家蠶V型ATP酶B亞基的克隆及表達特征

陳慧芳，王鑫，謝康，李懿，趙萍

西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶　400716

?

家蠶V型ATP酶B亞基的克隆及表達特征

陳慧芳，王鑫，謝康，李懿，趙萍

西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶400716

陳慧芳, 王鑫, 謝康, 等. 家蠶V型ATP酶B亞基的克隆及表達特征. 生物工程學報, 2016, 32(4): 487–496.

Chen HF, Wang X, Xie K, et al. Gene cloning and expression characteristics of vacuolar-type ATPase subunit B in Bombyx mori. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 487–496.

摘要:V型ATP酶 (Vacuolar-type ATPase) 是一種定位于細胞膜和細胞器膜上的氫離子轉運酶。它利用ATP水解的能量將氫離子轉運到液泡、囊泡或者胞外，從而維持細胞內正常的酸堿環(huán)境。V型ATP酶B亞基(V-ATPase B) 作為ATP的催化位點，也有著非常重要的作用。為了探討家蠶V-ATPase B (BmV-ATPase B) 的功能，首先從家蠶五齡幼蟲的中腸cDNA中克隆了BmV-ATPase B基因并構建原核表達載體進行原核表達，獲得了重組蛋白，經(jīng)質譜鑒定正確后，通過鎳柱親和層析的方法純化了該蛋白并制備了多克隆抗體；最后分析了該蛋白在家蠶絲腺中的表達特征并利用免疫熒光對其在絲腺中的表達位置進行了定位。結果顯示BmV-ATPase B基因序列全長1 473 bp，預測蛋白分子量55 kDa，預測等電點5.3。通過Western blotting對家蠶5齡第3天和上蔟第1天幼蟲絲腺的不同區(qū)段進行BmV-ATPase B蛋白的表達特征分析，發(fā)現(xiàn)在兩個時期該蛋白均在前部絲腺高量表達，而在中部絲腺和后部絲腺表達量相對較低。進一步對兩個時期絲腺的不同區(qū)段進行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白在兩個時期的前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺均定位于細胞層。利用激光共聚焦顯微鏡對該蛋白進行進一步的定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要在絲腺的細胞膜表達。研究結果明確了該蛋白在絲腺中的表達模式，為深入研究該蛋白在蠶絲纖維形成中的作用奠定了基礎。

關鍵詞:家蠶，V型ATP酶B亞基，基因克隆，原核表達，Western blotting，免疫熒光定位

Received: August 11, 2015; Accepted: January 19, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31472154).

國家自然科學基金 (No. 31472154) 資助。

蠶絲是一種具有優(yōu)良力學性能和穩(wěn)定的生物包容性的生物材料，因此受到許多人的關注。蠶絲纖維由絲膠和絲素兩部分組成，其中絲素是蠶絲纖維的重要組分，很大程度上決定了蠶絲纖維的性能。在絲纖維形成的過程中，絲素蛋白由溶膠狀逐漸轉變?yōu)槟z狀，這種轉化過程與家蠶絲素蛋白pH值的變化密切相關[1-4]。絲腺是蠶絲纖維的形成場所，所以，絲腺腔內pH值的變化對蠶絲纖維的形成有重要影響。2014年王鑫等通過對家蠶絲腺進行溴酚藍染色證明了從后部絲腺到前部絲腺是一個逐步酸化的過程[5]，這個酸化的過程必然與絲腺細胞中氫離子轉運蛋白相關。2013年，Yi等對家蠶前部絲腺進行了蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)V型ATP酶在前部絲腺大量表達[6]，之后Sylvie Breton等證明了V型ATP酶與細胞的酸化過程密切相關[7]。所以目前的觀點認為，家蠶前部絲腺的酸性環(huán)境是由V型ATP酶創(chuàng)造并維持的。

V型ATP酶將氫離子轉運到囊泡或者胞外，從而維持細胞內正常的酸堿環(huán)境[8]，它利用ATP水解的能量轉化為電化學勢能進而介導氫離子的跨膜轉運[9]。V型ATP酶由V0和V1兩個亞單位組成，在真核生物中，V1亞單位包括8種不同的亞基 (A-H)，V0亞單位包括a、c、c’、c’’、d、e亞基[9-11]。其中V0亞單位主要為氫離子提供通道[7]，也有研究發(fā)現(xiàn)V0亞單位作為一個胞內pH傳感器，控制胞吐和突觸傳遞[10]。此外，V0亞單位中的a亞基具有增強果蠅神經(jīng)元降解的能力[12]。V1亞單位主要負責分解ATP，其中B亞基是ATP的結合位點，為逆濃度梯度轉運氫離子提供能量[7]。近來有研究報道在感染了BmNPV病毒的家蠶細胞中過表達V型ATP酶C亞基，可以顯著抑制BmNPV病毒的增殖[8]。此外，家蠶V型ATP酶A亞基和B亞基(BmV-ATPase B) 可能參與BmNPV病毒與細胞膜的融合及核殼體的釋放[13]。對新鮮桑葉和人工飼料飼養(yǎng)的家蠶進行蛋白質組學分析比較，發(fā)現(xiàn)在人工飼料飼養(yǎng)的家蠶幼蟲脂肪體中有兩種酶上調表達，其中一種被鑒定為BmV-ATPase B，其主要參與能量代謝[14]。由此可見V型ATP酶在家蠶抵御病毒感染及能量代謝的過程中有不可或缺的作用，然而V型ATP酶對絲纖維形成的影響尚不清楚。

基于此，為了便于進一步探究V型ATP酶對家蠶絲纖維形成的影響，本研究以BmV-ATPase B基因為靶標，對其進行克隆，構建原核表達載體以表達重組蛋白并制備多克隆抗體。通過Western blotting和免疫熒光定位對該蛋白在家蠶不同時期絲腺中表達特征進行分析，為研究該蛋白在蠶絲纖維合成中發(fā)揮的功能奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑

家蠶品種大造由西南大學家蠶基因資源庫提供。待供試家蠶飼養(yǎng)至幼蟲期5齡第3天和上蔟第1天，分別于冰凍條件下取前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺，并迅速液氮冷凍，提取蛋白后置于–80 ℃冰箱保存。

DNA marker、限制性內切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、NdeⅠ、NotⅠ，pMD19-T-simple vector購自TaKaRa公司；pEASYTM-Blunt vector、低分子量蛋白質marker、預染蛋白質marker、HiFi Taq DNA聚合酶、宿主菌大腸桿菌Trans1-T1 和Trasetta (DE3) 購自北京全式金公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG) 及抗生素購自Sigma公司；PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物回收試劑盒購自Promega公司；櫻花冷凍切片包埋劑購自北京中杉金橋公司；p28表達載體 (pET28a改進) 由家蠶基因組生物學國家重點實驗室保存；引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成；α-tubulin是抗體購自碧云天公司的小鼠單克隆抗體，產(chǎn)品編號AT819；DAPI染色液購自碧云天公司，產(chǎn)品編號C1005；Cy3標記山羊抗兔抗體購自碧云天公司，產(chǎn)品編號ws/A0516。

1.2BmV-ATPase B基因的克隆

基于NCBI數(shù)據(jù)庫CDS全長序列，通過Primer 5.0軟件設計BmV-ATPase B (GenBank登錄號：NM_0011098358.1) 的引物，上下游引物分別命名為BmV-ATPase B-F、BmV-ATPase B-R，引物序列如表1所示。以家蠶5齡第3天幼蟲中腸的cDNA為模板，反應體系為50 Μl (10 × 緩沖液 5 μL，dNTPs 5 μL，Hifi Taq 1 μL，Bm-VATPase B-F 1 μL，BmV-ATPase B-R 1 μL，模板1 μL，ddH2O 36 μL)，進行PCR擴增。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，12 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離、切膠回收純化后，與pEASYTM-Blunt載體連接，轉化到大腸桿菌Trans1-T1菌株中，篩選陽性克隆。將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)，提取質粒，命名為pEASYTM-Blunt-BmV-ATPase B。–20 ℃保存質粒備用。

1.3重組表達質粒的構建

通過Primer 5.0軟件根據(jù)測序正確的全長CDS序列設計引物，并在引物兩端分別添加酶切位點。上下游引物分別命名為BmV-ATPase B-Fy、BmV-ATPase B-Ry，序列如表1所示。以pEASYTM-Blunt-BmV-ATPase B質粒為模板進行PCR擴增，反應條件如上。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離、切膠回收純化，將p28載體質粒與BmV-ATPase B的PCR膠回收產(chǎn)物通過NdeⅠ、NotⅠ雙酶切，進行切膠回收純化，連接后轉化，構建p28-BmV-ATPase B重組表達質粒，對重組質粒進行NdeⅠ、NotⅠ雙酶切驗證及測序驗證。

1.4BmV-ATPase B的原核表達、鑒定與純化

1.4.1BmV-ATPase B的原核表達

將測序驗證正確的p28-BmV-ATPase B表達載體轉化到大腸桿菌Transetta (DE3) 表達菌株中，篩選陽性克隆并接種到5 mL含卡那霉素、氯霉素的2×YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當菌液OD600值到達0.6時，分別用24 mg/mL的IPTG 在16 ℃誘導20 h、37 ℃誘導4 h，以p28空載體轉化的菌株作為陰性對照。收集菌體并用超聲波破碎儀破碎。破碎后的菌液于4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集上清，再用適量的結合緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.2% TritonX-100) 懸浮沉淀。用SDS-PAGE分析目的蛋白質的表達情況。

表1　本研究所用引物Table 1　Primers used in this study

1.4.2質譜鑒定

SDS-PAGE檢測后的蛋白凝膠通過考馬斯亮藍染色后挖取目的蛋白點，將凝膠切碎后經(jīng)過浸洗及冷凍干燥，提取蛋白上清液并保存；將收集保存的上清液通過真空冷凍干燥儀抽干，用ZipTipC18脫鹽。分析前，將抽干的樣品溶解在含有50%乙腈、0.1% TFA的溶液中，采用MALDI-TOF/TOF質譜鑒定方法對BmV-ATPaseB蛋白進行肽段圖譜鑒定。

1.4.3BmV-ATPase B蛋白的純化

以BmV-ATPase B蛋白表達量最高的培養(yǎng)條件即37 ℃誘導4 h條件下進行目的蛋白的大量誘導表達。收集菌液后用pH 8.0的結合緩沖液重懸沉淀、破碎，收集上清與沉淀，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。確定蛋白在沉淀中以包涵體的形式表達。將提取的包涵體蛋白用8 mol/L尿素溶液溶解過夜。4 ℃、12 000 r/min離心15 min后取上清。采用鎳柱親和層析方法純化目的蛋白質，分別用20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L、1 mol/L咪唑梯度洗脫，SDS-PAGE檢測純化后的效果。檢測后發(fā)現(xiàn)1 mol/L咪唑的洗脫液中蛋白較純，但蛋白總量不足，為了獲得大量較純蛋白，進一步采取切膠和電洗脫的方法進行純化，將100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L和1 mol/L咪唑的洗脫液混合后超濾，蛋白質樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將含目的條帶的凝膠切碎后置于透析袋中，用水平電泳槽正向洗脫8 h，再反向洗脫30 min。收集洗脫液，在pH 7.4的PBS (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4) 緩沖液中透析2 d，收集透析后溶液。分別用SDS-PAGE電泳和Bradford定量法檢測蛋白質的純度及濃度。

1.5多克隆抗體制備及Western blotting

將純化后的目的蛋白質樣品送南京鐘鼎生物有限公司制備多克隆抗體。通過Western blotting對家蠶5齡第3天及上蔟第1天絲腺不同區(qū)段BmV-ATPase B蛋白的表達情況進行檢測。Western blotting采用半干法轉印，即SDS-PAGE結束后，在電流1.3 A，電壓25 V條件下轉膜15 min；用含有5%脫脂奶粉的TBST (150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.05% Tween 20) 將膜封閉1 h；用BmV-ATPase B多克隆兔抗體按照1∶20 000比例的稀釋液孵育2 h，以α-tubulin抗體作為內參；TBST清洗膜后以HRP標記的羊抗兔IgG按照1∶40 000稀釋孵育2 h；再用TBST緩沖液清洗膜，最后用ECL顯色液顯色，置于CLINX化學曝光儀觀察掃描顯色結果。

1.6免疫熒光定位

取5齡第3天和上蔟第1天家蠶幼蟲的絲腺分段包埋冷凍，冷凍切片后用PBST (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，0.3% TritonX-100) 清洗10 min，再利用10%羊血清室溫封閉2 h；接著使用1∶1 000比例稀釋的一抗 (BmV-ATPase B抗體) 室溫孵育2 h；然后用PBST清洗3次，每次10 min；之后使用1∶1 000比例稀釋的二抗 (羊抗兔Cy3) 室溫孵育2 h；同樣使用PBST清洗3次，每次10 min；接著用10 mmol/L的PBS將DAPI染色液稀釋3倍，染色20 min；隨后使用PBST清洗10 min；滴抗熒光淬滅劑封片；最后利用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡進行拍照與分析。

2　結果與分析

2.1基因的克隆及重組質粒的構建

從中腸的cDNA中擴增得到BmV-ATPase B的基因片段，其大小為1 473 bp (圖1A)，與理論分子量相符。將目的片段進行TA克隆，獲得含有目的片段的重組質粒。以質粒為模板進行亞克隆。對陽性克隆質粒DNA 進行NdeⅠ、NotⅠ酶切鑒定，其產(chǎn)物包含載體和目的基因片段 (圖1B)，進一步測序驗證表明成功構建了原核表達載體p28-BmV-ATPase B。

2.2蛋白的原核表達、質譜鑒定與純化

將測序驗證正確的p28-BmV-ATPase B表達載體轉入Transetta (DE3) 表達菌株中。在不同條件下誘導該蛋白表達，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)蛋白在37 ℃誘導的條件下以包涵體的形式表達，(圖2A泳道3)，上清液中沒有明顯的目的條帶，并且重組蛋白分子質量大小約55 kDa，也與理論分子量相一致。16 ℃誘導的條件下由于誘導時間和溫度的差異未見明顯目的條帶 (圖2A泳道7)。將原核表達獲得的重組蛋白經(jīng)過質譜鑒定，發(fā)現(xiàn)共有16段肽段與理論序列相匹配，其中有代表性的6段序列與所處的位置如表2所示。質譜鑒定結果與理論蛋白序列相符，表明原核表達得到的蛋白為BmV-ATPaseB蛋白。

然后，采用37 ℃大量誘導重組蛋白。將獲得的包涵體蛋白用8 mol/L尿素溶液溶解，經(jīng)鎳柱親和層析純化，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)在1 mol/L咪唑洗脫時蛋白較純，但純化的目的蛋白質含量較低。為了獲得大量高純度重組蛋白以制備抗體，將100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L 和1 mol/L咪唑的洗脫液混合后進行超濾并切膠回收。電洗脫后，SDS-PAGE檢測透析蛋白，發(fā)現(xiàn)得到了較純蛋白 (圖2B)。使用Bradford方法測定純化的重組蛋白質量濃度為0.94 mg/mL，總量為20 mg，達到了抗體制備的要求。將獲得的重組蛋白免疫兔子，得到了效價較高、特異性較好的多克隆抗體。2.3Western blotting檢測

圖1　BmV-ATPase B瓊脂糖電泳檢測Fig. 1　Agarose electrophoresis of BmV-ATPase B. (A) Electrophoresis of the fragment of BmV-ATPase B gene. M: DNA marker; 1: BmV-ATPase B. (B) Double digestion of recombinant plasmid p28-BmV-ATPase B. M: DNA marker; 1: recombinant plasmid p28-BmV-ATPase B.

圖2　重組蛋白的誘導表達與純化檢測Fig. 2　SDS-PAGE analysis of the expression and the purification of recombinant proteins. (A) SDS-PAGE analysis of the expression of p28-BmV-ATPase B. M: protein molecular weight standard; 1–4: induced under 37 °C; 5–8: induced under16 °C; 1, 5: supernatant of p28-BmV-ATPase B; 2, 6: supernatant of p28; 3, 7: precipitation of p28-BmV-ATPase B; 4, 8: precipitation at of p28. (B) SDS-PAGE of the purified poteins. M: protein molecular weight standard; 1: recombinant-protein purified by gel recovery and electroelution.

利用制備的多克隆抗體，對5齡第3天及上蔟第1天前部、中部和后部絲腺進行Western blotting檢測 (圖3)，圖中只在目的蛋白相對分子量大小附近有條帶，說明多克隆抗體特異性較高。結果顯示無論是在5齡第3天還是上蔟第1天，該蛋白在前部絲腺的表達量最高，在中部絲腺及后部絲腺表達量相對較低。

表2　與理論序列相匹配的肽段及位置Table 2　Positions and peptides matching theoretical sequence

圖3　BmV-ATPase B蛋白在家蠶絲腺的Western blotting檢測Fig. 3　Western blotting analysis of BmV-ATPase B in the silk gland of Bombyx mori. 1–3: silk gland of silkworm on the 3rd day of 5th instar; 4–6: silk gland of the 1st day of wandering silkworm; 1, 4: anterior silk gland; 2, 5: middle silk gland; 3, 6: posterior silk gland; Anti-VB: antibody of BmV-ATPase B.

2.4免疫熒光定位

對5齡第3天及上蔟第1天家蠶的前部絲腺、中部絲腺及后部絲腺進行了免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)在這兩個時期BmV-ATPase B蛋白均定位到了絲腺的細胞層 (圖4紅色信號)。進一步通過激光共聚焦顯微鏡對5齡第3天的前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺進行了免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)BmV-ATPase B蛋白主要定位于絲腺的細胞膜，在細胞質中也有表達 (圖5)。

圖4　BmV-ATPase B蛋白在家蠶絲腺的免疫熒光定位Fig. 4　Immunofluorescence localization of the protein BmV-ATPase B in the silk gland of Bombyx mori. (A) The silk gland of silkworm on the 3rd day of 5th instar. (B) The silk gland of 1st day of wandering silkworm. ASG: anterior silk gland; MSG: middle silk gland; PSG: posterior silk gland; Anti-VB: antibody of BmV-ATPase B.

圖5　BmV-ATPase B蛋白在絲腺細胞中的定位Fig. 5　Immunofluorescence localization of the protein BmV-ATPase B in the silk gland cell of Bombyx mori by Laser confocal scanning microscopy. ASG: anterior silk gland; MSG: middle silk gland; PSG: posterior silk gland; Anti-VB: antibody of BmV-ATPase B; Cy: cytomembrane; Nu: nucleus; Cl: cuticular layer.

3　討論

V型ATP酶廣泛存在于真核細胞中的內膜系統(tǒng)上，由多個亞基偶聯(lián)起來利用ATP水解的能量介導氫離子的轉運[9-11,15]。而V-ATPase B作為催化結構域的一部分，廣泛存在于家蠶的各個組織中。有研究報道，BmV-ATPase B基因參與了家蠶對BmNPV病毒的抵抗[16]。但是目前，此基因在家蠶其他組織的功能仍然未見報道。因此，本研究首先對BmV-ATPase B基因進行了全長克隆，獲得了此基因的全長CDS序列，在此基礎上構建了原核表達載體p28-BmV-ATPase B。在Transetta (DE3) 表達菌株中誘導表達，發(fā)現(xiàn)該蛋白在37 ℃誘導的條件下以包涵體的形式成功表達。

有研究者將家蠶的前部絲腺在含有吖啶橙(細胞內部酸性指示劑) 的培養(yǎng)基中孵育，1 h后可以觀察到在絲腺頂端細胞膜有橙色熒光，然后加入V型ATP酶的抑制劑巴弗洛霉素A1，孵育1 h后橙色熒光消失[17]。這說明了V型ATP酶調控著家蠶絲腺細胞的酸化過程。本研究進一步對家蠶5齡第3天和上蔟第1天絲腺不同區(qū)段進行Western blotting實驗，結果表明BmV-ATPase B蛋白無論是在5齡第3天還是上蔟第1天在前部絲腺的表達量均高于中部絲腺和后部絲腺，這與王鑫等在轉錄水平的結果一致[5]。綜合以上結果，我們認為前部絲腺細胞的酸化過程是由V型ATP酶產(chǎn)生的質子泵而引起的。由于前部絲腺是絲蛋白構象發(fā)生轉變的場所[18]，所以我們推測V型ATP酶在前部絲腺的高量表達主要為了轉運大量的氫離子到絲腺腔內使絲蛋白的構象發(fā)生轉變。

最后本研究通過激光共聚焦顯微鏡對BmV-ATPase B蛋白在絲腺的表達情況進行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位于絲腺的細胞膜，在絲腺的細胞質中也有表達。這是因為V型ATP酶是一種廣泛存在于細胞內膜系統(tǒng)的膜蛋白[15,19]，細胞質中存在大量的細胞器，如線粒體、溶酶體、高爾基體等，V型ATP酶作為質子泵鉚定在細胞膜和細胞器膜上調控著管腔內的酸化過程[20]，所以BmV-ATPase B定位到了絲腺的細胞膜和細胞質中。

有研究稱在體外環(huán)境下伴隨著pH值的降低，絲蛋白的二級結構中β折疊的含量逐漸升高[21-22]。在蜘蛛中研究發(fā)現(xiàn)，蜘蛛絲蛋白N端的二聚化作用與pH的變化有密切關系，蜘蛛絲蛋白在pH≤5.0的條件下會發(fā)生凝膠化反應[23-24]。當pH從7.0降到5.0時，蜘蛛絲蛋白的C端區(qū)域不穩(wěn)定，會展開成為淀粉樣β片層，而N端區(qū)域的二聚物很穩(wěn)定，會鎖定絲蛋白成為多聚體，從而引起纖維化的形成[25]。也有研究發(fā)現(xiàn)在pH 6.0左右家蠶絲蛋白N端區(qū)域的二級結構會從無規(guī)卷曲轉變?yōu)棣抡郫B[26]。以上研究都證明了pH值的變化影響了絲纖維的形成過程，所以我們推測BmV-ATPase B蛋白在前部絲腺的表達量的改變可能會影響到氫離子的轉運，通過使絲蛋白構象變化進而影響絲纖維的性能。

因此，本研究將BmV-ATPase B基因作為絲纖維結構和性能改良的靶標，克隆了BmV-ATPase B基因，構建了原核表達載體表達蛋白并制備多克隆抗體。通過Western blotting和免疫熒光定位對該蛋白在家蠶不同時期絲腺中表達特征進行分析，對進一步探索和研究家蠶的成絲機理具有重要的理論和實踐意義。

REFERENCES

[1] Zong XH, Zhou P, Shao ZZ, et al. Effect of pH and Copper(II) on the conformation transitions of silk fibroin based on EPR, NMR, and Raman spectroscopy. Biochemistry, 2004, 43(38): 11932?11941.

[2] Miyake S, Azuma M. Acidification of the silk gland lumen in Bombyx mori [Lepidoptera: Bombycidae] and Samia cynthia ricini [Lepidoptera: Bombycidae] and localization of H+-translocating vacuolar-type ATPase. J Insect Biotechnol Sericol, 2008, 77: 9?11.

[3] Matsumoto A, Chen JS, Collette A, et al. Mechanisms of silk fibroin sol-gel transitions. J Phys Chem B, 2006, 110(43): 21630?21638.

[4] Huang JT, Zhu LJ. Study on the mechanism of silk fiberization. Bull Sericult, 1998, 29(3): 5?7 (in Chinese).黃君霆, 朱良均. 蠶絲的纖維化機理研究. 蠶桑通報, 1998, 29(3): 5?7.

[5] Wang X, Li Y, Chen QM, et al. Bioinformational analysis and expression pattern of V-ATPase of in silkworm(Bombyx mori). Scientia Agric Sin, 2014, 47(8): 1611?1621 (in Chinese).王鑫, 李懿, 陳全梅, 等. 家蠶空泡型ATP酶(V-ATPase)基因的基本信息及表達特征. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2014, 47(8): 1611?1621.

[6] Yi QY, Zhao P, Wang X, et al. Shotgun proteomic analysis of the Bombyx mori anterior silk gland: An insight into the biosynthetic fiber spinning process. Proteomics, 2013, 13(17): 2657?2663.

[7] Breton S, Brown D. Regulation of luminal acidification by the V-ATPase. Physiology, 2013, 28(5): 318?329.

[8] Lü P, Xia HC, Gao L, et al. V-ATPase is involved in silkworm defense response against Bombyx mori nucleopolyhedrovirus. PLoS ONE, 2013, 8(6): e64962.

[9] Beyenbach KW, Wieczorek H. The V-type H+-ATPase: molecular structure and function, physiological roles and regulation. J Exp Biol, 2006, 209(4): 577?589.

[10] Po?a-Guyon S, Ammar MR, Erard M, et al. The V-ATPase membrane domain is a sensor of granular pH that controls the exocytotic machinery.J Cell Biol, 2013, 203(2): 283?298.

[11] Rane HS, Bernardo SM, Hayek SR, et al. The contribution of Candida albicans vacuolar ATPase subunit V1B, encoded by VMA2, to stress response, autophagy, and virulence is independent of environmental pH. Eukaryot Cell, 2014, 13(9): 1207?1221.

[12] Williamson WR, Wang D, Haberman AS, et al. A dual function of V0-ATPase a1 provides an endolysosomal degradation mechanism in Drosophila melanogaster photoreceptors. J Cell Boil, 2010, 189(5): 885?899.

[13] Cheng Y, Wang XY, Hu H, et al. A hypothetical model of crossing Bombyx mori nucleopolyhedrovirus through its host midgut physical barrier. PLoS ONE, 2014, 9(12): e115032.

[14] Zhou ZH, Yang HJ, Chen M, et al. Comparative proteomic analysis between the domesticated silkworm (Bombyx mori) reared on fresh mulberry leaves and on artificial diet. J Proteome Res, 2008, 7(12): 5103?5111.

[15] Zhao JH, Rubinstein JL. The study of vacuolar-type ATPases by single particle electron microscopy. Biochem Cell Biol, 2014, 92(6): 460?466.

[16] Yang H, Chen H, Chen K, et al. Characterization and localization of the vacuolar-type ATPase in the midgut cells of silkworm (Bombyx mori). Z Naturforsch C, 2009, 64(11/12): 899?905.

[17] Azuma M, Ohta Y. Changes in H+_translocating vacuolar-type ATPase in the anterior silk gland cell of Bombyx mori during metamorphosis. J Exp Biol, 1998, 201(4): 479?486.

[18] Xie F, Zhang HH, Shao HL, et al. Effect of shearing on formation of silk fibers from regenerated Bombyx mori silk fibroin aqueous solution. Int J Biol Macromol, 2006, 38(3/5): 284?288.

[19] Merkulova M, P?unescu TG, Azroyan A, et al. Mapping the H+(V)-ATPase interactome: identification of proteins involved in trafficking, folding, assembly and phosphorylation. Sci Rep, 2015, 5: 14827.

[20] Dechant R, Binda M, Lee SS, et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. EMBO J, 2010, 29(15): 2515?2526.

[21] Yang YH, Shao ZZ, Chen X. Influence of pH value on the structure of regenerated Bombyx mori silk fibroin in aqueous solution by optical spectroscopy. Acta Chim Sin, 2006, 64(16): 1730?1736 (in Chinese).楊宇紅, 邵正中, 陳新. 光譜法研究pH值對再生桑蠶絲素蛋白在水溶液中結構的影響. 化學學報, 2006, 64(16): 1730?1736.

[22] Zhou P, Xie X, Knight DP, et al. Effects of pH and calcium ions on the conformational transitions in silk fibroin using 2D raman correlation spectroscopy and 13C solid-state NMR. Biochemistry, 2004, 43 (35): 11302?11311.

[23] Jaudzems K, Askarieh G, Landreh M, et al. pH-dependent dimerization of spider silk N-terminal domain requires relocation of a wedged tryptophan side chain. J Mol Biol, 2012, 422(4): 477?787.

[24] Gauthier M, Leclerc J, Lefèvre T, et al. Effect of pH on the structure of the recombinant C-terminal domain of Nephila clavipes dragline silk protein. Biomacromolecules, 2014, 15(12): 4447?4454.

[25] Andersson M, Chen GF, Otikovs M, et al. Carbonic anhydrase generates CO2and H+that drive spider silk formation via opposite effects on the terminal domains. PLoS Biol, 2014, 12(8): e1001921.

[26] He YX, Zhang NN, Li WF, et al. N-terminal domain of Bombyx mori fibroin mediates the assembly of silk in response to pH decrease. J Mol Biol, 2012, 418(3/4): 197?207.

(本文責編郝麗芳)

醫(yī)學與免疫生物技術

Gene cloning and expression characteristics of vacuolar-type ATPase subunit B in Bombyx mori

Huifang Chen, Xin Wang, Kang Xie, Yi Li, and Ping Zhao
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China

Abstract:Vacuolar-type ATPase (V-ATPase), located in the membrane and organelle membrane, is one of important H+-transporting proteins. It keeps the proton balance by transporting H+into vacuole, vesicle, or extracellular using the energy from ATP hydrolysis. The subunit B of the vacuolar-type ATPase (BmV-ATPase B) contains the ATP catalytic site, and plays an important role in this process. To study the function of V-ATPase B in Bombyx mori (BmV-ATPase B), we cloned its coding gene from the midgut of the 5th instar silkworm larvae. Then we constructed prokaryotic expression vector and produced the recombinant protein in E. coli. The recombinant protein was identified as BmV-ATPase B by mass spectrometry and purified using Ni-NTA affinity chromatography. This purified protein was used to immunize rabbit to generate polyclonal antibodies of BmV-ATPase B. Finally, the expression patterns of BmV-ATPase B in the silk gland were analyzed by western blotting and immunofluorescence. The full length CDS sequence of BmV-ATPase B was 1 473 bp. BmV-ATPase B was 55 kDa with a PI of 5.3. We analyzed the expression patterns of BmV-ATPase B in different sections of silk gland from the silkworm on the 3rd day of 5th instar and 1st day of wander stage by western blotting. BmV-ATPase B was expressed in all sections of the silk gland and it was abundant in the anterior silk gland (ASG) both in these two developmental stages. Furthermore, immunofluorescence indicated that BmV-ATPase B was located in the silk gland cells. Laser confocal scanning microscopy analysis revealed that BmV-ATPase B was mainly expressed in the cytomembrane of silk gland cells. These data elucidated the expression patterns of BmV-ATPase B in the silk gland of silkworm, which provides a good basis for further studies on the function of V-ATPase B in silk fiber formation.

Keywords:silkworm (Bombyx mori), BmV-ATPase B, gene cloning, prokaryotic expression, Western blotting, immunofluorescence localization

DOI:10.13345/j.cjb.150364

Corresponding author:Ping Zhao. Tel: +86-23-68250885; E-mail: zhaop@swu.edu.cn