利用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng)及其初步應(yīng)用

余深翼，趙金榮，鄭玲紅，朱二鵬，周五朵，吳寶成

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室，福州 350002)

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利用CRISPR/Cas 9技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng)及其初步應(yīng)用

余深翼，趙金榮，鄭玲紅，朱二鵬，周五朵，吳寶成*

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室，福州 350002)

摘要：旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因編輯技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌aroA基因的敲除系統(tǒng)，并分析其對不同大腸桿菌aroA基因敲除、修復(fù)的差異。首先構(gòu)建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9載體；隨后人工設(shè)計同源修復(fù)供體基因序列，并亞克隆到CRISPR/Cas 9載體中，構(gòu)建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除體系；將該系統(tǒng)分別應(yīng)用到大腸桿菌DH10B、DH5α和JM109細胞中，PCR鑒定篩選到的陽性菌株，并回收其擴增條帶進行克隆、測序。CRISPR/Cas 9載體的酶切與測序結(jié)果均正確，表明載體構(gòu)建成功；PCR鑒定結(jié)果顯示，該系統(tǒng)對三種大腸桿菌均能進行aroA基因的有效敲除，敲除效率為46%～58%；測序結(jié)果進一步證實目的基因敲除成功。本試驗成功構(gòu)建大腸桿菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系統(tǒng)，為進一步研究致病菌aroA基因功能及開發(fā)減毒大腸桿菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas 9系統(tǒng)；大腸桿菌；aroA基因；敲除；同源修復(fù)

aroA基因負責(zé)編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，該酶可催化芳香族氨基酸的合成，是細菌芳香族氨基酸代謝中的重要酶類。芳香族氨基酸生物合成途徑是革蘭陰性菌和陽性菌共有的途徑，而哺乳動物不具備該合成途徑[1-2]。aroA基因最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，隨后在其他細菌中也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。研究人員發(fā)現(xiàn)，aroA基因的缺失導(dǎo)致EPSPS不能正常合成，細菌在無此合成途徑的哺乳動物宿主內(nèi)無法獲得該酶，從而影響細菌的正常生長，同時也降低了相應(yīng)的毒力[3]。aroA基因缺失的營養(yǎng)缺陷型菌株的選育，為新型減毒活疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。早在1981年，S.K.Hoiseth等就對傷寒沙門菌的aroA基因做了敲除研究，發(fā)現(xiàn)缺失aroA基因的菌株，其毒力明顯降低[3]。L.H.Garside等利用同源重組技術(shù)，對胸膜肺炎放線桿菌的aroA基因進行敲除，并成功篩選出了缺失菌株[4]。T.Kim等在體外表達豬圓環(huán)病毒的CAP基因，并利用aroA基因缺失的支氣管波氏桿菌作為活疫苗載體，構(gòu)建重組細菌疫苗，免疫豬能夠很好地誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[5]。

成簇、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是許多細菌和古細菌抵御外來噬菌體入侵的一種免疫機制，最早被發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌基因中[6-7]。CRISPR通常由前導(dǎo)區(qū)(leader)、間隔區(qū)(spacers)以及重復(fù)序列區(qū)(repeats)三部分組成[8-9]。原間隔序列旁側(cè)存在一個保守的短序列，稱為PAM (protospacer-adjacent motif)，該序列作為Cas 蛋白對原間隔序列識別的一個序列信號。在CRISPR位點側(cè)旁通常包含一組保守的CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associated genes，Casgenes)，可以編碼具有核酸酶和解旋酶活性的Cas蛋白[10-11]。Cas蛋白與CRISPR轉(zhuǎn)錄出來的RNA共同組成蛋白質(zhì)核酸復(fù)合物，并發(fā)揮免疫功能[12]。Cas 9 是Cas蛋白家族中的一員，與CRISPR共同構(gòu)成II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，行使其核酸內(nèi)切酶功能，對靶點DNA序列進行特異性切割，從而實現(xiàn)對基因組的精確編輯[13-14]。原核細胞大多缺乏非同源末端連接修復(fù)系統(tǒng)，需對切割的基因組DNA進行人工同源重組修復(fù)，進而實現(xiàn)原核基因組精確的敲除、修飾等[15]。

本研究基于CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建含有aroA基因靶向RNA(sgRNA)及用于同源修復(fù)的Donor序列的質(zhì)粒，分析其對不同大腸桿菌aroA基因的敲除效率，并在較短的時間內(nèi)篩選出aroA基因缺失菌株，為研發(fā)新型疫苗載體和深入探析致病菌aroA基因功能奠定基礎(chǔ)，同時也為研究其他動物病原體重要基因功能及其作用機制提供重要平臺。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

pEwt-Cas 9 和psgRNA-GFP質(zhì)粒均由Biomics Biotech公司提供，構(gòu)建psgRNA-GFP質(zhì)粒時，插入不含有BsaⅠ氨芐抗性基因(其氨芐抗性基因序列與pX458質(zhì)粒的氨芐抗性基因序列一致)。pUC 57質(zhì)粒由本實驗室保存，DH10B、DH5α和JM109感受態(tài)細胞均由本實驗室制備并保存。 sgRNA 啟動子為組成型啟動子J23100，Cas 9啟動子為化膿鏈球菌spcas9天然啟動子。

1.2主要試劑

膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)和質(zhì)粒小提試劑盒(Plasmid Mini Kit)均購于OMEGA公司；DNA Marker、Premix ExTaqTMMix Version 2.0和TIANamp Bacteria DNA Kit均購于TaKaRa公司；氯霉素(chloromycetin)和氨芐青霉素(ampicillin)均購于上海生工公司。

1.3sgRNA的設(shè)計和相關(guān)引物的合成

aroA基因sgRNA由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計。根據(jù)DH10B菌株的aroA基因序列(GenBank序列號CP000948.1)，在aroA基因CDS區(qū)的+41位置設(shè)計靶向sgRNA，并命名為aroAsgRNA，分別在sgRNA的上下游5′端添加BsaⅠ黏性末端。根據(jù)aroA編碼基因的上下游序列設(shè)計左、右同源臂引物，分別為aroA L F/R和aroA R F/R。此外，還設(shè)計了sgRNA及Donor質(zhì)粒構(gòu)建過程中需要的其他引物aroA Aml F/R、aroA LRF-M13F/R以及aroA基因鑒定引物aroAP F/R。各引物和sgRNA寡核苷酸序列及目的片段大小見表1。所有的引物和寡核苷酸鏈均由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4sgRNA載體的構(gòu)建

取等量的sgRNA上下游引物混合(終濃度為10 μmol·L-1)，加入退火B(yǎng)uffer進行退火處理。退火條件：95 ℃ 10 min，慢慢降溫到25 ℃。取BsaⅠ酶切后的psgRNA-GFP質(zhì)粒1 μL與稀釋后的雙鏈sgRNA退火產(chǎn)物 4 μL，22 ℃下連接2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞中，用帶氨芐青霉素抗性的平板篩選，挑取單克隆進行搖菌，小提質(zhì)粒，并做酶切和測序鑒定。把構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為psgRNA-GFP-aroAsgRNA。

表1sgRNA和引物及其目的片段大小

Table 1Sequences and product length of sgRNA and primers

sgRNA/引物sgRNA/Primers序列Oligonucleotidesequences片段/bpLengtharoAsgRNAFaroAsgRNAR5'-GATCCCAACCCATCGCTCGTGTCGAT-3'(BsaⅠ)5'-AAACATCGACACGAGCGATGGGTTGG-3'(BsaⅠ)20aroALFaroALR5'-CGCGGATCCACGAAACGCCAGACTTCGG-3'(BamHⅠ1011282-1011300)5'-CCCAAGCTTGTTCGAACTCAACCATGA-3'(HindⅢ1011861-1011878)600aroARFaroARR5'-CGCGGATCCGCCGAGATCGCGACATACAA-3'(BamHⅠ 1013091-1013110)5'-CCCAAGCTTACTTGATTGCCGCTGTCCAT-3'(HindⅢ 1013592-1013612)520aroAAmlFaroAAmlR5'-CCGGAATTCACGAAACGCCAGACTTCGG-3'(EcoRⅠ)5'-CTAGTCTAGACGTTCGAACTCAACCATGAAGT-3'(XbaⅠ)610aroALRF-M13FaroALRF-M13R5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'5'-CGCCATATGTTCACACAGGAAACAGCTATGA-3'(NdeⅠ)1250aroAPFaroAPR5'-CCATCGACGAAACGCCAGAC-3'(1011276-1011295)5'-TGTTACCCAATGCTTTGGCGA-3'(1013653-1013673)2400/1200

1.5aroA基因同源臂(Donor)載體的構(gòu)建

以DH10B細菌基因組DNA為模版，aroA L F/R和aroA R F/R為引物，PCR擴增左右同源臂(以下稱Donor)序列，即Donor aroA L和aroA R。采用25 μL體系：DNA模板2 μL，PremixTaqMix 12.5 μL，aroA L(或R)上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，之后95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。取PCR擴增產(chǎn)物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

分別對回收的PCR產(chǎn)物和pUC 57質(zhì)粒進行BamHⅠ+Hind Ⅲ雙酶切(37 ℃，2 h)，22 ℃連接2 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選并挑取單克隆菌落，搖菌后小提質(zhì)粒，并作酶切和測序鑒定。把構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pUC57-aroA L 和pUC57-aroA R。

以pUC57-aroA L為模板，aroA Aml F/R為引物，PCR擴增出兩端含EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點的aroAL基因序列。分別對回收的aroAL基因和pUC57-aroA R質(zhì)粒進行EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切、連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，篩選并挑取單克隆菌落，搖菌后小提質(zhì)粒，并作酶切和測序鑒定。把構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pUC57-aroA L R(Donor)。

1.6含sgRNA及aroA基因同源臂載體的構(gòu)建

以構(gòu)建好的質(zhì)粒pUC57-aroA L R為模板，aroALRF-M13F 和aroALRF-M13R為引物，PCR擴增出含有EcoRⅠ和NdeⅠ的aroAL R 基因，分別對回收的aroAL R基因和psgRNA-GFP-aroA sgRNA質(zhì)粒進行EcoRⅠ+NdeⅠ雙酶切、連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，篩選并挑取單克隆菌落，搖菌后小提質(zhì)粒，并作酶切鑒定和測序鑒定。質(zhì)粒命名為psgRNA-GFP-aroA sgRNA-Donor。

1.7感受態(tài)細胞制備及細菌的轉(zhuǎn)化

DH5α、DH10B和JM109三種大腸桿菌aroA基因相似性高達98%，故推測本試驗構(gòu)建的針對aroA基因的CRISPR/Cas 9敲除系統(tǒng)可能適用于這三種菌。參考《分子克隆實驗指南》，按照CaCl2法分別制備DH5α、DH10B、JM109的化學(xué)感受態(tài)細胞，把構(gòu)建好的psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor質(zhì)粒和pEwt-Cas 9質(zhì)粒分別先后轉(zhuǎn)化到DH5α、DH10B和JM109感受態(tài)細胞中。

1.8穩(wěn)定敲除aroA基因的DH5α、DH10B、JM109菌株的篩選

分別用帶氯霉素和氨芐青霉素抗性的平板篩選同時含有psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor質(zhì)粒和pEwt-Cas 9質(zhì)粒的菌株，用針對aroA基因的特異性引物aroA P F和aroA P R進行菌液PCR檢測。對PCR檢測敲除成功的菌，回收其PCR產(chǎn)物進行TA克隆，并送InvitrogenTM生物公司測序，將測序結(jié)果和原基因進行比對，檢測aroA基因是否敲除成功。

2結(jié)果

2.1sgRNA載體的構(gòu)建

將退火后形成的雙鏈sgRNA定向亞克隆到psgRNA-GFP(氨芐抗性基因序列中不含有BsaⅠ酶切位點)質(zhì)粒中，將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體psgRNA-GFP-aroA sgRNA送檢測序，測序結(jié)果正確，可用于下一步試驗。sgRNA載體構(gòu)建圖譜如圖1所示。

2.2aroA基因同源臂載體的構(gòu)建

分別以aroA L F/R和aroA R F/R為引物擴增aroA基因左右兩端同源臂：aroAL(600 bp)和aroAR(520 bp)。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(如圖2A)顯示，PCR擴增產(chǎn)物均與預(yù)期的條帶大小相符。

分別對左右同源臂重組質(zhì)粒pUC57-aroA L(3 330 bp)和pUC57-aroA R(3 220 bp)進行酶切鑒定，結(jié)果如圖2A所示，重組質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ+Hind Ⅲ雙酶切后可見2 700和600 bp (520 bp)的兩條特異性條帶，均與預(yù)期大小一致。陽性重組質(zhì)粒的測序結(jié)果進一步證實序列完全正確。

以aroA Aml F和aroA Aml R為引物，pUC57-aroA L為模板，PCR擴增出paroAL(610 bp)序列，結(jié)果與預(yù)期大小一致(圖2B)。對重組的質(zhì)粒pUC57-aroA L R(3 850 bp)進行酶切鑒定，結(jié)果如圖2B所示，重組質(zhì)粒經(jīng)過EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切后可見2 700和1 150 bp的兩條特異性條帶，均與預(yù)期大小一致。陽性重組質(zhì)粒的測序結(jié)果顯示完全正確。

A.質(zhì)粒的部分圖譜以及BsaⅠ酶切位點位置；B.aroA基因靶向sgRNA的插入位置及其周邊DNA序列A.Partial map of psgRNA-GFP plasmid and location of Bsa Ⅰ restriction site；B.Insertion position and flanking sequences of aroA gene-targeted sgRNA圖1　靶向aroA基因的psgRNA-GFP-aroA sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建圖譜Fig.1　Schematic representation of psgRNA-GFP-aroA sgRNA construction

A.aroA L(左)和aroA R(右)同源臂載體構(gòu)建：M1、M2.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.aroA L擴增結(jié)果；2.aroA R擴增結(jié)果；3.重組質(zhì)粒pUC57-aroA L的BamHⅠ單酶切產(chǎn)物；4.pUC57-aroA L的BamHⅠ+Hind Ⅲ雙酶切產(chǎn)物；5.aroA L基因?qū)φ眨?.線性化的pUC57；7.重組質(zhì)粒pUC57-aroA R的BamHⅠ單酶切產(chǎn)物；8.pUC57-aroA R的BamHⅠ+HindⅢ雙酶切產(chǎn)物；9.線性化的pUC57；10.aroA R基因?qū)φ铡.aroA L R同源臂載體構(gòu)建：M2.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.paroA L擴增產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒pUC57-aroA L R 的EcoRⅠ單酶切產(chǎn)物；3.pUC57-aroA L R的EcoRⅠ+XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物；4.aroA L R基因?qū)φ眨?.線性化的pUC57A.Construction of the recombinant plasmid pUC57-aroA L and pUC57-aroA R：M1.DL2000 marker；M2.DL10000 marker；1.PCR product of aroA L；2.PCR product of aroA R；3.Single digestion of pUC57-aroA L by BamH Ⅰ；4.Double digestion of pUC57-aroA L by BamHⅠ+Hind Ⅲ；5.aroA L control；6.Linearized pUC57；7.Single digestion of pUC57-aroA R by BamHⅠ；8.Double digestion of pUC57-aroA R by BamHⅠ+HindⅢ；9.Linearized pUC57；10.aroA R control.B.Construction of the recombinant plasmid pUC57-aroA L R：M2.DL5000 marker；1.PCR product of paroA L；2.Single digestion of pUC57-aroA L R by EcoRⅠ；3.Double digestion of pUC57-aroA L R by EcoRⅠ+XbaⅠ；4.aroA L R control；5.Linearized pUC57圖2　aroA基因同源臂載體構(gòu)建的鑒定Fig.2　PCR and restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pUC57-aroA L R (Donor)

2.3psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor載體的構(gòu)建

以pUC57-aroA L R為模板，aroALR-M13F和aroALR-M13R為引物，PCR擴增出aroAL R(1 200 bp)基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖3)顯示與預(yù)期的條帶一致。

對構(gòu)建好的psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor(4 900 bp)質(zhì)粒用EcoRⅠ+NdeⅠ內(nèi)切酶做酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒經(jīng)過EcoRⅠ+NdeⅠ雙酶切后可見3 750和1 150 bp的兩條特異性條帶，均與預(yù)期大小一致。將重組好的質(zhì)粒送測序鑒定，結(jié)果與原序列一致。psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor載體的構(gòu)建過程如圖4A所示。

2.4對不同大腸桿菌aroA基因敲除效率的檢測

用以上構(gòu)建好的CRISPR/Cas 9系統(tǒng)對DH5α、DH10B、JM109菌株分別進行aroA基因的敲除，aroA基因敲除模式如圖4B所示。用橫跨aroA基因同源臂的鑒定引物aroA P F/R擴增目的條帶，鑒定aroA基因的敲除情況，結(jié)果如圖5所示，aroA基因沒被敲除修復(fù)的菌，PCR顯示為2.4 kb的條帶，反之出現(xiàn)1.2 kb的目的條帶。該系統(tǒng)對DH5α、DH10B、JM109菌株的敲除效率分別為54%、46%和58%。并分別對以上敲除后形成小片段擴增產(chǎn)物(1.2 kb)進行TA克隆，送檢測序。測序結(jié)果與設(shè)計的Donor序列是一致的，表明被Cas 9敲除后的aroA基因在人工設(shè)計的Donor序列下發(fā)生了同源修復(fù)。以上結(jié)果均表明，本研究構(gòu)建的CRISPR/Cas 9系統(tǒng)在人工同源修復(fù)下，可對大腸桿菌aroA基因進行穩(wěn)定的敲除。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.aroA L R基因擴增產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒psgRNA-GFP-aroAsgRNA-aroALR的 EcoRⅠ單酶切產(chǎn)物；3.psgRNA-GFP-aroAsgRNA-aroALR的EcoRⅠ+NdeⅠ雙酶切產(chǎn)物；4.aroA L R基因?qū)φ眨?.線性化的psgRNA-GFP-aroAsgRNAM.DL5000 marker；1.PCR product of aroA L R；2.Single digestion of psgRNA-GFP-aroAsgRNA-aroALR by EcoRⅠ；3.Double digestion of psgRNA-GFP-aroAsgRNA-aroALR by EcoRⅠ+ NdeⅠ；4.aroA L R control；5.Linearized psgRNA-GFP-aroAsgRNA圖3　psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor載體構(gòu)建檢測Fig.3　PCR and restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid

A.psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor載體的構(gòu)建過程；B.aroA基因的敲除模式A.Costruction of recombinant plasmid psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor；B.Detailed diagram of continual genome editing with the two-plasmid CRISPR/Cas 9 system圖4　aroA基因同源修復(fù)載體的構(gòu)建及其敲除模式Fig.4　Schematic representation of psgRNA-GFP-aroAsgRNA-Donor construction knockout pattern

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1～24.分別是24個雙陽性單克隆菌落的PCR擴增結(jié)果，未敲除的PCR擴增產(chǎn)物大小為2.4 kb，敲除后的PCR擴增產(chǎn)物大小為1.2 kbM.DL5000 marker；1～24.24 monoclonal colonies for PCR amplification，the undeleted and deleted PCR products are 2.4 kb and 1.2 kb，respectively圖5　aroA基因敲除后的PCR鑒定Fig.5　PCR and sequencing analysis of the post-knockout aroA gene

3討論

CRISPR/Cas 9系統(tǒng)是研究人員從細菌和古細菌的免疫機制中發(fā)現(xiàn)的一種基因編輯技術(shù)，該技術(shù)與鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)統(tǒng)稱為三大人工核酸酶技術(shù)[16]。早期的ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)，都是通過DNA蛋白復(fù)合物對靶點進行特異性的識別和切割[17]。這兩種技術(shù)不僅在構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒時費時費力，而且后期操作中對技術(shù)要求很高，因此在普通實驗室很難普及，這也限制了此技術(shù)的廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)對靶位點的識別，主要依賴于與靶標DNA互補配對的sgRNA。因此需要根據(jù)目的基因靶位點的PAM序列設(shè)計sgRNA，通常大小為20 bp[12]。表達的Cas 9蛋白可與sgRNA結(jié)合，形成蛋白質(zhì)核酸復(fù)合物。該復(fù)合物識別特定的靶點DNA序列，發(fā)揮Cas 9核酸酶的作用，對靶位點進行精確的基因編輯[18]。質(zhì)粒的構(gòu)建和后續(xù)操作過程都相對簡單、快捷且易于掌握。CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)已然成為生命科學(xué)等研究領(lǐng)域的新寵[19]，對動物及動物病原的基因改造研究越發(fā)重要。

致病菌是能引起許多動物發(fā)生傳染病的病原，對其毒力基因進行基因組水平的改造，在選育強弱毒菌株等方面至關(guān)重要[20-21]。在CRISPR/Cas 9技術(shù)出現(xiàn)之前，主要應(yīng)用同源重組對細菌進行基因組的編輯，應(yīng)用比較成熟的同源重組系統(tǒng)有Red/Flp等[22]，為解析基因功能和作用機制的研究做出了重要貢獻。但單純應(yīng)用同源重組技術(shù)對基因組進行編輯的效率極低，且不同的物種間，構(gòu)建好的同源重組質(zhì)粒的基因編輯效率差異很大[23]，對于不同的細菌，往往需要更換不同的條件和質(zhì)粒。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)使得基因改造技術(shù)有了新的飛躍，該系統(tǒng)方便快捷，在原核生物尤其是細菌基因組改造中的應(yīng)用研究已屢見不鮮[15-24]。研究人員在應(yīng)用CRISPR/Cas 9技術(shù)編輯原核生物基因組時發(fā)現(xiàn)，目的基因被Cas 9剪切后，絕大多數(shù)不能修復(fù)自身斷裂基因組，結(jié)果導(dǎo)致細菌死亡。而如果在此基礎(chǔ)上存在同源修復(fù)的Donor序列時，斷裂的基因雙鏈則可發(fā)生自發(fā)性同源重組，且效率得到大幅提高[15]。因此，將CRISPR/Cas 9技術(shù)與同源重組技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建含Cas 9、sgRNA和Donor序列的重組載體，就能對原核基因進行有效準確編輯。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)在發(fā)展的過程中有許多技術(shù)的改進，例如Y.Jiang等[24]在Cas 9質(zhì)粒構(gòu)建時引入了Red重組系統(tǒng)，使CRISPR/Cas 9針對一個細菌中的多個基因同時高效敲除，該系統(tǒng)的重要改進是Donor序列不需要克隆到載體里面，直接與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，從而大大降低了試驗難度。然而由于很多病原大腸桿菌的細胞壁結(jié)構(gòu)跟大腸桿菌基因工程菌(例如DH5α、DH10B)細胞壁有很大的不同，轉(zhuǎn)化效率較低，不適合直接大量共轉(zhuǎn)化DNA片段作為供體，因此采用作者建立的CRISPR系統(tǒng)對這些難轉(zhuǎn)化的病原大腸桿菌的基因敲除更有優(yōu)勢。本研究的結(jié)果表明，應(yīng)用CRISPR系統(tǒng)可對大腸桿菌aroA基因進行快速的編輯，而細菌內(nèi)殘留質(zhì)粒的消除還有待于進一步研究。Y.Jiang等[24]以溫敏型質(zhì)粒pKD46為基礎(chǔ)，插入Cas 9基因，構(gòu)建溫敏型的Cas 9質(zhì)粒，根據(jù)提供sgRNA和Donor的載體序列，設(shè)計一對靶向其自身的sgRNA序列。Cas 9蛋白完成目的基因敲除的同時，也會把提供sgRNA和Donor的載體切斷。在完成敲除工作后，提高溫度培養(yǎng)細菌，可使Cas 9質(zhì)粒消失。

aroA基因是細菌在芳香烴生物合成途徑中一個重要的酶[1]，aroA基因缺失時，不能正常合成EPSPS[13]，當(dāng)該菌感染哺乳動物后，就無法合成相應(yīng)的化合物，進而導(dǎo)致細菌生長抑制和毒力降低。早期有人用同源重組技術(shù)，對aroA基因進行改造，形成營養(yǎng)缺陷型的細菌，確實能降低致病菌的毒力[3]。Blast比對不同的大腸桿菌菌株aroA基因，可以發(fā)現(xiàn)其在不同菌株中序列非常保守，這就使構(gòu)建一個不嚴格要求種間差異的通用敲除體系成為可能。本試驗成功構(gòu)建的CRISPR/Cas 9敲除系統(tǒng)含有特異靶向aroA基因sgRNA和Donor的基因元件，可對aroA基因進行定點的切割和同源重組修復(fù)，能對不同來源的大腸桿菌進行aroA基因敲除，結(jié)果顯示其敲除效率沒有太大差異。在該體系的應(yīng)用過程中，使用的均不是致病菌，而是基因工程菌，所以接下來作者會進一步使用原有的體系，對臨床中常見致病菌的aroA基因進行敲除，深入探索致病菌aroA基因缺失后的生物學(xué)功能變化以及其對哺乳動物致病力的影響。

4結(jié)論

構(gòu)建了大腸桿菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系統(tǒng)。該系統(tǒng)可對DH5α、DH10B、JM109三種大腸桿菌的aroA基因進行快速的敲除及修復(fù)，并可在較短的時間內(nèi)篩選出aroA基因缺失菌株。為進一步研究致病菌aroA基因功能及開發(fā)減毒大腸桿菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

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(編輯白永平)

The Application of CRISPR/Cas 9 Technology for aroA Gene Knockout in Escherichia coli

YU Shen-yi，ZHAO Jin-rong，ZHENG Ling-hong，ZHU Er-peng，ZHOU Wu-duo，WU Bao-cheng*

(CollegeofAnimalScience，F(xiàn)ujianAgricultureandForestryUniversity，F(xiàn)uzhou350002，China)

Abstract:CRISPR/Cas 9 system is a novel gene editing technology.This study was aimed to construct CRISPR/Cas 9-based knockout system forE.coliaroAgene，and analyze knockout efficiencies in differentE.colis. In the present study，aroAgene-targeting short guide RNA (sgRNA) was designed and constructed together with Donor sequence for homologous repair，then this resulting vector and pEwt-Cas 9 vector co-constituted the CRISPR/Cas 9 system.Preliminary application was performed onE.coliDH10B，DH5α and JM109，respectively，and then knockout efficiencies ofaroAgene were analyzed by PCR amplification，TA cloning and subsequent DNA sequencing.The restriction enzyme digestion analysis and sequencing results showed that homologous repair vector was successfully constructed.PCR results indicated that the established CRISPR/Cas 9 system could be used foraroAgene knockout in multipleE.coliwith efficiency ranging from 46% to 50%.Sequencing results further confirmed the successful and accurate knockout ofaroAgene.In conclusion，CRISPR/Cas 9-based knockout system forE.coliaroAgene was successfully established，which would provide a novel and effective tool for functional studies onaroAgenes of other pathogenic microorganisms and further development of attenuated vaccine.

Key words:CRISPR/Cas 9 system；Escherichiacoli；aroAgene；knockout；homologous repair

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.016

收稿日期：2015-10-10

基金項目：福建省畜禽新發(fā)疫病診斷和防治技術(shù)研究(ky0040052)

作者簡介：余深翼(1990-)，男，福建福州人，碩士生，主要從事畜禽新發(fā)疫病診斷和防治技術(shù)研究，E-mail: yushenyi2014@163.com *通信作者：吳寶成，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: bc20020212@163.com

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0762-09