell microporous membrane was also decreased（P＜0.01）. In the miR- 506 suppression group，cellular viability significantly increased（P＜0.01），and both colony number and penetrating cell number increased（P＜0.05）. Also，there were no effects on the above indexes in pcDNA3 and pSIH1 blank vector control groups compared with those of cell control group（P＞0.05）. Conclusion miR-506 plays atumor suppressor role in HCC cells by inhibitingcell viability，colony formation and invasion.

microRNAs；liver neoplasms；genes，tumor suppressor；neoplasm invasiveness；cell viability；miR-506

R735.7

A

10.11958/20160018

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81402322）；天津市企業(yè)博士后創(chuàng)新項(xiàng)目擇優(yōu)資助計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013）

1天津市第一中心醫(yī)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300384），2器官移植中心；3天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院

劉濤（1981），男，主管技師，博士，主要從事非編碼RNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)控研究

E-mail：shenzy_2014@163.com