人源NOVA1蛋白的真核表達(dá)及其抗低氧活性鑒定

李華玲，呂貝，孔玲，陳欣虹，朱素娟

1 揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，江蘇 揚(yáng)州　225001 2 揚(yáng)州大學(xué) 生技學(xué)院 生物化學(xué)教研室，江蘇 揚(yáng)州　225009

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人源NOVA1蛋白的真核表達(dá)及其抗低氧活性鑒定

李華玲1,*，呂貝1,*，孔玲1，陳欣虹1，朱素娟2

1 揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，江蘇 揚(yáng)州225001 2 揚(yáng)州大學(xué) 生技學(xué)院 生物化學(xué)教研室，江蘇 揚(yáng)州225009

李華玲, 呂貝, 孔玲, 等. 人源NOVA1蛋白的真核表達(dá)及其抗低氧活性鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 507–517.

Li HL, Lü B, Kong L, et al. Eukaryotic expression of human NOVA1 protein and identification of its anti-hypoxia activity. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 507–517.

摘要:構(gòu)建人NOVA1基因的真核表達(dá)載體pCMV-Myc-NOVA1，轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后篩選最佳轉(zhuǎn)染條件，進(jìn)而結(jié)合細(xì)胞免疫組織化學(xué)研究NOVA1蛋白在PC12細(xì)胞中的表達(dá)分布，并探究其抗低氧活性。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)NOVA1基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，以pCR4-TOPO-NOVA1載體為模板采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得NOVA1基因的全長(zhǎng)cDNA編碼序列，限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XhoⅠ雙酶切后插入pCMV-Myc真核表達(dá)載體，酶切及直接測(cè)序驗(yàn)證后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，針對(duì)轉(zhuǎn)染比例和轉(zhuǎn)染時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而采用實(shí)時(shí)定量PCR 和Western blotting檢測(cè)NOVA1蛋白的表達(dá)，最后采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)NOVA1蛋白在PC12細(xì)胞中的表達(dá)定位及其抗低氧活性。通過酶切和直接測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-Myc-NOVA1；質(zhì)粒和Lipo2000最佳轉(zhuǎn)染比例為1:2.5，最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為72 h；最佳轉(zhuǎn)染條件下NOVA1基因和蛋白的表達(dá)水平顯著增加，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒后，NOVA1蛋白主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；過表達(dá)NOVA1的PC12細(xì)胞增殖活性明顯增加。本文采用分子克隆的方法成功構(gòu)建了NOVA1基因的真核表達(dá)載體，通過條件優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)并測(cè)定過表達(dá)NOVA1蛋白具有明顯的抗低氧活性，不僅為深入揭示NOVA1蛋白的作用機(jī)理提供了重要參考，而且為NOVA1蛋白潛在的藥物開發(fā)提供了重要技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞:人源NOVA1蛋白，真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染，分布，抗低氧

Received: July 28, 2015; Accepted: October 22, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81100862, 8167050872, 2015CXJ070).

*These authors contributed equally to this study.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81100862, 8167050872, 2015CXJ070) 資助。

NOVA蛋白家族是一類僅表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的RNA結(jié)合蛋白[1-2]，作為神經(jīng)副腫瘤性眼陣攣共濟(jì)失調(diào)癥 (Paraneoplastic opsoclonus myoclonus ataxia，POMA) 的抗原而被最早發(fā)現(xiàn)，是第一個(gè)被確認(rèn)的哺乳動(dòng)物神經(jīng)特異性的剪接因子[3-4]。NOVA蛋白是序列特異性的RNA結(jié)合蛋白，通過其KH結(jié)構(gòu)域與靶基因mRNA前體中的YCAY基序結(jié)合，調(diào)控可變剪接過程[5-6]。目前已發(fā)現(xiàn)的NOVA家族成員主要包括NOVA1和NOVA2，NOVA1蛋白主要定位于間腦、腦干、脊髓腹側(cè)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，NOVA2蛋白主要定位于大腦皮質(zhì)、海馬和脊髓背側(cè)神經(jīng)元[7]。

NOVA1蛋白于1993年被Darnell等發(fā)現(xiàn)，因其與hnRNP K、MER1等蛋白均有KH結(jié)構(gòu)域，故而最初就被推測(cè)具有調(diào)控可變剪接的作用，且NOVA1在進(jìn)化上非常保守，人類、大鼠、小鼠的NOVA1氨基酸序列的同源性達(dá)99%，如此強(qiáng)的保守性表明NOVA1功能的重要性[8]。如今，通過生物化學(xué)、交聯(lián)與免疫共沉淀、微陣芯片及生物信息學(xué)分析，證明NOVA調(diào)控神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的可變剪接，而且神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼與神經(jīng)的刺激及抑制有關(guān)的突觸蛋白，這表明NOVA作為一種調(diào)控蛋白，它處于復(fù)雜的等級(jí)體系網(wǎng)絡(luò)的頂端[9]。目前通過多種技術(shù)方法的綜合運(yùn)用，對(duì)NOVA靶基因的研究取得很大的進(jìn)展，同時(shí)也對(duì)NOVA的功能有了更深刻的認(rèn)識(shí)，但是NOVA與其他疾病的關(guān)系涉及較少，因此進(jìn)一步研究NOVA與疾病的相關(guān)性變得尤為迫切?；诖?，我們采用PCR擴(kuò)增獲得了NOVA1基因的cDNA編碼序列，通過分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-Myc-NOVA1，通過轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化獲得了高效表達(dá)NOVA1蛋白的細(xì)胞株，且發(fā)現(xiàn)NOVA1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，并具有明顯的抗低氧活性，為進(jìn)一步研究NOVA1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控，特別是低氧條件下的調(diào)控奠定了重要基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

pCR4-TOPO-NOVA1和pCMV-Myc載體均購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；PC12細(xì)胞由南京師范大學(xué)郭志剛教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自日本OMEGA公司；限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、DL 2000 DNA marker均購(gòu)自TaKaRa公司；陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine-2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNAiso Plus試劑和SYBR?Premix Ex TaqTM染料法熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；兔抗大鼠NOVA1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；多聚賴氨酸、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)NOVA1 (NM_002515.2)基因全長(zhǎng)編碼序列，利用Primer Premer 5.0軟件進(jìn)行引物對(duì)設(shè)計(jì) (表1)，引物序列由北京英駿公司合成，–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2NOVA1基因PCR擴(kuò)增

以pCR4-TOPO-NOVA1載體為模板，按照如下加樣量進(jìn)行加樣：2 μL 10×PCR 緩沖液；2 μL dNTPs；2 μL DNA；各1 μL上下游引物；0.3 μL Ex Taq，ddH2O定容至20 μL，樣品混勻后按照如下PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，按照凝膠回收試劑盒所述步驟進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3pCMV-Myc-NOVA1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將上述回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pCMV-Myc載體采用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XhoⅠ于37 ℃水浴鍋酶切2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳分離后按照凝膠回收試劑盒所述步驟進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物采用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜。次日，全部轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布棒涂板后37 ℃恒溫箱孵育過夜待長(zhǎng)出克隆。挑取單克隆搖菌并提取質(zhì)粒后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶SalⅠ和XhoⅠ雙酶切，陽(yáng)性克隆放大培養(yǎng)后直接送英駿公司測(cè)序。

1.2.4PC12細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將液氮中凍存的PC12細(xì)胞復(fù)蘇，采用含100 mL/L馬血清、50 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋后，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化后按照3×105細(xì)胞/孔的比例加入六孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞融合度達(dá)80%?90%。按照Lipofectamine-2000說明書所述步驟，將空載體pCMV-Myc 和pCMV-Myc-NOVA1轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，設(shè)置為轉(zhuǎn)染組作為空白對(duì)照，并于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h收集細(xì)胞進(jìn)行總RNA和總蛋白提取。

同時(shí)，為了獲得質(zhì)粒與脂質(zhì)體的最佳轉(zhuǎn)染比例，針對(duì)pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒和脂質(zhì)體設(shè)置3個(gè)比例，分別為1∶2、1∶2.5和1∶3，于轉(zhuǎn)染后的72 h收集細(xì)胞進(jìn)行總RNA和總蛋白提取。

1.2.5細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將上述收集的PC12細(xì)胞采用PBS洗兩遍，加入500 μL RNAiso Plus試劑，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，然后將裂解液移入離心管；室溫靜置5 min，4 ℃、12 000×g離心10 min；吸取上清注入一新的離心管；每個(gè)離心管加入100 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，然后靜置3 min使其分層；4℃、

12 000×g離心15 min，小心吸取上層水相至一新的離心管，注意不要吸到中間白色蛋白層；每管加入250 μL異丙醇，顛倒混勻，–20 ℃放置1?2 h；4 ℃條件下離心 (12 000×g，20 min)，吸棄上清；每管加1 mL 75%乙醇 (用DEPC水配制)，蓋緊蓋子，將沉淀彈起，4 ℃、7 500×g離心5 min，離心后吸棄上清；再同樣輕速離心一次，吸棄上清，靜置5?10 min，使殘余液體揮發(fā)，注意不能時(shí)間過長(zhǎng)或加熱；每管加入20 μL DEPC水，使用紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度和濃度；RNA合格后用作反轉(zhuǎn)錄模板，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書所述步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為：2 μL 10×Fast RT緩沖液；1 μL RT 酶混合液；2 μL引物混合液，ddH2O定容至10 μL，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2 ℃15 min→95 ℃ 3 min 。

1.2.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)NOVA1 (Accession No. NM 002515.2)和GAPDH (Accesion No. NM 017008.4)基因序列，利用Primer Premer 5.0軟件軟件進(jìn)行引物對(duì)設(shè)計(jì) (表1)。應(yīng)用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量分析，參照SYBR?Premix Ex TaqTM說明書提供的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM；0.5 μL PCR 正向引物 (10 μmol/L)；0.5 μL PCR 反向引物(10 μmol/L)；0.5 μL ROX Reference DyeⅡ(50×)；2 μL cDNA，ddH2O定容至25 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s ；60 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后針對(duì)Ct值采用2–△△Ct公式進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.7細(xì)胞總蛋白提取

將上述收集的PC12細(xì)胞采用PBS洗兩遍，加入適量的細(xì)胞裂解液，然后放在冰上裂解30 min；采用細(xì)胞刮將細(xì)胞碎片刮至一邊，并轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的EP管，12 000×g離心15 min；將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管，采用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.8免疫印記檢測(cè)

將上述定量的35 μg總蛋白采用12%的SDSPAGE進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后按照說明書所述步驟轉(zhuǎn)印到PVDF膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜正面朝上放入5%脫脂牛奶封閉液，搖床上封閉至少30 min；封閉結(jié)束后，將PVDF膜正面朝上放入一抗工作液，包括兔抗大鼠NOVA1多克隆抗體 (1∶500稀釋) 和小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體 (1∶2 000稀釋)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，采用TBST室溫漂洗膜3次 (10 min/ 次)；采用辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶5 000稀釋) 和山羊抗鼠IgG (1∶5 000稀釋) 室溫孵育45 min，TBST洗3次 (10 min/次)，采用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行蛋白條帶顯影，采集圖片后利用Image J軟件進(jìn)行積分光密度分析，以目的條帶和內(nèi)參條帶的積分光密度比值作為蛋白強(qiáng)度指標(biāo)。

1.2.9免疫組化

按照2×105/mL的接種密度將PC12細(xì)胞懸液滴在六孔板中多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)15?30 min，再加入適量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。然后將六孔板置于冰上，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗5 min×3次，吸棄殘留PBS，空氣干燥，當(dāng)細(xì)胞表面微潮濕時(shí)加入4%多聚甲醛，固定30 min；固定結(jié)束后，吸棄4%多聚甲醛，ddH2O洗5 min×1次，PBS洗5 min×1次；加入3% H2O2(現(xiàn)用現(xiàn)配)，室溫孵育30 min以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，然后PBS洗5 min×3次；加入0.3% TritonX-100，通透細(xì)胞30 min，然后PBS洗5 min×3次；5% BSA室溫封閉20 min，然后傾去，勿洗；將玻片用鑷子小心取出，放在濕盒內(nèi)，滴加兔抗大鼠Nova1多克隆抗體(1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜；將濕盒取出，室溫平衡60 min，PBS洗5 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，PBS洗5 min×3次；滴加SABC試劑，37 ℃孵育20 min，PBS洗5 min×4次；DAB室溫顯色，ddH2O洗2?3次終止顯色；依次在75%、85%、95%、100%酒精中脫水，最后經(jīng)二甲苯透明；中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，采用Image Pro Plus軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.10PC12細(xì)胞缺氧模型的建立

PC12細(xì)胞消化后，按照1×104細(xì)胞/孔的比例接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞放入缺氧小室中，通入95% N2，5% CO2混合氣體1?2 min后關(guān)緊出氣口，繼續(xù)通4 min后關(guān)緊進(jìn)氣口；缺氧小室移入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別缺氧0 h、2 h、4 h、6 h和8 h。收集細(xì)胞后采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

1.2.11MTT檢測(cè)

向上述處理后單細(xì)胞加入MTT溶液(5 mg/mL)，20 μL/孔，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄上清。每孔加入150 μL DMSO振蕩5 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔OD值 (空白對(duì)照為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，空白孔調(diào)零)。記錄結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率= (試驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值) ×100%。

1.2.12統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果與分析

2.1pCMV-Myc-NOVA1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

設(shè)計(jì)的引物序列如表1所示。如圖1A所示，可見1 500 bp有特異的核酸條帶，與預(yù)期NOVA1基因的編碼序列大小一致；雙酶切后pCMV-Myc載體和NOVA1基因均出現(xiàn)了特異性條帶，條帶大小分別為3 800 bp和1 500 bp，與預(yù)期基本一致 (圖1B)；構(gòu)建完成的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后出現(xiàn)了明顯的兩條帶，條帶大小分別為1 500 bp和3 800 bp (圖1C)，說明目的基因NOVA1正確插入載體。

表1　NOVA1基因編碼區(qū)擴(kuò)增引物序列Table 1　Primers sequence for NO VA1 gene encoding region amplication

圖1　pCMV-Myc-NOVA1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定Fig. 1　Construction and identification of eukaryotic expression vector pCMV-Myc-NOVA1. (A) Identification of NOVA1 PCR product by 1% agarose gel electrophoresis. (B) Identification the digested product of pCMV-Myc and NOVA1 gene by 1% agarose gel electrophoresis. (C) Identification the digested product of pCMV-Myc-NOVA1 and pCMV-Myc by 1% agarose gel electrophoresis.

2.2pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間

設(shè)計(jì)合成的定量PCR擴(kuò)增引物如下表2所示。如圖2A所示，與pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h相比，轉(zhuǎn)染48 h、72 h和96 h NOVA1 mRNA表達(dá)水品顯著增加，轉(zhuǎn)染48 h到達(dá)峰值(**P<0.01)；隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，NOVA1蛋白的表達(dá)水平明顯增加，轉(zhuǎn)染72 h到達(dá)峰值 (圖2B，**P<0.01)。

2.3pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒與Lipofecamine 2000最佳轉(zhuǎn)染比例

如圖3A所示，隨著pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒與Lipofecamine 2000轉(zhuǎn)染比例的降低，NOVA1 mRNA的表達(dá)水平先增加后降低，二者的比例為1∶2.5時(shí)，NOVA1 mRNA的表達(dá)水平最高，且存在顯著性差異 (**P<0.01，與1∶2相比)。同樣地，NOVA1蛋白的表達(dá)水平隨著二者轉(zhuǎn)染比例的降低而增加，1∶2.5時(shí)達(dá)到最大值，且存在顯著性差異 (**P<0.01，與1∶2相比)。

表2　實(shí)時(shí)定量PCR鑒定引物序列Table 2　Primers sequence of qRT-PCR identification

圖2　實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間NOVA1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化Fig. 2　qPCR and Western blotting assay of the change of NOVA1 mRNA and protein at different transfection time. (A) Histogram analysis of the change of NOVA1 mRNA at different transfection time. (B) Western blotting and histogram analysis of the change of NOVA1 protein at different transfection time.

圖3　實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染比例NOVA1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化Fig. 3　qPCR and Western blotting assay of the change of NOVA1 mRNA and protein at different transfection ratio. (A) Histogram analysis of the change of NOVA1 mRNA at different transfection ratio. (B) Western blotting and histogram analysis of the change of NOVA1 protein at different transfection ratio.

2.4NO VA1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著增加

根據(jù)上述優(yōu)化的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間 (72 h) 和最佳轉(zhuǎn)染比例 (1∶2.5)，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting分別檢測(cè)了NOVA1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與Control和pCMV-Myc組相比，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒組NOVA1 mRNA的表達(dá)水平明顯增加，且存在顯著性差異 (圖4A，**P<0.01)。同樣地，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒后，NOVA1蛋白表達(dá)水平也明顯增加，二者存在顯著性差異 (圖4B，**P<0.01)。

圖4　實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測(cè)NOVA1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化Fig. 4　qPCR and Western blotting assay of the change of NOVA1 mRNA and protein. (A) Histogram analysis of the change of NOVA1 mRNA. (B) Western blotting and histogram analysis of the change of NOVA1 protein.

2.5轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒后NOVA1蛋白高效表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核

如圖5所示，Control和pCMV-Myc組，NOVA1蛋白主要表達(dá)分布于細(xì)胞核，且表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NOVA1組，NOVA1蛋白主要表達(dá)分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，且表達(dá)水平顯著增加。

圖5　細(xì)胞免疫組化檢測(cè)NOVA1蛋白亞細(xì)胞定位Fig. 5　Cell immunohistochemistry detection subcellular localization of NOVA1 protein.

2.6過表達(dá)NOVA1蛋白可顯著增加PC12細(xì)胞的增殖活性

如圖6所示，與Control和pCMV-Myc組相比，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NOVA1質(zhì)粒的PC12細(xì)胞增殖活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加，二者相比具有顯著性差異 (*P<0.05；**P<0.01).

圖6　MTT檢測(cè)細(xì)胞增值活性Fig. 6　Cell proliferation activity assay by MTT (n=3).

3　討論

在真核生物中，生物體需要很多不同的蛋白質(zhì)以保證生命活動(dòng)的進(jìn)行，從有限的基因產(chǎn)生多種多樣的蛋白質(zhì)的一種關(guān)鍵機(jī)制是pre-mRNA的可變剪接，至少75%的蛋白質(zhì)是經(jīng)可變剪接產(chǎn)生的，不論是普遍表達(dá)還是組織特異性的RNA結(jié)合蛋白，可變剪接過程對(duì)其都是非常重要的，尤其是像大腦這樣復(fù)雜的系統(tǒng)。許多研究發(fā)現(xiàn)在腦中確實(shí)存在著最大量的組織特異性剪接現(xiàn)象，如NOVA蛋白家族參與的可變剪接等[8]。

NOVA家族是一類特異性表達(dá)于腦組織的剪接因子，包括NOVA1和NOVA2兩個(gè)成員，其中，NOVA1于1993年被Darnell等發(fā)現(xiàn)，時(shí)隔5年，他們通過抗血清試驗(yàn)再次發(fā)現(xiàn)家族另一成員——NOVA2[7]。在大鼠腦中，NOVA1的表達(dá)幾乎遍布整個(gè)腦區(qū)，有試驗(yàn)表明NOVA1對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)展與存活是至關(guān)重要的[10]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明NOVA1可能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的應(yīng)激反應(yīng)，且NOVA1與腦血管疾病的治療過程中常發(fā)生的腦缺血再灌注損傷后的修復(fù)作用之間可能存在一定關(guān)系[11]，因此，為了深入揭示NOVA1的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能，我們構(gòu)建了其真核表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，以期為其新功能的開發(fā)提供重要技術(shù)參考。

基因重組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是一種研究特定基因的有效的分子生物學(xué)技術(shù)，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、過表達(dá)及免疫熒光成像等技術(shù)，在研究基因表達(dá)、蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要的作用[12-13]。因此，我們選取了能攜帶目的基因靶向性高效表達(dá)，并且容易操作的真核表達(dá)載體pCMV-Myc作為NOVA1基因的載體。基因轉(zhuǎn)染的方法包括病毒轉(zhuǎn)染法及非病毒轉(zhuǎn)染法。其中，病毒轉(zhuǎn)染法風(fēng)險(xiǎn)大，且病毒的免疫原性高、容量小、制備困難、成本較高[14-15]。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是目前細(xì)胞轉(zhuǎn)染最為普遍的方法之一。雖然脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率低于病毒載體，但它安全性較高、能夠多次轉(zhuǎn)染且操作簡(jiǎn)單、無免疫原性、不僅能感染分裂中的細(xì)胞，還能感染不分裂細(xì)胞、能攜帶不同大小的外源基因。因此，脂質(zhì)體有望成為基因治療中的基因轉(zhuǎn)染載體[16-17]。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的效率與細(xì)胞的狀態(tài)、脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)、質(zhì)粒的濃度、DNA和脂質(zhì)體的比例及轉(zhuǎn)染時(shí)間以及靶細(xì)胞的選擇性作用有關(guān)[18]。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞 (PC12細(xì)胞) 是由大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分離并建立的細(xì)胞系[19-20]，它具有神經(jīng)細(xì)胞的特性，可穩(wěn)定傳代，因而很多研究人員將其作為體外研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想細(xì)胞模型。因此，本研究將構(gòu)建并驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒pCMV-Myc-NOVA1，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入PC12細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測(cè)其表達(dá)效果，篩選最佳作用時(shí)間和最佳轉(zhuǎn)染比例，進(jìn)而確定其細(xì)胞表達(dá)分布。

通過研究發(fā)現(xiàn)，NOVA1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯增加，且最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為轉(zhuǎn)染后72 h，最佳轉(zhuǎn)染比例為1∶2.5。同時(shí)，過表達(dá)NOVA1蛋白不僅高效表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而且高效表達(dá)于細(xì)胞核，且過表達(dá)NOVA1蛋白的細(xì)胞增殖活性明顯增加。因此，本研究一方面為NOVA1蛋白的表達(dá)提供了重要技術(shù)支撐，另一方面為其新功能的開發(fā)提供了重要參考，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Eukaryotic expression of human NOVA1 protein and identification of its anti-hypoxia activity

Hualing Li1,*, Bei Lü1,*, Ling Kong1, Xinhong Chen1, and Sujuan Zhu2
1 Department of Biochemistry, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu, China 2 Department of Biochemistry, Life Science College of Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Abstract:The aim of this study was to construct the eukaryotic expression vector of pCMV-Myc-NOVA1 based on NOVA1 gene, and to screen the optimum expression condition after transfecting to PC12 cells, and further to explore the distribution of NOVA1 protein in PC12 cells using cell immunohistochemistry, and to identifyits anti-hypoxia activity. According to the NOVA1 gene sequence of NCBI database, we designed the upstream and downstream primers, and performed polymerase chain reaction (PCR) to amplify the full length cDNA coding sequence using pCR4-TOPO-NOVA1 as a template. The products were digested by restriction endonuclease SalⅠand XhoⅠ, and conjugated to the eukaryotic expression vector ofpCMV-Myc followed by validating by digestion and direct sequencing. Subsequently, the validated pCMV-Myc-NOVA1 was transfected to PC12 cells followed by optimizing of transfection ratio and transfection time, and identified by qPCR, Western blotting and cell immunohistochemistry respectively. After validation by digestion and direct sequencing, the eukaryotic expression vector of pCMV-Myc-NOVA1 was correctly constructed. The optimum transfection ratio of plasmid to Lipo 2000 was 1:2.5, and the optimum transfection time was 72 h. At the optimum transfection condition, the expression level of NOVA1 mRNA and protein significantly increased, and after transfection of pCMV-Myc-NOVA1, NOVA1 protein mainly distributed in cell nucleus and cytoplasm. After 6 h hypoxia, the cell proliferation activity was significantly increased compared to that of the control and pCMV-Myc group. Our findings provided a reference for exploring the mechanism of NOVA1, and also a technical support for potential drug development of NOVA1.

Keywords:human NOVA1 protein, eukaryotic expression vector, transfection, distribution, anti-hypoxia

DOI:10.13345/j.cjb.150345

Corresponding author:Sujuan Zhu. Tel: +86-514-87979022; E-mail: hlli@yzu.edu.cn