小劑量美羅華聯(lián)合重組人血小板生成素治療難治性ITP療效以及對細(xì)胞免疫功能的影響

駱林勝，馮愛梅，薛阿利，李強，吳品，張日

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325200；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，江蘇 蘇州 215006)

小劑量美羅華聯(lián)合重組人血小板生成素治療難治性ITP療效以及對細(xì)胞免疫功能的影響

駱林勝1Δ，馮愛梅1，薛阿利1，李強1，吳品2，張日2

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325200；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，江蘇 蘇州 215006)

目的 探討小劑量美羅華聯(lián)合重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin，rhTPO)治療難治性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)療效以及對細(xì)胞免疫功能的影響。方法 選取難治性ITP患者43例，分為觀察組(n=23)和對照組(n=20)，觀察組給予小劑量美羅華聯(lián)合重組人血小板生成素治療，對照組給予重組人血小板生成素治療，2組均治療1個月，觀察并比較2組治療療效以及治療前后血小板計數(shù)(PLT)，T、B淋巴細(xì)胞的變化。結(jié)果 治療1個月后，觀察組和對照組總有效率分別為78.26%、70%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療3個月后，觀察組和對照組總有效率分別為73.91%、40%(P<0.05)；2組治療后PLT水平均時間延長而升高，且觀察組PLT水平升高幅度大于對照組(P<0.05)；2組治療后，CD4+、CD4+/ CD8+均顯著上升，CD8+均顯著下降(均P<0.05)，觀察組CD19+/ CD20+顯著下降(P<0.05)，而對照組CD19+/ CD20+差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 小劑量美羅華聯(lián)合重組人血小板生成素治療難治性ITP有效，能顯著增強患者細(xì)胞免疫功能，聯(lián)合治療比單用重組人血小板生成素療效時間更長。

免疫性血小板減少癥；難治性；美羅華；重組人血小板生成素；療效；細(xì)胞免疫功能

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是由于機體自身免疫功能異常，導(dǎo)致血小板破壞過多或巨核生成障礙，使患者血液中血小板數(shù)量減少，臨床表現(xiàn)以出血為主的疾病。對于難治性ITP和/或糖皮質(zhì)激素治療無效的ITP，國內(nèi)曾廣泛應(yīng)用環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤與長春堿類等免疫抑制劑，但其有效率較低，毒副作用較大，且起效緩慢(平均起效時間1～2個月)[1]，故臨床應(yīng)用也逐漸減少。美羅華(即利妥昔單抗)和重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin，rhTPO)均是治療ITP的新型藥物，美羅華是人鼠嵌合型單克隆抗CD20抗體，能夠清除產(chǎn)生自身抗體的B淋巴細(xì)胞，且相對安全及較少引起骨髓抑制，現(xiàn)多用于治療難冶性ITP。重組人血小板生成素(rhTPO)通過刺激巨核細(xì)胞分化和成熟來促進血小板的產(chǎn)生，有效增加外周血中血小板計數(shù)(platelet count，PLT)。本研究利用美羅華聯(lián)合rhTPO治療難治性ITP，取得良好療效，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月-2015年9月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科收治的難治性ITP患者43例。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡16～75歲，男女不限。符合下列ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：多次實驗室檢查血小板計數(shù)減少，血細(xì)胞形態(tài)無異常；脾臟一般不腫大；骨髓檢查巨核細(xì)胞數(shù)增多或正常，有成熟障礙；除外各種先天性血小板減少、假性血小板減少和其它繼發(fā)性血小板減少癥；血小板計數(shù)≤30×109/L，或血小板計數(shù)≥30×109/L但有出血表現(xiàn)；經(jīng)糖皮質(zhì)激素正規(guī)治療4周后無效或有效后復(fù)發(fā)，且不宜或不接受脾切除術(shù)治療，或切脾治療無效或有效后復(fù)發(fā)；自愿接受住院治療并簽屬知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前3個月內(nèi)接受過其他二線藥物治療的患者，如環(huán)孢素、長春新堿、達(dá)那唑、環(huán)磷酰胺等；入組前3周內(nèi)接受過化療，抗凝藥物或其他可能影響血小板計數(shù)的治療；嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能不全者；嚴(yán)重免疫缺陷，或全身自身免疫性疾病者；研究者認(rèn)為不宜參加本試驗的任何其他情況的患者。

依據(jù)患者家庭經(jīng)濟條件以及患者意愿，將所有患者分為觀察組和對照組，觀察組23例，其中男13例，女10例；年齡21～68歲，平均年齡(44.5±23.5)歲；病程6個月～12年，平均病程(5.71±4.21)年。對照組20例，其中男11例，女9例；年齡24～69歲，平均年齡(46.5±22.5)歲；病程8個月～10年，平均病程(5.23±3.86)年。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：觀察組給予小劑量美羅華聯(lián)合重組人血小板生成素治療，具體為：小劑量美羅華100 mg(利妥昔單抗，上海羅氏制藥有限公司，批號：SH0066)加入100 mL無菌無致熱源的生理鹽水中，稀釋到利妥昔單抗?jié)舛葹? mg/ mL，單獨建立靜脈通道，以100 mL/h的速度持續(xù)靜脈滴注(首次應(yīng)用需先以50 mL/h的速度滴注，1小時后可調(diào)整至100 mL/h，每周1次，分別于第1，8，15，22 d應(yīng)用，共應(yīng)用4次。重組人血小板生成素(特比澳，沈陽三生制藥股份有限公司，批號：S20050048)300 U/kg qd×14，皮下注射(SC)，于第1至14天連續(xù)應(yīng)用，其后根據(jù)患者血小板計數(shù)情況1～3次/每周，第30天停藥。

對照組單予重組人血小板生成素治療，方法同上。所有患者均予止血對癥治療，有明顯出血傾向者予輸注血小板懸液。

1.2.2 檢測指標(biāo)

療效標(biāo)準(zhǔn)[2]：分別于治療一個月后和三個月后觀察2組療效，療效標(biāo)準(zhǔn)為：完全反應(yīng)(complete reaction，CR)，治療后血小板計數(shù)≥100×109/L且沒有出血；有效(reaction，R)，治療后血小板計數(shù)≥30×109/L，并且至少比基礎(chǔ)血小板數(shù)增加2倍且沒有出血；無效(no reaction，NR)，治療后血小板計數(shù)<30×109/L或者增加不到基礎(chǔ)的2倍或者有出血。

常規(guī)檢查 2組患者于治療前，治療第一個月每周復(fù)查血常規(guī)，治療第2到3個月，每2周復(fù)查血常規(guī)，普朗全自動血液分析儀XFA6000A監(jiān)測血小板計數(shù)(PLT)。

T、B細(xì)胞亞群檢查 2組患者于治療前和治療1個月后新鮮采集外周靜脈血標(biāo)本。所有采集標(biāo)本用EDTA抗凝管收集，采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，加入不同的熒光標(biāo)記抗體，用流式細(xì)胞儀(BD公司的FACS Caliber 型)檢測 CD19+，CD20+B淋巴細(xì)胞和CD4+，CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的變化。

2 結(jié)果

2.1 療效評價 治療一個月后，觀察組 CR，R例數(shù)分別為6，12，總有效率為78.26%(18/23)，治療3個月后總有效率為73.91%(17/23)；治療1個月后，對照組 CR、R例數(shù)分別為5、9，總有效率為70%(14/20)，治療3個月后總有效率降為40%(8/20)。2組治療1個月后總有效率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.383，P>0.05)，2組治療3個月后總有效率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.055，P<0.05)。

2.2 2組治療前后PLT對比 2組治療前，PLT差異無統(tǒng)計學(xué)意義，2組治療后，PLT均高于治療前(P<0.05)；治療7 d、14 d、1個月，觀察組和對照組PLT差異無統(tǒng)計學(xué)意義；治療2個月、3個月后，觀察組PLT顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組治療前后PLT對比

*P<0.05，與同組治療前比較，compared with the same group pre-treatment；#P<0.05，與對照組治療后比較，compared with control group post-treatment

2.3 2組治療前后T、B淋巴細(xì)胞對比 2組治療前， T淋巴細(xì)胞亞群差異無統(tǒng)計學(xué)意義，2組治療1個月后 CD4+、CD4+/ CD8+均顯著上升，CD8+均顯著下降(P<0.05)，且觀察組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；2組治療前，CD19+/CD20+差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療1個月后，觀察組CD19+/CD20+顯著下降(P<0.05)而對照組CD19+/CD20+差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

組別 例數(shù)時間CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+CD19+/CD20+對照組20治療前30 2±4 739 1±16 20 77±0 2920 5±7 8治療后38 2±5 4?31 4±6 3?1 22±0 85?19 3±8 0觀察組23治療前28 6±6 341 2±17 80 69±0 3521 3±6 8治療后39 8±4 2?30 2±5 6?1 32±0 75?15 23±6 2?

*P<0.05，與同組治療前比較，compared with the same group pre-treatment；#P<0.05，與對照組治療后比較，compared with control group post-treatment

3 討論

最新的國際ITP工作組共識推薦的一線治療方案有腎上腺皮質(zhì)激素、靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)和靜脈抗D球蛋白，其中腎上腺皮質(zhì)激素包括潑尼松/潑尼松龍、地塞米松以及甲基強的松龍。目前糖皮質(zhì)是治療初診成人ITP的一線藥物，對大部分ITP有效，而約30%患者糖皮質(zhì)激素治療無效或治療過程中復(fù)發(fā)，或需要較大劑量的糖皮質(zhì)激素才能維持療效從而產(chǎn)生明顯的副作用，對這部分難治性ITP患者應(yīng)考慮二線治療方案[3-4]，美羅華和重組人血小板生成素(rhTPO)均是治療ITP的新型藥物。

ITP的發(fā)生主要與免疫功能紊亂相關(guān)，包括T、B淋巴細(xì)胞功能異常[5]。ITP患者的血小板表面存在著許多自身免疫球蛋白，通過巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的免疫介導(dǎo)血小板的破壞，B細(xì)胞轉(zhuǎn)變而成的漿細(xì)胞是所有免疫球蛋白的來源，控制B細(xì)胞的過度激活、活化、分化成為漿細(xì)胞，甚至清除B細(xì)胞已成為ITP治療的研究方向。美羅華為人鼠嵌合抗CD20單克隆抗體，可通過補體依賴細(xì)胞毒作用、抗體依賴的細(xì)胞毒作用和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮清除血液、淋巴結(jié)以及骨髓中B淋巴細(xì)胞的作用[6]。本研究結(jié)果也表明，觀察組患者治療1個月后患者體內(nèi)B淋巴細(xì)胞均被清除，同時CD4+、CD4+/CD8+均顯著上升，CD8+均顯著下降(P<0.05)。說明患者細(xì)胞免疫功能得到顯著提升。國外研究指出美羅華治療ITP療效確切，且長期隨訪結(jié)果顯示，患者均未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，不良反應(yīng)在患者可耐受范圍內(nèi)[7-8]。并且美羅華在慢性ITP患者中可代替脾切除術(shù)，是安全有效的治療藥物[9]。但因價格昂貴，且為自費藥品，限制了標(biāo)準(zhǔn)劑量在治療難治性ITP中的應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外也有報道小劑量美羅華治療難治性ITP的反應(yīng)率與標(biāo)準(zhǔn)劑量相近，但起效時間更長[10-11]。

重組人血小板生成素(rhTPO)是在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)的全長糖基化的血小板生成素(TPO)。TPO，亦稱作為巨核細(xì)胞生長發(fā)育因子(MGDF)，是一種主要由肝腎合成的糖蛋白，通過刺激巨核細(xì)胞分化和成熟來促進血小板的產(chǎn)生。TPO能夠刺激骨髓生成血小板，使得外周血中血小板計數(shù)增加。由北京協(xié)和醫(yī)院等多中心臨床試驗研究表明[12]，rhTPO升高ITP患者血小板，近期有效率高于50%，臨床試驗中出現(xiàn)的不良反應(yīng)多不需處理，如輕微發(fā)熱，乏力，注射部位疼痛，頭暈等，提示其安全性較好。孫君艷等[13]研究表明單一劑量rhTPO能夠使血小板計數(shù)呈劑量依賴性增加，于給藥后第5天開始上升，10～14天達(dá)到峰值，但停藥后血小板數(shù)量逐漸下降至基線。本研究結(jié)果表明，單用rhTPO治療1個月后，PLT均高于治療前且差異有顯著意義(P<0.05)，而停藥后PLT開始下降，治療1個月后總有效率為70%，3個月后總有效率降為40%。本實驗結(jié)果與孫君艷、曹慧琴等[13-14]的研究一致。

美羅華治療起效時間長，rhTPO起效快但停藥后血小板回落，患者不能獲得長期緩解。本研究應(yīng)用小劑量美羅華聯(lián)合rhTPO治療難治性ITP，能使難治性ITP患者血小板在短期內(nèi)(治療1周后)快速上升，且相比單一rhTPO治療患者又能獲得較長期緩解。因此，本研究具有重要臨床價值和現(xiàn)實意義，符合成本效益原則。

總而言之，本研究結(jié)果顯示小劑量美羅華聯(lián)合rhTPO治療難治性ITP有效，能顯著增強患者細(xì)胞免疫功能，且聯(lián)合治療比單用rhTPO療效時間更長。

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(編校：譚玲)

Effect of lower-dose rituximab combined with recombinant human thrombopoietin in treatment of patients with refractory primary immune thrombocytopenia and the influence on the cellular immune function

LUO Lin-sheng1Δ, FENG Ai-mei1, XUE A-li1, LI Qiang1, WU Ping2, ZHANG Ri2

(1.Department of Hematology, The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325200, China; 2.Department of Hematology, First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou 215006, China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of lower-dose rituximab combined with recombinant human thrombopoietin (rhTPO) in treatment of patients with refractory primary immune thrombocytopenia (ITP) and the influence on the function of immune cells.Methods43 cases of refractory ITP patients were divided into the observation group(n=23) and the control group(n=20), the observation group was given lower-dose rituximab combined with rhTPO treatment, the control group was given only rhTPO treatment. Both two groups were treated for one month, the therapeutic effect of the two groups and the changes of platelet count (PLT), T and B lymphocytes before and after treatment were observed and compared.ResultsAfter a month of treatment, the total effective rate of the observation group and the control group were 78.26% and 70% respectively, after three months of treatment, the total effective rate of the observation group and the control group were 73.91% and 40% respectively(P<0.05); After treatment, both two group patients’ PLT levels were significantly higher than before treatment (P<0.05); PLT after treatment rised, and the PLT in observation group elevated greater than the control group (P<0.05);After treatment, the level of CD4+, CD4+/CD8+increased significantly in two groups, and CD8+were decreased significantly(P<0.05).CD19+/CD20+levels decreased significantly in the observation group(P<0.05), while the level of CD19+/CD20+in the control group had no significant difference.ConclusionLower-dose rituximab combined with rhTPO treatment could effectively treat refractory ITP, it could significantly enhance the cellular immune function of patients, and the curative effect time of combined treatment is longer than the single use of rhTPO.

immune thrombocytopenic purpura; refractory; rituximab; recombinant human thrombopoietin; clinical efficacy; cellular immune function

溫州市科技計劃項目(Y20150181)

駱林勝，通信作者，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：血液病的基礎(chǔ)和臨床研究，E-mail：luolinsheng63@163.com。

R558.2

A

1005-1678(2015)12-0026-03