陽春砂基于轉(zhuǎn)錄組的萜類合酶基因挖掘及一個單萜合酶基因的克隆

鄧可，楊錦芬，王騰，王虹，王煥，蘇金鋒，詹若挺

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東廣州　510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州　510006）

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陽春砂基于轉(zhuǎn)錄組的萜類合酶基因挖掘及一個單萜合酶基因的克隆

鄧可1，楊錦芬1，王騰1，王虹1，王煥1，蘇金鋒2，詹若挺1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】深入挖掘陽春砂轉(zhuǎn)錄組中揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因，為全面認(rèn)識陽春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑和分子調(diào)控模式奠定基礎(chǔ)。【方法】整理前期工作獲得的陽春砂2個轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，篩選已注釋的及利用本地blast方法再注釋的萜類合成途徑的unigene；并通過對部分候選unigene的表達(dá)量與揮發(fā)性萜類化合物含量的相關(guān)性分析及生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步篩選出相關(guān)基因；采用PCR及重組載體構(gòu)建的方法克隆其中一個單萜合酶基因，并對其編碼蛋白序列進(jìn)行分析。【結(jié)果】篩選得到10個揮發(fā)性萜類合成上游途徑相關(guān)unigene及11個下游萜類合酶基因；相關(guān)性分析證明候選基因與陽春砂主要揮發(fā)性萜類有較強(qiáng)相關(guān)性；并成功克隆得到AvTPS1基因，其序列包含1 803 bp的開放閱讀框，編碼600個氨基酸；其編碼蛋白含有單萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W和NSE/DTE等保守基序，N端含有一段葉綠體轉(zhuǎn)運肽；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明AvTPS1屬于TPS-b亞家族?！窘Y(jié)論】結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜數(shù)據(jù)的深入挖掘和與揮發(fā)性萜類化合物數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，有效篩選出了陽春砂多個值得后續(xù)研究的萜類合酶基因；其中對AvTPS1的克隆及生物信息學(xué)分析為后續(xù)功能鑒定提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：陽春砂；轉(zhuǎn)錄組；萜類合酶基因；基因克隆

砂仁是芳香化濕類中藥，也是我國“四大南藥”之一，其性溫，味辛，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效［1］。陽春砂Amomum villosum Lour.是砂仁的主流品種，廣東陽春所產(chǎn)的道地藥材陽春砂品質(zhì)最佳［2-3］。揮發(fā)油是陽春砂芳香化濕、行氣止痛的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。道地藥材陽春砂果實揮發(fā)油中含有豐富的揮發(fā)性萜類，主要由單萜、倍半萜及其衍生物組成，如乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦、芳樟醇和雙環(huán)大根香葉烯等，其中乙酸龍腦酯含量最高，具有顯著的藥理活性［4-7］。因此，揮發(fā)性萜類化合物在陽春砂藥效方面發(fā)揮著重要作用。

植物萜類的合成途徑主要分4個階段［8］：首先是異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）及其雙鍵異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸（dimethylally pyrophosphate，DMAPP）的合成。其合成途徑主要有2條，即細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑和質(zhì)體中的脫氧木酮糖-5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatepathway，DXP）途徑［9 -11］。IPP和DMAPP在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（isoprenyl transferases）作用下經(jīng)頭對尾或頭對頭融合形成不同長度的異戊二烯焦磷酸鏈。之后經(jīng)萜類合酶，也稱萜環(huán)化酶（terpenoid synthases/cyclases，TPS）催化環(huán)化和重排生成萜骨架。最后，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一些酶如P450單加氧酶等對萜骨架進(jìn)行羥基化、甲基化等修飾。最終萜類產(chǎn)物的種類、產(chǎn)量和比例都受到多個關(guān)鍵酶的調(diào)控。對陽春砂藥效成分揮發(fā)性萜類生物合成途徑及相關(guān)酶基因進(jìn)行研究，將為全面深入認(rèn)識陽春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑和分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本課題組前期已獲得2個陽春砂轉(zhuǎn)錄組及相應(yīng)多個表達(dá)譜［12-13］。本研究將通過各類生物信息學(xué)方法對轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，初步篩選出部分陽春砂揮發(fā)性萜類代謝途徑相關(guān)基因；并通過關(guān)聯(lián)陽春砂基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和對應(yīng)樣品揮發(fā)性萜類含量變化數(shù)據(jù)，更全面地發(fā)掘萜類合酶基因。另一方面，也對篩選所得的其中1個萜類合酶基因進(jìn)行克隆，并分析其編碼蛋白序列，為進(jìn)一步的基因功能鑒定和應(yīng)用于陽春砂揮發(fā)性萜類代謝工程的研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1植物材料所用陽春砂材料種植于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)時珍山，移栽自廣東陽春，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)楊錦芬研究員鑒定為陽春砂Aomomum villosum Lour.。

1.2主要試劑植物RNA提取試劑盒購自艾德萊生物有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒及pLB平末端克隆載體購自天根生化科技有限公司；高保真PrimeSTAR酶、ExTaq酶和其他PCR所需試劑、電泳所需Marker、感受態(tài)細(xì)胞及純化回收試劑盒均購自大連寶生物有限公司；引物合成和基因測序由廣州華大基因有限公司完成。

1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析本課題組前期已獲得陽春砂果實發(fā)育不同時期的轉(zhuǎn)錄組（命名為AvD）和茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組（AvM）數(shù)據(jù)，統(tǒng)計KEGG注釋數(shù)據(jù)中揮發(fā)性萜類相關(guān)通路的unigene并篩選代表基因（基因長度≥700 bp，表達(dá)量較高）。結(jié)合陽春砂中含有的主要揮發(fā)性萜類成分相關(guān)的生物合成途徑中的酶基因，在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中查找并下載其他物種中已鑒定的揮發(fā)性萜類合酶氨基酸序列，作為探針序列，通過本地BLAST軟件blast-2.2.30+在2個陽春砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行blastp比對，對unigene進(jìn)行再注釋，以相似度≥40%、比對長度≥100、比對分?jǐn)?shù)≥100、基因長度≥1 000 bp為條件篩選出候選unigene。利用本地BLAST軟件進(jìn)行blastn比對，關(guān)聯(lián)2個轉(zhuǎn)錄組間的unigene。

1.4相關(guān)性分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件的Pearson算法對課題組前期獲得的MeJA誘導(dǎo)實驗中陽春砂揮發(fā)性萜類含量數(shù)據(jù)［13］及轉(zhuǎn)錄組AvM中候選基因的表達(dá)量進(jìn)行雙變量線性相關(guān)系數(shù)計算；所得相關(guān)系數(shù)利用R語言軟件包中的pheatmap軟件繪制熱圖，熱圖繪制由廣州基迪奧生物科技有限公司協(xié)助完成。

1.5AvTPS1的克隆陽春砂葉片總RNA的提取參照艾德萊EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。取1 μg總RNA按照天根cDNA第1鏈合成說明書進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取候選AvTPS1核酸序列，根據(jù)ORFfinder預(yù)測所得開放閱讀框，使用Primer Premier 5軟件在5’端與3’端非編碼區(qū)設(shè)計引物AvF1：5’-TT TTATCCCACATTTCAC-3’與AvR1：5’-GCTCCATG TAGATAGATTATC-3’，使用高保真PrimeSTAR酶通過2輪PCR從陽春砂cDNA中克隆基因編碼區(qū)全長。PCR第1輪反應(yīng)程序為：95℃變性10 s，53.5℃退火15 s，72℃延伸10 s，35個循環(huán)；取第1輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2輪擴(kuò)大PCR：95℃變性10 s，53.5℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個循環(huán)，72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化后連接到pLB平末端克隆載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，進(jìn)行抗性篩選，挑取陽性克隆單菌落用于檢測和測序。

1.6生物信息學(xué)分析運用在線工具ORFfinder進(jìn)行ORF預(yù)測；使用NCBI在線工具進(jìn)行blastp比對查找并下載同源相似性較高的相似序列信息；使用本地軟件ClustalX 2.1進(jìn)行多序列比對；利用Mega 5.1軟件的Neighbor-Joining算法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。使用在線工具ProtParam對蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測；ChloroP 1.1 Server和TargetP 1.1 Server進(jìn)行亞細(xì)胞定位；ProtScale的Kyte & Doolittle算法進(jìn)行親疏水性分析。使用SWISS-MODEL Workspace在線數(shù)據(jù)庫對編碼蛋白進(jìn)行同源建模。

2　結(jié)果與分析

2.1陽春砂揮發(fā)性萜類合成上游途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄組分析DXP途徑和MVA途徑中的關(guān)鍵酶——1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS）、1-去氧-D-木酮糖-5 -磷酸還原異構(gòu)酶（1 -deoxy -D -xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR），以及異戊烯基轉(zhuǎn)移酶中催化合成香葉基焦磷酸（GPP）與法呢基二磷酸（FPP）的香葉基二磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）和法呢基二磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PPS）是本研究重點關(guān)注的萜類合成上游途徑關(guān)鍵酶。萜類相關(guān)的unigene在經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組AvM中較未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組AvD中得到更多的注釋［13］，因此對該部分轉(zhuǎn)錄組AvM的數(shù)據(jù)進(jìn)行重點展示。揮發(fā)性萜類合成上游途徑在KEGG數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)到萜類骨架生物合成途徑（terpenoid backbone biosynthesis，ko00900），該通路共注釋21個酶基因共160個unigene；其中注釋到7個HMGR，10 個DXR，30個DXS，3個GPPS和1個FPPS unigene。本研究對篩選長度最長、表達(dá)量較高的10個unigene進(jìn)行展示并重命名，結(jié)果見表1。

其中，本研究中篩選得到的AvHMGR1、AvDXR1 和AvDXS1（Unigene0057019、Unigene0056545和Unigene0077967），與課題組前期通過同源克隆3個關(guān)鍵基因AvHMGR（FJ455511.1）、AvDXR （FJ459894.1）和AvDXS（FJ455512.1）［14-17］，序列相似度分別達(dá)到99.95%、99.88%和99.57%；推測這3個unigene即對應(yīng)前期克隆所得的上述3個關(guān)鍵基因。從2個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推測，陽春砂基因組中有多個HMGR、DXR和DXS基因，尤其是DXS，在轉(zhuǎn)錄組AvD中注釋到60個unigene［12］，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)的AvDXS在多種器官中的高表達(dá)量［15］，更可確認(rèn)其具有看家基因的特性。

2.2陽春砂揮發(fā)性萜類合酶基因的轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1已注釋揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因的整理萜類合酶基因（TPS）為揮發(fā)性萜類合成下游途徑的關(guān)鍵酶基因，對應(yīng)到KEGG數(shù)據(jù)庫中的單萜生物合成途徑（monoterpenoid biosynthesis，ko00902）及倍半萜生物合成途徑（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis，ko00909）2個通路中。其中轉(zhuǎn)錄組AvD僅在單萜通路中注釋到1個unigene，而經(jīng)MeJA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組AvM在單萜合成通路中共注釋3個單萜合酶基因（12個unigene），在倍半萜及三萜生物合成途徑中注釋到2個三萜合酶基因（13個unigene），但并未注釋到倍半萜合成相關(guān)酶基因，故不在本文中贅述。綜合2個陽春砂轉(zhuǎn)錄組，被直接注釋到的3個單萜酶基因分別是月桂烯/羅勒烯合酶（myrcene/ocimene synthase，MS/OS，下簡稱MS）、芳樟醇合酶［（3S）-linalool synthase，LIS］和新薄荷醇脫氫酶［（+）-neomenthol dehydrogenase，NDS］基因，其中LIS與NDS為轉(zhuǎn)錄組AvM中首次被注釋到的單萜合酶基因；篩選得長度最長、表達(dá)量較高的10個unigene，結(jié)果表2。

表1　已注釋的陽春砂萜類骨架合成通路候選基因整理Table 1 Data of the annotated candidate genes involved in terpenoid backbone biosynthesis pathway of A.villosum

表2　已注釋的陽春砂單萜合成通路候選基因整理Table 2 Data of the annotated candidate genes involed in monoterpenoid biosynthesis pathway of A.villosum

2.2.2本地blast再注釋揮發(fā)性萜類合酶相關(guān)基因的整理根據(jù)本課題組對陽春砂果實揮發(fā)性萜類的測定結(jié)果［13］，陽春砂種子團(tuán)及果皮中含量較高的單萜有乙酸龍腦酯、樟腦、龍腦、芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、月桂烯和松油醇等；倍半萜類則以雙環(huán)大根香葉烯為主。其中芳樟醇及月桂烯合酶相關(guān)基因已被注釋（表2），本部分主要關(guān)注其他7個化合物對應(yīng)的合酶基因，包括龍腦基二磷酸合酶［（+）-bornyl diphosphate synthase，BDS］、β-蒎烯合酶［（-）-beta-pinene synthase，BPS］、α-蒎烯合酶［（-）-alpha-pinene synthase，APS］、松油烯合酶（1，8-cineole synthase，TPS-Cin）和雙環(huán)大根香葉烯合酶（bicyclogermacrene synthase，BGS）5個合酶基因。從NCBI下載上述基因序列（具體序列信息詳見表3），以這些序列作為探針，在轉(zhuǎn)錄組AvD 和AvM中進(jìn)行本地blast再注釋，篩選出5個合酶（包括4個單萜合酶及1個倍半萜合酶）基因共17 個unigene，轉(zhuǎn)錄組信息及比對結(jié)果如表4所示。

2.2.3候選AvTPS的確定將2.2.1和2.2.2所得的來源于不同轉(zhuǎn)錄組卻被同一單萜合酶基因注釋上的unigene進(jìn)行blastn關(guān)聯(lián)比對，部分來自于不同轉(zhuǎn)錄組被注釋的unigene具有極高的相似度，當(dāng)相似度達(dá)到99%以上、比對分?jǐn)?shù)大于1 000時，認(rèn)為這些來源于不同轉(zhuǎn)錄組的相似unigene對應(yīng)陽春砂中的同一基因（表4）。綜合上述結(jié)果，對篩選到的揮發(fā)性萜類合酶下游基因（AvTPS）進(jìn)行重命名，確定其代表unigene（表5），以測序長度較長的轉(zhuǎn)錄組AvDunigene作為AvTPS的核酸序列參考，以檢測部位及組別較多的轉(zhuǎn)錄組AvMunigene作為AvTPS的表達(dá)量參考以供后續(xù)分析使用。

表3　陽春砂主要成分相關(guān)酶序列下載信息Table 3 Information of enzymes related to main volatile terpenes in A.villosum

表4　再注釋的陽春砂揮發(fā)性萜類合酶候選基因整理Table 4 Data of the reannotated candidate genes of volatile terpene synthase of A.villosum

2.3候選基因表達(dá)量與主要揮發(fā)性萜類含量相關(guān)性分析提取上述2.1和2.2篩選所得春砂的主要揮發(fā)性萜類成分含量進(jìn)行相關(guān)分析，計算得到的Pearson相關(guān)系數(shù)如圖1所示，其中AvTPS3和AvTPS4的代表unigene由于在考察組別均未能測得表達(dá)量，故不參與分析。圖1結(jié)果顯示：大部分陽春砂候選基因與除了α-蒎烯外的陽春砂主要揮發(fā)性萜類均表現(xiàn)出相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.6的較強(qiáng)相關(guān)性，表明篩選得到的這些陽春砂候選基因有較大可能參與揮發(fā)性萜類的合成過程。

圖1顯示：基因表達(dá)量與化合物含量的相關(guān)模式大體分為2種：第1種是與芳樟醇、β-蒎烯等陽春砂果皮中主要成分正相關(guān)，與乙酸龍腦酯、樟腦、雙環(huán)大根香葉烯等種子團(tuán)中的主要成分［13］負(fù)相關(guān)；第2種則與種子團(tuán)中成分正相關(guān)，與果皮主要成分負(fù)相關(guān)。在上游候選基因的相關(guān)分析中（圖1-a），與單萜合成直接相關(guān)的DXP途徑的關(guān)鍵基因AvDXR和AvDXS基本與陽春砂果皮中的主要成分正相關(guān)，而與種子團(tuán)中主要成分負(fù)相關(guān)；而AvDXS1則與MVA途徑的關(guān)鍵基因AvHMGR一樣呈現(xiàn)第2種相關(guān)模式；不僅印證了陽春砂內(nèi)含有多個DXS基因的猜想，同時體現(xiàn)出，這2個途徑在陽春砂果實不同部位中參與不同有效成分的合成。而在TPS候選基因的相關(guān)性分析（圖1-b）顯示：不同的AvTPS基因呈現(xiàn)出不一樣的相關(guān)模式，如果根據(jù)相關(guān)模式劃分，則相同模式的AvTPS5與AvTPS9、或AvTPS6與AvTPS11可能含有相似功能。

表5　AvTPS的命名與代表unigene的確定Table 5 AvTPS name and the candidate unigenes data

圖1　候選基因表達(dá)量與主要揮發(fā)性萜類含量相關(guān)系數(shù)熱圖Figure 1 Heat map of the correlation coefficient of candidate unigenes expression levels and main volatile terpene contents

2.4AvTPS1克隆及編碼蛋白序列分析根據(jù)AvTPS1（轉(zhuǎn)錄組Unigene0137026）的核苷酸序列設(shè)計引物，以陽春砂葉片cDNA為模板，克隆AvTPS1含全長ORF DNA片段；測序結(jié)果顯示：克隆所得的AvTPS1全長cDNA共1 881 bp，開放閱讀框為1 803 bp，編碼600個氨基酸，所得氨基酸序列與Unigene0137026的預(yù)測氨基酸序列一致。

AvTPS1編碼蛋白（以下簡稱AvTPS1）預(yù)測分子量為68.92 kDa，等電點為5.56，分子式為C3086H4776N840O914S21，與已有的TPS蛋白序列性質(zhì)相似。經(jīng)ChloroP及TargetP預(yù)測，AvTPS1編碼蛋白N端含有一段葉綠體轉(zhuǎn)運信號肽，信號肽的剪切位點在42號位；而AvTPS1多肽鏈中親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，預(yù)測該蛋白屬于親水性蛋白。利用SWISS-MODEL Workspace對AvTPS1進(jìn)行同源建模，與來源于留蘭香（Menthaspicata）的4S-檸檬烯合酶［20］及來源于鼠尾草（Salvia officinalis）的（+）-龍腦基二磷酸合酶［21］同源相似性分別為41.26%及42.96%，具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)與功能區(qū)。

取AvTPS1序列進(jìn)行NCBI blastp比對，比對上大量單萜或倍半萜合酶基因，其中與姜花葉綠體單萜合酶基因同源相似度最高，達(dá)到87%；選取相似度大于50%的序列進(jìn)行多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)AvTPS1氨基酸序列中含有多個已知萜類合酶序列的保守模體（conserved motifs），如RRX8W、RXR、DDXXD和NSE/DTE［即（N，D）D（l，I，V）X（S，T）XXXE］，如圖2所示。其中，天冬氨酸富集區(qū)DDXXD和NSE/DTE這2個保守區(qū)，通過與金屬離子（如Mg2+和Mn2+）的絡(luò)合來結(jié)合催化底物（GPP等），是單萜、倍半萜以及二萜合成酶所屬的離子化依賴的萜類合酶共有的功能結(jié)構(gòu)域［22-23］；精氨酸保守區(qū)RRX8W能通過異構(gòu)作用間接催化生成環(huán)狀萜類［20］；而RXR區(qū)域則可能參與萜品烯的催化反應(yīng)［24］。這些保守模體的分析，更提示AvTPS1極有可能參與揮發(fā)性萜類的合成。

圖2　AvTPS1相似序列比對及功能結(jié)構(gòu)域展示Figure 2 Similar sequence alignment and functional domain of AvTPS1

將AvTPS1與已發(fā)表的植物萜類合酶氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。圖3中涉及的TPS亞家族的劃分參照Chen等［25］在2011年劃分的新標(biāo)準(zhǔn)，分為TPS-a～TPS-h 7個亞家族，其中TPS-h亞家族未在圖中展示。圖3顯示：單萜及倍半萜合酶多集中于TPS-b、a、g和d 4個亞家族；而AvTPS1所在的TPS-b亞家族不僅是被子植物中顯花植物特有的家族，也是單萜合酶基因特有的亞家族，該家族的單萜合酶主要用于催化環(huán)狀單萜的合成［18，25］。

圖3　AvTPS1與其他已知萜類合酶（TPS）的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 3 Phylogenetic analysis of AvTPS1 and other known terpene synthases

3　討論

本研究對陽春砂轉(zhuǎn)錄組中陽春砂揮發(fā)性萜類合成途徑相關(guān)基因進(jìn)行了深入挖掘，對已注釋到的揮發(fā)性萜類合成相關(guān)KEGG通路中的unigene進(jìn)行了提取和篩選，共獲得10個上游途徑候選unigene 和11個下游途徑合酶候選unigene，對已注釋基因的挖掘是目前在無參轉(zhuǎn)錄組中尋找目的基因的最常用方法［26］。但在陽春砂轉(zhuǎn)錄組中，僅被注釋上3個下游的單萜合酶基因，同時還存在大量的未注釋基因，這些未被注釋的unigene可能包含陽春砂中特異表達(dá)的功能基因［27］。所以利用本地blast反向比對的方法對陽春砂轉(zhuǎn)錄組中的基因進(jìn)行再注釋，得到多個萜類合酶相關(guān)的17個再注釋unigene，后續(xù)的相關(guān)性分析和生物信息學(xué)分析也證明了這些unigene與萜類合成相關(guān)，從而驗證了該方法的有效性。

在進(jìn)行本地blast再注釋的過程中發(fā)現(xiàn)，不同的探針序列會對相同的unigene進(jìn)行注釋，如表4 中Unigene0137026、Unigene0107445等unigene能同時被BDS、BPS、TPS-cin注釋上。推測原因有二：①是由于TPS酶和底物多樣性的特點［28］，很多萜類合酶能催化生成多種產(chǎn)物，如從鼠尾草中分離的龍腦基二磷酸合酶，除了生成（+）-龍腦基焦磷酸外，還能生成大量的（+）-α-蒎烯，（+）-莰烯和（±）-檸檬烯，同時具有龍腦二磷酸合酶和蒎烯合酶的功能［29］。②被子植物TPS的系統(tǒng)發(fā)育和譜系分化與植物自然分類系統(tǒng)聯(lián)系更密切，相同物種來源的TPS相似性遠(yuǎn)高于功能相同而來源不同的TPS，所以基于序列相似性的查找僅可以判斷其是否萜類合酶，卻不能預(yù)測其產(chǎn)物［18-19］，需要進(jìn)一步實驗功能驗證。萜類合酶基因在植物中多以基因家族的形式存在［30］，所以在unigene間關(guān)聯(lián)比對時，發(fā)現(xiàn)篩選得到的候選基因中存在不少序列相似的unigene，這些unigene可能是一個基因家族中的不同成員，是同一萜類合酶的不同剪接，在陽春砂中行使相似的功能。

本研究中無論是基因表達(dá)量與揮發(fā)性萜類含量的相關(guān)性分析，還是對克隆基因AvTPS1的生物信息學(xué)分析，均只是功能預(yù)測；但基因表達(dá)與化合物的生成中間還要經(jīng)過蛋白、激素等多方面調(diào)控，并非簡單的線性相關(guān)關(guān)系，還須對候選基因進(jìn)行基于原核或真核的表達(dá)功能的功能鑒定。本課題組后續(xù)將克隆本研究篩選到的其他AvTPS，并通過基于原核和真核表達(dá)系統(tǒng)的功能鑒定，進(jìn)一步確認(rèn)AvTPS的催化功能及其在揮發(fā)性萜類合成過程中的作用。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Mining of Genes Involved in Terpenoid Synthases Based on Transcriptome Analysis and Cloning of Monoterpene Synthase from Amomum villosum Lour.

DENG Ke1，YANG Jinfen1，WANG Teng1，WANG Hong1，WANG Huan1，SU Jinfeng2，ZHAN Ruoting1
（1.Research Center of Chinese Medicinal Resource Science and Engineering，Ministry of Education Key Laboratory of Chinese Medicinal Resources from Lingnan，Joint Laboratory of National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To dig out the related volatile terpene synthase genes from transcriptome of Amomum villosum Lour.，so as to lay the foundation for comprehensive understanding of volatile terpenoid biosynthesispathway and molecular regulation mode.Methods Based on the obtained results of the two transcriptome of Amomum villosum Lour.，we screened out the unigenes involved in volatile terpenoid biosynthesis pathway which had been annotated or was reannotated by blast method.After analyzing the correlation of the expression of partial candidate unigenes with the contents of volatile terpenoids and their bioinformatics，we selected out the relative unigenes.One monoterpene synthase gene of them was cloned by polymerase chain reaction（PCR）and recombinant vector construction methods，and then the protein coding sequences of the monoterpene synthase gene were analyzed.Results Ten candidate terpenoid biosynthesis upstream pathway unigenes and 11 candidate downstream pathway genes were obtained from the transcriptome of Amomum villosum Lour..The data proved that the expression of the candidate genes had a strong relationship with main volatile terpenes of Amomum villosum Lour..AvTPS1 had been cloned successfully，which contained 1 803 bp open reading frame（ORF），encoding 600 amino acids.The encoded protein of AvTPS1 contained the specific conservative sequences DDXXD，RRX8W and NSE/DTE which were special for terpene synthase protein，and N-terminal of the encoded protein had a chloroplast transit peptide.Phylogenetic analysis showed that AvTPS1 belonged to the subfamily of TPS-b terpene synthase.Conclusion Based on the results of transcriptome and gene expression profile of Amomum villosum Lour.，and on the correlation of gene expression profile with the content of volatile terpenoids，we found out several valuable candidate terpene synthases genes from Amomum villosum Lour..And the analysis results of clone and bioinformatics of AvTPS1 will supply evidence for the future study of gene function characterization.

Key words：Amomum villosum Lour.；transcriptome；terpene synthases gene；gene clone

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0395 - 09

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03.026

收稿日期：2015-12-21

作者簡介：鄧可（1991-），女，碩士研究生；E-mail：745074686@qq.com

通訊作者：楊錦芬（1978-），女，研究員；E-mail：yangif@gzucm.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（編號：81303163）；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目（編號：Yq2013042）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)青年英才培養(yǎng)項目（編號：AAC414124A08）