南燭葉多酚氧化酶最適提取條件的研究

馮佳麗　何新葉　笪榮輝　金奎　何志勇　陳潔

摘要[目的]深入探討南燭葉多酚氧化酶（PPO）的酶學(xué)性質(zhì)，對南燭葉PPO的最適提取條件進行研究。[方法]以南燭葉為原料，分別研究了交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）添加含量、料液比、浸提時間和pH各因素對其提取的PPO酶活的影響。[結(jié)果]試驗表明，適量南燭葉粉末，以料液比1∶15 g/mL，加入含9%PVPP（W/V）pH 7.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（0.1 mol/L），勻漿并于4 ℃下浸提9 h，過濾，濾液經(jīng)冷凍離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min）后得到酶活最高的PPO酶液（11 335 U/mL）。[結(jié)論]研究結(jié)果可為促進南燭葉的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞 南燭葉；多酚氧化酶；酶活；提取

中圖分類號 S789.4 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）05-128-03

Abstract[Objective]The aim was to explore the enzymatic properties of PPO from Vaccinium bracteatum Thunb leaf and research the optimum extraction conditions of PPO.[Method]Effects of PVPP content， solidliquid ratio， extraction time， pH on PPO enzyme activity were studied respectively.[Result]The results showed that appropriate amount of V. bracteatum power was added into citric acidphosphate buffer （0.1 mol/L pH 7.6） containing 9% PVPP（W/V） with solidliquid ratio 1∶15 g/mL， extracted at 4 ℃ for 9 h， through filtering， centrifuging at 4 ℃， 12 000 r/min for 20 minutes， PPO with the highest enzyme activity （11 335 U/mL） was obtained.[Conclusion]The study can provide reference for promoting industrialized application of V. bracteatum leaf.

Key words Vaccinium bracteatum Thunb leaf； Polyphenol oxidase（PPO）； Enzyme activity； Extraction

南燭（Vaccinium bracteatum Thunb），又名烏飯樹，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium），由于江浙、福建、湖廣一帶以其莖葉浸漬染米，加工烏飯，故而得名。研究南燭葉多酚氧化酶（PPO）的最適提取條件，可為南燭葉PPO的分離純化以及南燭葉染色機制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。目前，植物活體內(nèi)直接提取PPO的方法有丙酮法、勻漿法等，PPO可分為游離態(tài)和束縛態(tài)2種，通常用丙酮法提取所得的是PPO總酶活，而用勻漿法提取所得則為可溶性酶活性[1]。很多試驗表明，勻漿法有助于游離態(tài)可溶性酶活性提高。李立祥等以安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園福鼎大白茶品種一芽二葉以及一芽三葉初展為原料時，利用勻漿法和勻漿浸提法進行酶活測定的試驗數(shù)據(jù)顯示，勻漿浸提對PPO活性確有提高，其原因為：一方面緩沖液勻漿法增大了料液的接觸面積，酶蛋白易于溶出，同時也可使束縛態(tài)的PPO部分轉(zhuǎn)化為可溶性的酶溶出，使得PPO酶得率提高；另一方面，緩沖液與茶鮮葉細(xì)胞液生理特性比較接近，酶溶出后活性損失小[2]。筆者采用緩沖液勻漿浸提的方法，并通過對各單因素的研究，對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，希望為南燭葉的工業(yè)化應(yīng)用提供參考指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料。南燭葉采自江蘇省宜興市，洗凈，冷凍干燥后存于冰箱中備用。

1.1.2

主要儀器。Sigma3K15高速冷凍離心機，美國西格瑪奧德里奇集團；HWS24 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多上海有限公司；Alph1102可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；BCD191CR冰箱，合肥榮事達電器有限公司；FE20 pH計，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

1.1.3 主要試劑。交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鄰苯二酚，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 不同添加量PVPP對提取南燭葉PPO的影響。

參照文獻方法[3]，稱取南燭葉粉末5份，每份0.5 g，料液比1∶12 g/mL，分別加入內(nèi)含0%、5%、7%、9%、11% PVPP（W/V）經(jīng)遇冷的pH 6.8的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），將勻漿于4 ℃下浸提6 h，6層紗布過濾，濾液在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，上清液即為粗制酶液，測定PPO酶活性，分析不同PVPP添加量提取南燭葉PPO的效果。

1.2.2 不同料液比對提取南燭葉PPO的影響。

參照文獻方法[3]，稱取南燭葉粉末6份，每份0.5 g，料液比1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21、1∶24 g/mL，加入內(nèi)含5% PVPP（W/V）經(jīng)遇冷的pH 6.8的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），后續(xù)提取過程同“1.2.1”，分析不同料液比提取南燭葉PPO的效果。

1.2.3 不同浸提時間對提取南燭葉PPO的影響。

參照文獻方法[3]，稱取南燭葉粉末4份，每份0.5 g，料液比1∶12 g/mL，加入內(nèi)含5% PVPP（W/V）經(jīng)遇冷的pH 6.8的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），分別將勻漿于4 ℃下浸提3、6、9、12 h，后續(xù)提取同“1.2.1”，分析不同浸提時間提取南燭葉PPO的效果。

1.2.4 不同pH的磷酸鹽緩沖液對提取南燭葉PPO影響。

參照文獻方法[3]，稱取南燭葉粉末8份，每份0.5 g，料液比1∶12 g/mL，分別加入內(nèi)含5% PVPP（W/V）經(jīng)遇冷的pH為5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），后續(xù)提取同“1.2.1”，分析不同pH的緩沖液提取南燭葉PPO的效果。

1.2.5 PPO酶活性的測定。

參照文獻方法[4-5]，在試管中加入2 mL pH 6.8的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），0.9 mL的0.1 mol/L 的鄰苯二酚，在30 ℃恒溫水浴中保溫5 min，然后加入0.1 mL粗酶液，迅速搖勻，測定反應(yīng)體系在420 nm波長下的吸光度，以最初直線段的斜率計算酶活力。

雙空白：一份以緩沖溶液及鄰苯二酚作為空白，另一份以緩沖溶液和粗酶液作為空白，并保證體積與反應(yīng)試劑相同。

酶活性的定義：以1 min內(nèi)420 nm 處吸光值（A）變化 0.001 定義為 1 個酶活力單位（1 U），酶活性表示為：

酶活力（UmL）=A0.001×反應(yīng)時間（min）×測定時酶液用量（mL）

2 結(jié)果與分析

2.1 PVPP不同添加量對南燭葉PPO提取的影響

PVPP不同添加量提取南燭葉PPO的效果如圖1所示。結(jié)果表明，加入PVPP的效果比不加PVPP要好，且提取過程中加入9%的PVPP的酶活最高。 PVPP是一種酚類吸附劑，通過疏水作用、氫鍵和范德華力與多酚形成復(fù)合物[6]。在緩沖液中加入PVPP可以除去PPO的酚類底物，同時也可以阻止提取過程中酶的聚合與失活[7]。隨著PVPP含量的提高，PVPP吸附酚類物質(zhì)效果變好，可以有效防止PPO的活性受損，但添加較多時，又會對酶活產(chǎn)生抑制作用。

2.2 不同料液比對南燭葉PPO提取的影響

不同料液比對提取南燭葉PPO的效果圖如圖2所示。結(jié)果表明，料液比1∶15 g/mL時，提取所得的酶液的活性最高。料液比中溶劑用量過低導(dǎo)致原料中的PPO不能完全從組織中萃取出來，提取不徹底造成其酶活較低；隨著料液比中溶劑用量的增加，可溶性蛋白全部溶出，酶活達到峰值[8]，再增加緩沖液的用量時，稀釋了PPO的濃度，酶活性降低。由總酶活可知，在液料比1∶15 g/mL時緩沖液體積差不多達到飽和水平，其不再是酶活的限制因素，故而再增加緩沖液體積時總酶活基本保持不變。

2.3 不同浸提時間對南燭葉PPO提取的影響

浸提時間對南燭葉PPO提取效果的影響如圖3所示。結(jié)果表明，9 h的浸提時間下酶活性最高。數(shù)據(jù)表明，在一定時間范圍內(nèi)，浸提時間越長，酶活呈現(xiàn)增長的趨勢，但時間過長同時也會對酶活有所抑制。浸提時間過短，酶不能完全從細(xì)胞中萃取出來；隨著時間的增加，由于酶蛋白在溶液狀態(tài)下的構(gòu)象不穩(wěn)定，以及南燭酚類等其他物質(zhì)溶出，均容易導(dǎo)致酶活性的降低[9-10]。

2.4 pH不同的緩沖液對南燭葉PPO提取的影響

不同pH緩沖液對南燭葉PPO提取效果的影響如圖4所示。結(jié)果表明，pH 7.6的緩沖液浸提南燭葉效果最佳，酶活性最高。緩沖液在提取中的主要作用是中和細(xì)胞破碎時從空泡中放出的大量的酸，保持pH接近7.5以及離子強度在0.1～0.5，高離子強度有助于將酶從結(jié)合的膜上解析下來[11]。pH在5.6～6.4的范圍內(nèi)，對維持pH和離子強度的作用相差不大，當(dāng)緩沖液的pH達到7.6時，酶活急劇增加，該環(huán)境下酶蛋白易于被全部溶解。

3 結(jié)論與討論

通過不同單因素的提取試驗，確定南燭葉PPO的最適提取條件為：適量南燭葉粉末，料液比1∶15 g/mL，加入內(nèi)含9%的PVPP（W/V）經(jīng)遇冷的pH 7.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（0.1 mol/L），將勻漿于4 ℃下浸提9 h，6層紗布過濾，濾液在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，上清液即為粗制酶液，其酶活為11 335 U/mL。

多酚氧化酶是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于果蔬細(xì)胞的質(zhì)體中[12]，而果蔬中又含有大量的酚類物質(zhì)，在PPO的催化作用下進一步氧化、聚合生成黑色素，對PPO的有效提取造成一定困難，故需要對提取條件進行研究。研究表明，不同來源的多酚氧化酶其提取條件有一定的差異，緩沖液的最適pH浮動較大。該研究以烏飯樹葉為原料時，最適提取條件為：pH 7.6、PVPP含量9%、料液比為1∶15 g/mL；在劉琨等以蘇州碧螺春為原料的試驗中，采用pH 5.6的緩沖液，料液比為1∶4.5 g/mL[13]；而盧麗娜等以奉化水蜜桃為原料的試驗中，采用pH 8.0的緩沖液，料液比為1∶12 g/mL[14]。同時也有研究指出，提取過程中加入一定的NaCl、PMSF、Trition100等物質(zhì)對PPO的提取有一定的幫助，所得酶液的活性較高。選用最適的提取條件可帶來良好的生產(chǎn)效益，該研究對未來南燭葉工業(yè)化的生產(chǎn)加工有指導(dǎo)意義。

參考文獻

[1]蕭偉祥.茶的多酚氧化和過氧化物酶的研究進展[J].茶業(yè)通報，1983（6）：3-7.

[2]李立祥，吳紅梅.提取方法對茶多酚氧化酶活性的影響[J].中國茶葉加工，2001（4）：26-31.

[3]許雷.茶樹多酚氧化酶的提取、分離純化及其部分酶性質(zhì)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：9-18.

[4]徐廣洲.烏飯樹葉黑色素形成相關(guān)的酶與底物的初步研究[D].無錫：江南大學(xué)，2014：12-22.

[5]梁建榮.甘薯葉多酚氧化酶的分離純化及部分與功能基團研究[D].重慶：西南大學(xué)，2011：32-40.

[6]WUYTS N，WAELE D D，SWENEN R.Extraction and partial characterization of polyphenol oxidase from banana （Musa acuminate Grand naine）roots[J].Plant physiology and biochemistry，2006，44：308-314.

[7]BNDICTE L，VIRGINIE M L，TRISTAN R，et al.PVPPpolyphenol complexes：A mole cular approach[J].Journal of agricultural and food chemistry，2006，54（12）：4383-4389.

[8]SUN X H，ZHU K，ZHOU H M.Optimization of a novel backward extraction of defatted wheat germ protein from reverse micelles[J].Innovative food science and emerging technologies，2009，10：328-333.

[9]GAO Z J，HAN X H，XIAO X G.Puri cation and characterisation of polyphenol oxidase from red swiss chard[J].Food chemistry，2009，117：342-348.

[10]賀寅，王強，鐘葵.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取龍眼多糖工藝[J].食品科學(xué)，2012，33（2）：79-83.

[11]王璋.食品酶學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

[12]YORUK R，MARSHALL M R.Physicochemical properties and function of plant polyphenol oxidase：A review[J].Journal of food biochemistry，2003，27（5）：361-422.

[13]劉琨，錢和，汪何雅.茶葉中多酚氧化酶提取的響應(yīng)面優(yōu)化[J].食品科技，2013，38（1）：206-210.

[14]盧麗娜，盧婕，劉亮，等.奉化水蜜桃多酚氧化酶提取純化工藝研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（7）：1451-1453.