SENL通過mTOR通路抑制前列腺癌的研究

吳 強， 桂亞平， 袁 濤， 卞崔冬， 吳登龍

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，上海 200065)

?

SENL通過mTOR通路抑制前列腺癌的研究

吳 強， 桂亞平， 袁 濤， 卞崔冬， 吳登龍

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，上海 200065)

目的 探討印楝(AzadirachtaIndica)抑制前列腺癌進展的分子機制。方法 利用超臨界流體萃取技術(shù)，制備SENL。不同濃度SENL處理人前列腺癌LNCaP-luc2、PC3細胞24h，細胞計數(shù)法和MTS法檢測SENL對LNCaP-luc2、PC3細胞生長曲線的影響并計算增殖抑制率；觀察細胞形態(tài)學(xué)改變；AnnexinV法檢測早期凋亡率；免疫細胞化學(xué)法檢測癌細胞增殖、凋亡及侵襲相關(guān)蛋白mTOR、s6K70、integrin、FAK、AR等的表達差異，免疫熒光法檢測侵襲相關(guān)的蛋白表達差異。結(jié)果 SENL能抑制前列腺癌細胞的增殖，且成劑量依賴性。經(jīng)IC50處理的前列腺癌細胞，免疫印跡法檢測到mTOR通路的核心成分mTOR、s6K70蛋白的表達顯著受到抑制，同時integrin、FAK水平明顯下調(diào)。結(jié)論 體 外實驗中證實SENL通過抑制mTOR及相關(guān)通路活性，顯著抑制前列腺癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。

印楝超臨界萃取物； mTOR通路； 前列腺腫瘤

印楝葉(AzadirachtaIndica, SENL)為楝科常綠喬木,作為藥用植物已有2000多年的歷史,全株各部位均可藥用。印楝的重要性為美國國家科學(xué)院所重視,1992年發(fā)表了“印楝—解決全球問題的一種樹”的報告[1]。印楝數(shù)千年來廣泛用于治療各種急、慢性病，其提取物無毒、無誘變，具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤形成的特性[2,3]。其主要生物活性成分是檸檬苦素類化合物，三萜類化合物，無萜類化合物，酚類，黃酮類化合物等[4-5]，能作用多個癌細胞通路[6-8]。本研究通過測定人前列腺癌LNCaP-luc2、PC3細胞系的mTOR信號通路在印楝治療前后的變化，探討印楝抑制前列腺癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細胞株LNCaP-luc2，為雄激素依賴性，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達熒光素，購買于Caliper Life Sciences公司。人前列腺癌細胞株P(guān)C-3，源于骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌，為雄激素非依賴性，購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection， ATCC)。兩個細胞系均通過了ATCC的鑒定。

新鮮印楝樹葉購自美國國弗羅里達州印楝樹農(nóng)場；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、Annexin VFITC/PI雙染試劑盒、山羊抗兔二抗(紅色,Cy5標記)、山羊抗鼠二抗(綠色,FITC標記)、4%～12% Bis-Tris凝膠(1.5mm厚,10孔)、MES SDS電泳緩沖液(20×)、Transfer Buffer蛋白質(zhì)凝膠緩沖液(20×)、MagicMarkTMXP Western蛋白標準品、Novex Sharp Pre-Stained Protein Standard染色蛋白標簽、樣本還原劑(10×)、抗氧化劑、LDS樣本緩沖液(4×)均購自美國Life Technologies公司；MTS CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay購自美國Promega公司；細胞裂解緩沖液系統(tǒng)RIPA Lysis Buffer System、兔抗mTOR多克隆抗體、兔抗p-mTOR多克隆抗體、兔抗Integrin β1多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；兔抗P70-S6K多克隆抗體、兔抗p-P70-S6K多克隆抗體、兔抗AR多克隆抗體、鼠抗GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、購自美國Santa Cruz公司；SuperSignal West Pico增強型化學(xué)發(fā)光底物購自美國Thermo Scientific公司；兔抗p-AR多克隆抗體購自美國Millipore公司；兔抗p-FAK(phospho Y397)多克隆抗體、兔抗FAK多克隆抗體購自美國Abcam公司；鼠抗Integrin β1單克隆抗體購自美國BD公司。

酶聯(lián)免疫檢測儀、NanoDrop分光光度計購自美國Therom公司；流式細胞儀(FACSCalibur)購自美國BD公司；超臨界流體萃取系統(tǒng)(Spe-ed SFE-2 System)購自美國Applied Separations公司；共聚焦顯微鏡(LSM 780)購自德國Carl Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人前列腺癌LNCaP-luc2細胞用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液(含青鏈霉素混合液1%)，人前列腺癌PC-3細胞用含5%胎牛血清DEME培養(yǎng)液(含青鏈霉素混合液1%)，置于溫度為37℃、氣體環(huán)境為5%CO2、濕度為飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每4～5d觀察細胞生長狀況并換液1次，待細胞貼滿細胞培養(yǎng)瓶細胞面時，即可用0.05%胰酶消化、傳代。

1.2.2 印楝超臨界萃取物制備 印楝樹葉選用同年夏季新鮮樹葉，經(jīng)蒸餾水清洗，風(fēng)干后粉碎，使用Speed超臨界流體萃取儀(參數(shù)設(shè)置為： 壓力9000psi 及50℃下靜態(tài)萃取1h，液態(tài)CO2以3L/min動態(tài)萃取2h。收集玻璃管置于-49℃干冰和丙酮收集)，萃取出SENL保存于-20℃。以DMSO及乙醇作為溶劑，制備混懸液，應(yīng)用時進一步稀釋，使DMSO濃度低于0.01%。

1.2.3 MTS法檢測細胞增殖 將生長狀況良好的細胞，用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后，按照LNCaP-luc2細胞3×103cells/孔，PC-3細胞1.5×103cells/孔接種于96孔板，加入100μl新鮮培養(yǎng)液后，移至37℃、5%CO2氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗設(shè)空白對照組(無細胞僅有培養(yǎng)液)、溶劑對照組(DSMO和培養(yǎng)液)、陰性對照組(細胞和培養(yǎng)液)及試驗組。48h后觀察細胞貼壁生長良好，按上述試驗分組向96孔板內(nèi)加入SENL，每組設(shè)6個重復(fù)孔，濃度依次為25、20、12.5、10、6.25、5、3.125、2.5μg/ml。之后將96孔板放入37℃、5%CO2氣體、飽和適度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72h。用MTS試劑盒CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay， RPMI及解凍的MTS Reagen按照19∶1的比例配制MTS溶液，每組試驗結(jié)束后，加入MTS溶液100μl/孔，將其放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min后，酶標儀測定其490nm下的吸光度值(D490)。計算出不同SENL濃度下平均吸光度值及相對空白對照的百分比，作為細胞相對增殖率，以SENL濃度為橫坐標，腫瘤細胞相對增殖率為縱坐標，繪制曲線圖，計算出半數(shù)有效濃度IC50。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取生長狀況良好的PC-3及LNCaP-luc2細胞，培養(yǎng)于10cm細胞培養(yǎng)皿中。用SENL處理細胞，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)液，另設(shè)空白對照孔(只加培養(yǎng)液)，分別收集24、48、72h的細胞，細胞計數(shù)后收集1×105個細胞，1000r/min，離心半徑20cm 37℃離心5min，小心吸棄上清,用PBS漂洗細胞2遍,離心同上。棄上清后，每個樣本中加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻。室溫(20～25℃)避光孵育30min，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可重懸細胞2～3次以改善染色效果。隨即流式細胞儀檢測，結(jié)果判斷： Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

正?；罴毎幱谧笙孪笙?；早期調(diào)亡細胞處于右下象限；晚期調(diào)亡細胞處于右上象限；壞死細胞處于左上象限。

1.2.5 Western免疫印跡法檢測蛋白表達 取經(jīng)過IC50SENL處理過的LNCaP-luc2及PC-3細胞，裂解液裂解30min后，以超聲細胞粉碎儀充分粉碎，提取細胞總蛋白，使用NanoDrop分光光度計以BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)濃度校準計量后將樣品用70℃沸水使蛋白變性，冷卻至室溫上樣于4%～12% Bis-Tris 凝膠(1.5mm厚,10孔)并加入緩沖液及抗氧化劑后電泳，“三明治”法轉(zhuǎn)膜完畢后，封閉PVDF印跡膜，將一抗4℃冰箱中過夜孵育；次日二抗轉(zhuǎn)染、顯影及定影后X膠片用凝膠成像分析軟件進行分析，測定所需條帶的分子量和凈光密度值。

1.2.6 免疫熒光染色檢測蛋白表達 取生長狀況良好的PC-3及LNCaP-luc2細胞，培養(yǎng)于1.5cm消毒的玻片上，玻片置入6孔板內(nèi)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h。用IC50SENL處理細胞24、48、72h，陰性對照組加入等體積培養(yǎng)液，另設(shè)空白對照孔(只加培養(yǎng)液)，福爾馬林固定后透化處理，先后加入一抗及二抗孵育后，共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SENL對前列腺癌細胞在體外增殖的影響

不同濃度的SENL作用24h后,LNCaP-luc2與PC-3前列腺癌細胞增殖率分均隨SENL濃度增大而減小。不同濃度的SENL對前列腺癌細胞的抑制率與陰性對照組(0μg/ml)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);不同濃度SENL對前列腺癌細胞增值率的組間兩兩比較,組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 SENL對前列腺癌細胞在體外增殖抑制的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig.1 MTS assay evaluate the viability of PC3 and LNCaP-luc2 oells treated with SENL與PC3組相比，*P<0.05

應(yīng)用SPSS 13.0軟件作probit回歸分析，計算出SENL處理前列腺癌細胞24h后，不同細胞的IC50。結(jié)果顯示，LNCaP-luc2 IC50為12μg/ml；PC-3 IC50為15μg/ml；SENL對前列腺癌細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性。

2.2 SENL對前列腺癌細胞凋亡的影響

IC50SENL作用前列腺癌細胞,對比12、24h后,早期凋亡細胞比例LNCaP-luc2從18.1%升至26.5%，PC-3從4.72%升至12.2%，晚期調(diào)亡細胞比例LNCaP-luc2從6.25%升至8.65%，PC-3從4.66%升至13.7%，呈時間及計量依賴性,且均高于陰性對照組相應(yīng)的各期細胞調(diào)亡率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 SENL誘導(dǎo)LNCaP-luc2細胞調(diào)亡結(jié)果Fig.2 LNCaP-luc2 cells apoptosis resultA： 流式細胞圖；B： SENL誘導(dǎo)不同時間細胞調(diào)亡率比較

圖3 SENL誘導(dǎo)PC3細胞調(diào)亡結(jié)果Fig.3 PC3 cells apoptosis resultA： 流式細胞圖；B： SENL誘導(dǎo)不同時間細胞凋亡率比較

2.3 mTOR相關(guān)通路蛋白的表達結(jié)果

Western 印跡法檢測顯示，與對照組相比，SENL可以明顯下調(diào)mTOR、p-mTOR的表達(P<0.01)，同時還可以明顯下調(diào)S6K70、p-S6K70、AR、FAK、p-FAK以及Integrin β1的表達(P<0.01)，說明SENL通過抑制mTOR及其上、下游相關(guān)蛋白的表達及活化水平發(fā)揮作用，見圖4。

圖4 SENL抑制前列癌細胞系蛋白的表達Fig.4 Western Blot result of PC3 and LNCaP-luc2 cells treated with SENL

2.4 免疫熒光檢測SENL抑制前列腺癌細胞粘著斑形成

LNCaP-luc2、PC-3對照組，可見FAK及Integrin形成的局部粘著斑聚集在細胞伸出的偽足邊緣；LNCaP-luc2以及PC-3 SENL治療組，細胞形態(tài)改變失去極向，偽足消失，F(xiàn)AK與Integrin分離，局部粘著斑消失，見圖5。SENL可以明顯抑制粘著斑激酶FAK以及整合素Integrin β1的表達，并且明顯抑制兩者在細胞邊緣的聚集進而抑制粘著斑的形成，說明SENL通過抑制粘著斑激酶表達及活化水平發(fā)揮抑制前列腺癌細胞遷移的作用。

圖5 SENL抑制列腺癌細胞粘著斑的免疫熒光結(jié)果Fig.5 lmmunofluoresence of PC3 and LNCaP-luc2 cells treated with SENL紅： FAK;綠： Integrin β1;藍： DAPI

3 討 論

在眾多信號傳導(dǎo)通路中，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)發(fā)揮著樞紐核心的作用，能整合細胞內(nèi)和細胞外信號，調(diào)節(jié)細胞新陳代謝，生長，增殖和存活，參與細胞增殖、分化、遷徙及蛋白質(zhì)合成等過程。mTOR為不典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量為289000，由2549個氨基酸組成[9]，一方面，mTOR接受來自上游的信息，如細胞外生長因子，細胞外營養(yǎng)素等的刺激;另一方面，mTOR將信息進一步傳遞給下游，影響細胞周期的進展，導(dǎo)致細胞分化。作為細胞通路的樞紐，mTOR上呈PI3K/AKt通路及TSC1/2通路的信號傳遞及調(diào)節(jié)，并與FAK通路存在交叉對話，下啟p-s6k70、S6及eIF4和4E-BP1的表達，進而影響細胞的增殖、分化。

目前，比較普遍的認為mTOR信號通路主要由4種影響因子而活化，即生長因子與胰島素、營養(yǎng)因素(如氨基酸)、能量(如ATP/ADP)及環(huán)境壓力(如缺氧)。胰島素和多種生長因子的信號刺激可通過細胞表面受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)，經(jīng)PI3K[12-13]與Ras[13-14]進行傳導(dǎo)。PI3K活化后進一步激活下游的Akt，當Akt被徹底激活后，一方面其可以使mTOR的絲氨酸2448位點直接磷酸化，另一方面，其可以阻斷結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)和TSC1所構(gòu)成的復(fù)合體，通過這兩種方式，使mTOR得以激活[15]。激活的mTOR則可以磷酸化包括P70-S6K和4E-BP1在內(nèi)的下游分子。核糖體蛋白P70-S6K的磷酸化，不僅增強了一些與編碼核糖體蛋白和翻譯調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)的mRNA的翻譯功能，而且使細胞周期素(cyclin)、細胞周期依賴性蛋白激酶4(CDK4)等細胞周期主要蛋白的表達增加，細胞周期循環(huán)加快，致使細胞周期向G1期發(fā)展，促進細胞的增殖和分化，從而促使前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。4E-BP1和真核細胞翻譯始動因子4E(eIF-4E)形成復(fù)合體來抑制相關(guān)蛋白的表達。當4E-BP1被mTOR磷酸化后，4E-BPI則擺脫了eIF-4E的束縛作用，致使4E-BPI對蛋白表達的抑制作用得以解除，卻增加了如細胞周期蛋白D1, Rb蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子-lα, VEGF等促進細胞生長蛋白的表達，使細胞周期從G1期向S期進展，使細胞存活[16]。

去勢抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer，CRPC)的發(fā)生、發(fā)展與PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常關(guān)系密切，雄激素非依賴性前列腺癌細胞表達大量活化的PI3K和Akt[17]，而PI3K和Akt的活化，又可經(jīng)過磷酸化作用調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、細胞周期的運行及腫瘤血管的形成，從而加快了雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。另有研究表明，前列腺癌Gleason評分越高，p-Akt蛋白表達水平越高[18]，且p-Akt表達的上調(diào)可促進前列腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[19]。有報告稱[20]42%的原發(fā)性前列腺癌和100%的轉(zhuǎn)移性前列腺癌中PI3K/Akt/mTOR信號通路各組分，發(fā)生突變、表達改變及拷貝數(shù)的改變。

雄激素受體(AR)蛋白的正確翻譯、穩(wěn)定性的維護及轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)可被Akt信號通路正性或者負性調(diào)控，另一方面，AR能夠經(jīng)過基因轉(zhuǎn)錄途徑/非轉(zhuǎn)錄基因途徑抑制/激活A(yù)kt信號通路[21]。因此，雄激素與AR的相互作用及AR與PI3K/Akt信號通路的互相作用，可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其向CRPC進展中發(fā)揮了至關(guān)重要作用。

FAK除調(diào)控細胞生長、遷移外,還與動物的生長發(fā)育密切相關(guān)。當FAK接收來自整合素、纖連蛋白(fibronectin, FN)等的信號刺激被激活后,與Src形成復(fù)合體,其Y397可通過PI3IC的SH2結(jié)構(gòu)域直接與之結(jié)合,進而激活PI3K-Akt通路。PI3K-Akt的活化可通過TSC2-mTOR途徑調(diào)節(jié)細胞生長、基因表達[22],也可參與Rac-JNK通路而調(diào)節(jié)基因表達[23]。FAK可通過PI3K/Akt途徑調(diào)控TSC2/mT0R的活性，Gan等[22]通過細胞內(nèi)共表達和免疫共沉淀技術(shù)證明了這種可能,即FAK與TSC2(Tuberin)可以形成蛋白多聚體,進而通過mTOR信號通路激活S6K1,促進細胞生長。

本研究發(fā)現(xiàn)，SENL能夠顯著抑制mTOR及其下游關(guān)鍵靶點蛋白的表達及活化。國外學(xué)者的研究[24]證實在前列腺癌細胞系PC-3及LNCaP-luc2中，印楝提取物能夠抑制PI3K的表達以及Akt的激活。本研究中發(fā)現(xiàn)與mTOR的上游PI3K/Akt通路存在交叉對話的FAK/integrin通路，受到SENL顯著的抑制；SENL可以顯著抑制雄激素受體AR的表達及磷酸化。由此說明，SENL通過抑制mTOR及其周圍路徑的關(guān)鍵分子的表達及活化，發(fā)揮抗前列腺癌的作用，特別對于晚期前列腺癌的作用，作用顯著。

[1] 黃彥珺,杜鵑,張華楨,等.印度楝藥用價值研究進展[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,27(S1)： 358-363.

[2] Hao F, Kumar S, Yadav N, et al. Neem components as potential agents for cancer prevention and treatment[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1846(1)： 247-257.

[3] Paul R, Prasad M, Sah NK. Anticancer biology of Azadirachta indica L (neem)： a mini review[J]. Cancer Biol Ther, 2011,12(6)： 467-476.

[4] Bose A, Chakraborty K, Sarkar K, et al. Neem leaf glycoprotein directs T-bet-associated type 1 immune commitment[J]. Hum Immunol, 2009,70(1)： 6- 15.

[5] Sarkar K, Bose A, Haque E, et al. Induction of type 1 cytokines during neem leaf glycoprotein assisted carcinoembryonic antigen vaccination is associated with nitric oxide production[J]. Int Immunopharmacol, 2009,9(6)： 753-760.

[6] Manikandan P, Anandan R, Nagini S. Evaluation of Azadirachta indica leaf fractions for in vitro antioxidant potential and protective effects against H2O2-induced oxidative damage to pBR322 DNA and red blood cells[J]. J Agric Food Chem, 2009,57(15)： 6990-6996.

[7] Anyaehie UB. Medicinal properties of fractionated acetone/water neem [Azadirachta indica] leaf extract from Nigeria： a review[J]. Niger J Physiol Sci, 2009,24(2)： 157-159.

[8] Priyadarsini RV, Manikandan P, Kumar GH, et al. The neem limonoids azadirachtin and nimbolide inhibit hamster cheek pouch carcinogenesis by modulating xenobiotic-metabolizing enzymes, DNA damage, antioxidants, invasion and angiogenesis[J]. Free Radic Res, 2009,43(5)： 492-504.

[9] Brown EJ, Albers MW, Shin TB, et al. A mammalian protein targeted by G1-arresting rapamycin-receptor complex[J]. Nature, 1994,369(6483)： 756-758.

[12] Hay N, Sonenberg N. Upstream and downstream of mTOR[J]. Genes Dev, 2004，18(16)： 1926-1945.

[13] Harrington LS, Findlay GM, Lamb RF. Restraining PI3K： mTOR signalling goes back to the membrane[J]. Trends Biochem Sci, 2005,30(1)： 35-42.

[14] Ma L, Chen Z, Erdjument-Bromage H, et al. Phosphorylation and functional inactivation of TSC2 by Erk implications for tuberous sclerosis and cancer pathogenesis[J]. Cell, 2005,121(2)： 179-193.

[15] Huang S, Houghton PJ.Targeting mTOR signaling for cancer therapy[J]. Curr Opin Pharmacol, 2003,3(4)： 371-377.

[16] Guertin DA, Sabatini DM. Defining the role of mTOR in cancer[J]. Cancer Cell, 2007,12(1)： 9-22.

[17] Guertin DA, Sabatini DM. An expanding role for mTOR in cancer[J]. Trends Mol Med, 2005,11(8)： 353-561.

[18] Kremer CL, Klein RR, Mendelson J, et al. Expression of mTOR signaling pathway markers in prostate cancer progression[J]. Prostate, 2006,66(11)： 1203-1212.

[19] Murakami D, Tsujitani S, Osaki T, et al. Expression of phosphorylated Akt (pAkt) in gastric carcinoma predicts prognosis and efficacy of chemotherapy[J]. Gastric Cancer, 2007,10(1)： 45-51.

[20] Taylor BS, Schultz N, Hieronymus H, et al. Integrative genomic profiling of human prostate cancer[J]. Cancer Cell, 2010,18(1)： 11-22.

[21] 于殿君,孫曉文,施云峰,等.前列腺癌雄激素受體和PI3K/Akt信號通路相互作用研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2011，(1)： 180-183.

[22] Gan B, Yoo Y, Guan JL, et al. Association of focal adhesion kinase with tuberous sclerosis complex 2 in the regulation of s6 kinase activation and cell growth[J]. J Biol Chem, 2006,281(49)： 37321-37329.

[23] Teutschbein J, Schartl M, Meierjohann S, et al. Interaction of Xiphophorus and murine Fyn with focal adhesion kinase[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2009,149(2)： 168-174.

[24] Gunadharini DN, Elumalai P, Arunkumar R, et al. Induction of apoptosis and inhibition of PI3K/Akt pathway in PC-3 and LNCaP prostate cancer cells by ethanolic neem leaf extract[J]. J Ethnopharmacol, 2011,134(3)： 644-650.

SENL inhibits prostate carcinoma cells via mTOR pathway

WUQiang，GUIYa-ping，YUANTao，BIANCui-dong，WUDeng-long

(Dept. of Urology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the effects of supercritical extract ofAzadirachtaIndica(neem) leaves (SENL) on proliferation of prostate cancer cells and its mechanism. Methods Supercritical extract of fresh neem leaves was prepared using the Speed SFE-2 System. Androgen dependent prostate adenocarcinoma LNCaP-luc2-cells and androgen independent PC3 cells were treated with different concentrations of SENL(25,20,12.5,10,6.25,5，0mg/ml) for 24 hours. Proliferation of LNCap-luc2 and PC3 cells were determined by MTS-formazan reduction method. LNCaP-luc2 and PC3 cells were treated with IC50concentrations of SENL (12 or 15mg/ml, respectively) and stained with annexin-V FITC and propidium iodide (PI), then analyzed by flow-cytometry. The expressions of mTOR, s6K70, integrin， FAK, androgen receptor were dected by Western blotting. LNCaP-luc2 and PC3 cells were stained with immunofluorescence and observed under confocal microscope. Results SENL exhibited growth of LNCaP-luc2 and PC3 cell in a dose-dependent manner. SENL induces apoptosis of LNCaP-luc2 and PC3 cells. Western blotting analysis showed that the levels of mTOR, S6K70,androgen receptor, integrin β1 and phosphorylation of mTOR, S6K70, FAK were reduced with SENL treatment. Immunofluorescence for integrin β1 and FAK further demonstrated the suppression of formation of the focal adhesions in LNCaP-luc2 and PC3 cells after SENL treatment. Conclusion Supercritical extract ofAzadirachtaIndica(Neem) leaves can inhibit proliferation and induce apoptosis of prostate cancer cellsinvitro, in which mTOR pathway may be involved.

SENL; mTOR; prostate cancer

10.16118/j.1008-0392.2016.04.009

2015-11-16

吳 強(1978—)，男，主治醫(yī)師，碩士.E-mail: wuqiang@#edu.cn

R 737.25

A

1008-0392(2016)04-0040-06