產(chǎn)恩拉霉素鏈霉菌的誘變及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁志雯，胡永紅，楊文革，吳 剛，顧鵬飛，王春曉

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211816）

產(chǎn)恩拉霉素鏈霉菌的誘變及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

丁志雯，胡永紅＊，楊文革，吳 剛，顧鵬飛，王春曉

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211816）

為滿足恩拉霉素工業(yè)化生產(chǎn)對高產(chǎn)菌株的需求，采用N＋注入技術和單因素及正交試驗方法對產(chǎn)恩拉霉素鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665進行誘變，并對目的菌株的最佳發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明：隨N＋注入劑量的增加，菌株的存活率呈典型的馬鞍型劑量－效應曲線。在最佳注射劑量120× 1013ions／cm2條件下篩選到1株具有遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)鏈霉菌突變菌株LD1；該菌株發(fā)酵最適培養(yǎng)基條件為蔗糖50g／L，酵母粉20g／L，NaCl 1.5g／L，F(xiàn)eSO40.5g／L；最佳發(fā)酵條件為轉速190r／min，溫度28℃，pH 7，接種量8%。在此條件下，發(fā)酵液恩拉霉素濃度達11 860μg／mL。

鏈霉菌；N＋誘變；恩拉霉素；發(fā)酵條件優(yōu)化

恩拉霉素（Enramycin）又名恩來霉素、安來霉素、持久霉素，商品名為恩拉鼎，是廣譜、高效、安全的多肽類抗生素。作為飼料添加劑，恩拉霉素具有穩(wěn)定性好、殺菌作用強、無交叉耐藥性和不會引起動物性食品藥物殘留等優(yōu)點［1－6］。

20世紀60年代恩拉霉素在日本首次發(fā)現(xiàn)后，人們對其理化性質(zhì)、抗菌活性、分析檢測和藥理等已進行了研究，同時，人們還就恩拉霉素產(chǎn)生菌以及不同C、N源對其產(chǎn)生菌的影響進行探索［7－9］。Eiji等［10］研究恩拉霉素產(chǎn)生菌的菌種形態(tài)和發(fā)酵條件時發(fā)現(xiàn)，從土壤中分離的菌株能形成多刺的螺形孢子絲、灰色的氣生菌絲。國內(nèi)外有關恩拉霉素菌種改良的報道極少，Ikuo等［11］對產(chǎn)持久霉素鏈霉菌Ⅰ（Streptomyces fungicidicus No.B5477）進行誘變發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵液恩拉霉素的濃度為4 530μg／mL，遠達不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。我國對恩拉霉素的研究起步較晚，且多集中在藥理學及其應用方面。筆者前期研究鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665發(fā)酵法產(chǎn)恩拉霉素的結果表明，其發(fā)酵液中恩拉霉素濃度僅6 360μg／mL，雖比Ikuo等［11］的產(chǎn)量高，但仍達不到生產(chǎn)要求。為此，筆者利用N＋注入技術和單因素及正交試驗方法對Streptomyces sp.NJWGY3665菌株進行N＋誘變，探索誘變后菌株的適宜培養(yǎng)基并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期尋找到高產(chǎn)恩拉霉素菌株滿足其工業(yè)化生產(chǎn)要求。

1 試驗材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株Streptomyces sp.NJWGY3665（自主篩選）。

1.1.2 培養(yǎng)基 參照文獻［12－14］的方法配制相關培養(yǎng)基。1）高氏合成一號。淀粉20g／L，KNO31g／L，K2HPO40.5g／L，MgSO4·7H2O 0.5g／L，NaCl 0.5g／L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g／L，瓊脂20g／L，pH 7.4。2）肉湯培養(yǎng)基。牛肉膏5g／L，蛋白胨10g／L，NaCl 5g／L，pH 7.2～7.3。3）種子液培養(yǎng)基。葡萄糖10g／L，玉米漿10g／L，CaCO310g／L，酵母粉5g／L，NaCl 1g／L，pH 7.0。4）發(fā)酵培養(yǎng)基。淀粉20g／L，玉米漿10g／L，酵母膏5g／L，CaCO310g／L，NH4Cl 5g／L，KH2PO42g／L，NH4SO43g／L，pH 7.0。5）斜面培養(yǎng)基。葡萄糖5g／L，牛肉膏5g／L，蛋白胨5g／L，K2HPO420g／L，NaCl 3g／L，K2HPO41g／L，瓊脂15g／L，pH 7.0。1.1.3儀器設備LZD900多功能N＋離子注入機，西南核物理研究所研制；DIONEX P680高效液相色譜儀，戴安公司；PYX－DHS電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；HYG－II a恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設備有限公司；HVE－50滅菌鍋，華粵行儀器有限公司；Universal 320R離心機，Hettich。

1.2 N＋注入誘變篩選恩拉霉素高產(chǎn)菌株

1.2.1 樣品前處理 將鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，取0.1mL菌液均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿中，以在顯微鏡下觀察無相互重疊的細胞為宜，用無菌風吹干后立即進行N＋注入。

1.2.2 不同能量N＋注入對菌株存活率的影響選取同一出發(fā)菌株，分別用能量5～15keV的N＋注入誘變，靶室真空度為10－3Pa，以5s脈沖式注入，間隔15s，注入3次。將經(jīng)過N＋注入的培養(yǎng)皿取出，用無菌水洗脫，適當稀釋后涂布于高氏一號平板上，置28℃下培養(yǎng)出單菌落，統(tǒng)計不同劑量處理菌落的存活數(shù)（計數(shù)單菌落數(shù)目）。以能量0keV處理菌落存活數(shù)為對照（CK），計算各注入劑量的菌落存活率，繪制存活率曲線。

1.2.3 不同能量N＋和不同劑量N＋注入對菌株突變率的影響

1）不同能量N＋注入對菌株突變率的影響。選取經(jīng)相同能量N＋注入處理后得到的單菌落接種斜面，培養(yǎng)后分別進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定恩拉霉素含量。根據(jù)3次重復的平均結果統(tǒng)計菌種的突變率。突變率的計算：對受輻射后的單菌落分別進行發(fā)酵試驗，以出發(fā)菌株作為對照，考察單位體積發(fā)酵液中恩拉霉素的含量。其中，產(chǎn)量比出發(fā)菌株低5%的視為負突變株，大于5%的為正突變株，產(chǎn)量變化在±5%的視為無意義突變株或試驗誤差。負突變率是指負突變株占全部被考察菌株的比率，正突變率是指正突變菌株占全部被考察菌株的比率，總突變率是指正、負突變率之和。

2）不同劑量N＋注入對菌株突變率的影響。采用能量為10keV的N＋，以（30～180）×1013ions／cm2為處理劑量對菌株進行誘變篩選，根據(jù)3次重復的平均結果計算突變率。

1.2.4 高產(chǎn)菌株的篩選 將挑選出的單菌落重新活化，用管碟法測其產(chǎn)生恩拉霉素能力。將菌液在最佳注入劑量120×1013ions／cm2下進行N＋注入誘變處理，適當稀釋后涂布于平板上，挑取單菌落進行抑菌圈試驗，并進行搖瓶培養(yǎng)，應用高效液相色譜（HPLC）進行檢測。

1.2.5 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性測試 將菌液在最佳注入劑量120×1013ions／cm2下進行N＋注入誘變處理，適當稀釋后涂布于平板上，挑取單菌落進行抑菌圈試驗，并進行搖瓶培養(yǎng)，應用高效液相色譜（HPLC）進行檢測。

1.3 突變菌株LD1發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.1 培養(yǎng)基

1）碳源的篩選。試驗設6個處理，即分別添加碳源濃度為3%的甘露醇、甘油、麥芽糖、海藻糖和葡萄糖作為碳源替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的淀粉，以發(fā)酵培養(yǎng)基作對照（CK）。發(fā)酵6d后測定各處理菌株的生長及恩拉霉素的含量。

2）氮源的篩選。試驗設6個處理，即在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加優(yōu)化的碳源，然后分別添加氮源濃度為3%的蛋白胨、乙酸胺、多價胨、硫酸銨和酵母粉作為氮源代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母膏，以發(fā)酵培養(yǎng)基作對照（CK）。發(fā)酵6d后測定各處理菌株生長及恩拉霉素的含量。

3）無機鹽的確定。試驗設5個處理，即在培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.3%的NaCl，KCl，MgSO4，CuSO4和FeSO4，發(fā)酵6d后測定各處理菌株的生長及恩拉霉素的含量。

4）正交試驗設計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)單因素試驗結果選擇C源、N源和無機鹽等因素，設計L9（43）正交試驗對培養(yǎng)基配比進行優(yōu)化。

1.3.2 突變菌株LD1發(fā)酵條件的優(yōu)化

1）最適起始pH的篩選。試驗設5個處理，即在搖瓶裝液量100mL／500mL、接種量10%、溫度28℃及搖床轉速220r／min條件下，分別測定培養(yǎng)基起始pH為5、6、7、8和9時，培養(yǎng)6d后突變菌株的生長情況及恩拉霉素的含量。

2）最適培養(yǎng)溫度篩選。試驗設5個處理，即在搖瓶裝液量100mL／500mL、接種量10%、pH7及搖床轉速220r／min條件下，分別測定培養(yǎng)溫度為25℃、28℃、30℃、32℃和37℃時，培養(yǎng)6d后突變菌株的生長情況及恩拉霉素的含量。

3）最適轉速篩選。試驗設5個處理，即在搖瓶裝液量100mL／500mL、接種量10%、pH 7及溫度28℃條件下，分別測定轉速為150r／min、180r／min、200r／min、220r／min及250r／min時，培養(yǎng)6d后突變菌株的生長情況及恩拉霉素的含量。

4）最適接種量篩選。試驗設7個處理，即在搖瓶裝液量50mL／500mL、溫度28℃、pH 7及搖床轉速170r／min條件下，分別測定接種量為2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%時，培養(yǎng)6d后突變菌株的生長情況及恩拉霉素的含量。

5）正交設計優(yōu)化發(fā)酵條件。根據(jù)單因素試驗結果選擇轉速（A）、溫度（B）、pH（C）和接種量（D）等4個因素，設計L9（43）正交試驗對突變菌株LD1的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Origin 8.0對相關數(shù)據(jù)進行繪圖；利用Design Expert 6.0軟件進行Plackett－Burman（PB）正交試驗設計。

2 結果與分析

2.1 N＋注入鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665的存活率

從圖1可知，在N＋注入劑量＜40×1013ions／cm2時，隨N＋注入劑量的增加，菌株存活率迅速降低，當劑量達40×1013ions／cm2時，存活率有短暫的回升，后又逐漸下降，整個過程呈馬鞍型變化曲線；注入劑量超過150×1013ions／cm2后存活率趨于零。原因可能是離子注入細胞的射程較短，低劑量時離子只對細胞表面進行損傷和刻蝕，能量沉積所產(chǎn)生的大量自由基導致DNA和生物膜等其他生物大分子損傷，從而造成存活率下降；隨著劑量繼續(xù)增加，大量連續(xù)注入電荷的堆積產(chǎn)生很強的庫侖斥力，該斥力對被注入的細胞形成保護屏障，阻礙后續(xù)注入離子對細胞的損傷，而且大量堆積的電荷形成一個弱電場，該電場的刺激效應可以激活菌內(nèi)的各種修復機制和修復酶，誘導Mn－SOD（錳超氧化物歧化酶）和CAT（過氧化氫酶）的酶活性升高，從而使得菌株存活率有所回升；當劑量上升到一定程度時，聚集于細胞表面的電荷產(chǎn)生庫侖爆炸，細胞失去電荷屏蔽而使存活率再次下降。綜上所述，在注入能量相同條件下，輻射劑量為120×1013ions／cm2時，菌株的成活率最高。

圖1 N＋注入鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665的存活率Fig.1 Survival rate of strain Streptomyces sp.NJWGY3665with N＋injection

2.2 N＋注入鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665的突變率

從圖2可知：1）不同能量N＋注入。N＋注入能量5～15keV時，菌株Streptomyces sp.NJWGY3665的突變率呈先升高再降低的趨勢，在注入能量5keV時突變率最高，達90%。其中，N＋注入能量為15keV時引起菌株Streptomyces sp.NJWGY3665的正突變率明顯小于5keV和10keV，可能是由于注入能量太高使DNA損傷過于嚴重所致。因此，確定N＋的最佳注入能量為10keV。2）不同劑量N＋注入。隨著N＋注入劑量的增加菌株Streptomyces sp.NJWGY3665的正突變率呈先增大后減小的趨勢。其中，注入劑量為120×1013ions／cm2時突變率最高，達93%，且此時其正突變率高于負突變率。表明，以該注量進行N＋注入可獲得較多的正突變菌株，有助于篩選工作的進行。因此，120×1013ions／cm2為最佳注入劑量。

圖2 不同能量和劑量N＋注入鏈霉菌Streptomycessp.NJWGY3665的突變率Fig.2 Mutation rate of strain Streptomyces sp.NJWGY 3665with different energy and injection dose of N＋

2.3 突變菌株LD1的遺傳穩(wěn)定性

采用N＋注入技術得到1株高產(chǎn)突變菌株，命名為鏈霉菌LD1。從表1可知，對突變菌株LD1進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，其1～4代恩拉霉素的產(chǎn)量均超過7 800μg／mL，4代后仍保持較高的發(fā)酵能力，各代恩拉霉素的產(chǎn)量均較原始菌株高，表明其具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665與突變菌株LD1傳代培養(yǎng)的恩拉霉素生成量Table 1 Yield of enduracidin fromStreptomyces sp.NJWGY3665and mutant strain LD1μg／mL

2.4 不同培養(yǎng)基對突變菌株LD1產(chǎn)恩拉霉素的影響

從圖3可知：1）碳源。各處理突變菌株LD1恩拉霉素的產(chǎn)量依次為葡萄糖＞淀粉＞甘露醇＞麥芽糖＞甘油＞海藻糖，其中，添加葡萄糖的最高，為8 208μg／mL，表明，葡萄糖是菌體生長良好的碳源和能源。因此，采用葡萄糖作為初始碳源，而從產(chǎn)素和經(jīng)濟角度考慮可將淀粉作為后期碳源。2）氮源。各處理突變菌株LD1恩拉霉素的產(chǎn)量依次為酵母粉＞酵母膏＞蛋白胨＞多價胨＞乙酸胺＞硫酸銨，其中，添加酵母粉的最高，為8 322μg／mL，是最有利于恩拉霉素生產(chǎn)的氮源，且有機氮源的效果明顯好于無機氮源。因此，選擇酵母粉作為恩拉霉素發(fā)酵中的氮源。3）無機鹽。各處理突變菌株LD1恩拉霉素的產(chǎn)量依次為FeSO4＞NaCl＞KCl＞MgSO4＞CuSO4，其中，NaCl和FeSO4提高恩拉霉素效價的效果最明顯，其恩拉霉素產(chǎn)量分別為9 349.3μg／mL和9 170μg／mL。4）正交試驗。從表2可知，根據(jù)以上試驗結果選擇碳源、氮源及無機鹽分別為葡萄糖、酵母粉、NaCl及FeSO4，其用量分別為葡萄糖3%、5%和8%，酵母粉2%、3%和4%， NaCl 0.15%、0.30%和0.60%，F(xiàn)eSO40.02%、0.05%和0.10%。正交試驗結果（表3）表明，B因素的極差最大（R＝4 563.70），即酵母粉的含量對試驗效果影響作用較大。因此，碳、氮和無機鹽的最佳配方比例為A2B1C2D2，即蔗糖50g／L＋酵母粉20g／L＋NaCl 1.5g／L＋FeSO40.5g／L。

表2 突變菌株LD1發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗各處理恩拉霉素的生成量Table 2 Enduracidin yield of mutant strain LD1in the orthogonal test of fermentation medium

圖3 不同碳源、氮源和無機鹽處理突變菌株LD1的恩拉霉素生成量Fig.3 Enduracidin yield of mutant strain LD1with different carbon source，nitrogen source and inorganic salt

表3 突變菌株LD1發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗各因素恩拉霉素生成量的均值與極差Table 3 Mean value and range of enduracidin yield of mutant strain LD1in the orthogonal test of fermentation medium

2.5 突變菌株LD1發(fā)酵條件的優(yōu)化

從圖4可知，不同搖瓶發(fā)酵條件下突變菌株LD1產(chǎn)恩拉霉素的量存在差異。1）培養(yǎng)基的初始pH。隨培養(yǎng)基初始pH的升高，發(fā)酵液中恩拉霉素含量呈先升高再降低的趨勢。其中，以初始pH7為宜，此時發(fā)酵液中恩拉霉素含量最高，為9 060μg／mL。偏酸或偏堿對菌體發(fā)酵產(chǎn)恩拉霉素均不利。2）溫度。隨培養(yǎng)溫度升高，發(fā)酵液中恩拉霉素含量呈先升高再降低的趨勢。其中，培養(yǎng)溫度為28℃時，菌株發(fā)酵產(chǎn)恩拉霉素的量最高，為9 242μg／mL。3）轉速。隨轉速加快，發(fā)酵液中恩拉霉素含量呈先升高再降低的趨勢。其中，轉速為170r／min時，發(fā)酵液中恩拉霉素含量最高，為9 642μg／mL。4）接種量。隨接種量加大，發(fā)酵液中恩拉霉素含量呈先緩慢升高再降低的趨勢。其中，接種量達6%時恩拉霉素的效價最高，為9 396μg／mL；之后繼續(xù)增加接種量效價隨之緩慢下降。5）正交試驗。從表4可知，根據(jù)以上試驗結果選擇初始pH 6、7和8，溫度26℃、28℃和30℃，轉速150r／min、170r／min和190r／min，接種量4%、6%和8%進行發(fā)酵條件優(yōu)化。正交試驗結果（表5）表明，B因素的極差最大（R＝3 491.95），即溫度對試驗效果影響作用較大。因此，最佳發(fā)酵條件為A3B2C2D3，即轉速190r／min、溫度28℃、pH 7及接種量8%。

表4 突變菌株LD1發(fā)酵條件正交試驗各處理恩拉霉素的生成量Table 4 Enduracidin yield of mutant strain LD1in the orthogonal test of fermentation conditions

表5 突變菌株LD1發(fā)酵條件正交試驗各因素恩拉霉素生成量的均值與極差Table 5 Mean value and range of enduracidin yield of mutant strain LD1in the orthogonal test of fermentation conditions

圖4 不同最適起始pH、培養(yǎng)溫度、轉速和接種量處理恩拉霉素的生成量Fig.4 Enduracidin yield of LD1with different optimal initial pH，temperature，rotation speed and inoculum size

3 結論與討論

利用N＋注入技術對產(chǎn)恩拉霉素鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665進行誘變，經(jīng)不同劑量的N＋注入后，菌株的存活率呈典型的馬鞍型劑量－效應曲線。在最佳注射劑量120×1013ions／cm2下篩選到1株具有良好遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)突變菌株LD1，其恩拉霉素產(chǎn)量為7 800μg／mL。表明，離子注入技術能夠應用于恩拉霉素高產(chǎn)菌株的誘變選育。此項技術對微生物菌種選育而言具有較高的突變率和較寬的突變譜，誘變效果好。

單因素及正交試驗的結果表明，鏈霉菌（Streptomyces sp.）NJWGY3665突變菌株LD1的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖50g／L＋酵母粉20g／L＋NaCl 1.5g／L＋FeSO40.5g／L；最佳發(fā)酵條件為轉速190r／min＋溫度28℃＋pH 7＋接種量8%。在上述最適培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件下，發(fā)酵液中恩拉霉素濃度達11 860μg／mL，符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。

本試驗是搖瓶發(fā)酵的結果，今后還將進行5L 及50L發(fā)酵罐的放大生產(chǎn)研究，優(yōu)化恩拉霉素分離純化工藝，提高恩拉霉素純度，實現(xiàn)恩拉霉素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，助推我國綠色農(nóng)用生物制品的規(guī)模化發(fā)展。

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（責任編輯：王 海）

Inducing of Streptomyces Strain Producing Enduracidin and Optimization of Fermentation Conditions

DING Zhiwen，HU Yonghong＊，YANG Wenge，WU Gang，GU Pengfei，WANG Chunxiao
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing，Jiangsu211816，China）

In order to meet the demand of industrialized production for high－yield strains producing enduracidin，the N＋implantation technique was used for inducing the strain producing enduracidin Streptomycessp.NJWGY3665and the best fermentation condition of the high－yield strains was optimized through single factor and orthogonal experimental design.Results：With different doses of N＋injected，the survival rate of the strain showed a typical saddle dose－response curve.Under the preferred dose 120×1013ions／cm2，a high yield and good genetic stability strain LD1was screened；The best medium of Streptomyces sp.NJWGY3665were as follows：sucrose 50g／L，yeast powder 20g／L，NaCL 1.5g／L，F(xiàn)eSO40.5g／L and the optimum fermentation conditions were：speed 190r／min，temperature 28℃，pH 7，inoculum 8%，In these conditions，the enduracidin concentration reached 11 860μg／mL in the fermented liquid

Streptomyces；N＋inducing；enduracidin；optimization of fermentation conditions

S154.39；Q935

A

1001－3601（2016）07－0302－0072－05

2015－12－29；2016－05－26修回

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目“一種新型高效動物專用多肽類生長調(diào)節(jié)劑恩拉霉素的發(fā)酵關鍵技術研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)”

［CX（12）3063］

丁志雯（1992－），女，在讀碩士，研究方向：微生物發(fā)酵。E－mail：18260037906＠163.com

＊通訊作者：胡永紅（1968－），女，教授，博士，從事綠色農(nóng)用生物制品研究。E－mail：yonghonghu11＠126.com