滇重樓內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性分析

施 蕊，夏 菁，王 娟，葉 敏，趙一鶴，李 彪，4＊

（1.西南林業(yè)大學(xué)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南昆明650224；2.云南省林業(yè)科學(xué)院云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，云南昆明650201；4.云南宏綠辣素有限公司，云南昆明650500）

滇重樓內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性分析

施 蕊1，夏 菁1，王 娟2，葉 敏3，趙一鶴1，李 彪3，4＊

（1.西南林業(yè)大學(xué)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室，云南昆明650224；2.云南省林業(yè)科學(xué)院云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，云南昆明650201；4.云南宏綠辣素有限公司，云南昆明650500）

為了解滇重樓內(nèi)生菌的多樣性及其抗菌能力，采用切塊法分離內(nèi)生菌，采用形態(tài)學(xué)觀察法初步鑒定內(nèi)生真菌，采用對峙試驗法分析內(nèi)生菌的抗菌活性。結(jié)果表明：從滇重樓植物中分離到98株內(nèi)生真菌，經(jīng)微生物學(xué)形態(tài)觀察，初步鑒定歸屬于4個目，6個科和12個屬。分別是根霉屬（Rhizopus）、鐮孢菌屬（Fusarium）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、束絲菌屬（Ozonium）、組絲核菌屬（Sclerotium）、青霉屬（Penicillium）、頭孢霉屬（Cephalosporium）、梳霉屬（Kickxella）、筒孢霉屬（Cylindrium）、剛毛孢屬（Pleiochaete）、小單頭孢霉屬（Acremoniella）及孔球孢屬（Gilmaniella）。對植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有抑菌效果的共有8株，其中PPC－78和PPC－43對供試病原菌的抑菌效果最強，PPC－43對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌菌絲生長的抑菌率分別為88.76%、93.67%和82.31%，而PPC－78的抑制率分別是93.55%、100.00%和95.88%。

滇重樓；內(nèi)生真菌；抑菌活性

內(nèi)生真菌是指生活在植物組織內(nèi)部而不引起植物組織明顯癥狀的真菌［1－2］。植物內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中天然組成成分，能促進寄主植物適應(yīng)環(huán)境，加強系統(tǒng)生態(tài)平衡。內(nèi)生真菌能分泌毒素或抗生物質(zhì)；內(nèi)生真菌在分類單位上與病原菌接近，可作為生物防治中有潛力的生物農(nóng)藥開發(fā)［3］。植物內(nèi)生菌一方面能維持植物微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)；另一方面能占據(jù)植物組織內(nèi)微生態(tài)位，抵御外來菌的入侵。

滇重樓〔Paris polyphylla Smith var.yunnansensis（Franch.）Hand〕分布于云南、貴州和四川，生長在海拔1 400～3 100m的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌叢或草坡，根莖入藥，有清熱解毒、消腫止痛及涼肝定驚之功效，用于疔腫癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛及驚風(fēng)抽搐等癥［4］。滇重樓在我國有悠久的藥用歷史，隨著新藥的研究開發(fā)，重樓成為著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片和抗病毒顆粒等產(chǎn)品的主要原料，制藥工業(yè)的需求量逐年遞增［5－6］。由于滇重樓種子有二次休眠現(xiàn)象［7］，種苗繁育存在巨大困難。因此，目前滇重樓的繁殖方法主要是根莖切塊繁殖和組織培養(yǎng)等，但在育苗過程中創(chuàng)口和組培苗易受到病原菌侵染，導(dǎo)致重樓根腐病大面積發(fā)生，造成嚴重的經(jīng)濟損失。為解決這一問題，筆者通過分離維持滇重樓微生態(tài)穩(wěn)定的內(nèi)生真菌，并篩選具有抗真菌活性的菌株，以期篩選能夠抵御外來病菌的內(nèi)生菌，為滇重樓的幼苗繁育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 滇重樓塊莖 滇重樓塊莖于2014年采自于云南省普洱市鎮(zhèn)沅縣中草藥種植基地百草園。

1.1.2 培養(yǎng)基 試驗培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 供試病原菌 供試病原菌由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室提供，供病原菌株編號及其病原菌名稱見表1，采用的病原菌均為植物土傳病害病菌。

1.2 滇重樓內(nèi)生菌分離及鑒定

取健康重樓植株的根狀莖，棄泥土，用水沖洗干凈，晾干水分，按照以下步驟進行表面殺菌處理：0.2%升汞消毒10～30s，無菌水沖洗，75%酒精消毒10～60s，無菌水沖洗。在無菌條件下將重樓樣品切成2cm×2cm的小塊，種植于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)5～10d，觀察培養(yǎng)基中有菌落形成后挑取菌落轉(zhuǎn)接入PDA斜面培養(yǎng)基中，按常規(guī)微生物學(xué)方法分離、純化和保藏。分離得到的菌株分別用PPC－01、PPC－02、PPC－03……按順序編號。

表1 供試病原菌的編號及名稱Table 1 Names and number of pathogenic fungi

采用真菌學(xué)插片培養(yǎng)方法，對分離獲得的內(nèi)生真菌進行顯微形態(tài)觀察，進行分類鑒定［8－9］。

1.3 抑菌性測定

滇重樓內(nèi)生真菌的抑菌活性測定采用平皿對峙培養(yǎng)法，各供試病原菌和滇重樓內(nèi)生真菌置28℃黑暗條件下培養(yǎng)3d后，用打孔器（直徑6mm）沿其菌落邊緣打菌餅，將內(nèi)生真菌與病原菌菌餅接種于PDA平板上距中心15mm處同一直線上的兩點中，同時以只接病原菌和內(nèi)生真菌的平板作為對照，每處理重復(fù)3次，分別置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每24h觀察1次，并分別測量病原菌菌落指向內(nèi)生真菌菌落的半徑和內(nèi)生真菌菌落指向病原菌菌落的半徑。

1.4 抑菌率計算方法

滇重樓內(nèi)生真菌對病原菌的抑菌率公式：

抑菌率＝（對照病原菌菌落半徑－病原菌菌落指向內(nèi)生真菌菌落的半徑）／對照病原菌菌落半徑× 100%

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓內(nèi)生真菌的分類

從滇重樓植物中分離到98株內(nèi)生真菌，經(jīng)微生物學(xué)形態(tài)觀察初步鑒定為4目6科12個屬（表2）。其中，叢梗孢目有7個屬；毛霉目僅有1個屬。

表2 滇重樓內(nèi)生真菌的種群結(jié)構(gòu)組成Table 2 Population structure of endophytic fungi in P.polyphylla

2.2 滇重樓內(nèi)生真菌對病原菌的抑菌率

由表3可見，滇重樓內(nèi)生真菌PPC－78和PPC－43對供試的植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有很強的抑制作用，其抑菌率均在82%以上，且PPC－78對尖孢鐮刀菌的抑制率達100%。內(nèi)生菌PPC－25的抑菌效果較好，對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌的抑制率在58.83%～72.81%。內(nèi)生真菌PPC－03、PPC－21、PPC－32、PPC－71和PPC－73對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌也有不同程度的抑菌效果。

表3 滇重樓內(nèi)生真菌對病原菌的抑菌率Table 3 Antimicrobial activity of endophytic fungi in P.polyphyllaon pathogenic fungi%

3 結(jié)論與討論

從滇重樓植物中分離到98株內(nèi)生真菌，經(jīng)微生物學(xué)形態(tài)觀察，初步鑒定屬于毛霉目、瘤痤孢目、無孢目和叢梗孢目4個目，毛霉科、瘤痤孢科、無孢菌科、叢梗孢科單孢亞科、叢梗孢科多孢亞科和暗梗孢科單孢亞科6個科，根霉屬、鐮孢菌屬、絲核菌屬、束絲菌屬、組絲核菌屬、青霉屬、頭孢霉屬、梳霉屬、筒孢霉屬、剛毛孢屬、小單頭孢霉屬和孔球孢屬12個屬。該結(jié)果與孫桂麗等［10］研究相似，其結(jié)果是從云南重樓中塊莖中分離得到166株內(nèi)生真菌，分別歸屬于毛霉目、瘤痤孢目、無孢目和叢梗孢目4個目，毛霉科、瘤痤孢科、無孢菌科、叢梗孢科單孢亞科、叢梗孢科多孢亞科和暗梗孢科單孢亞科6個科，20個屬；但本研究結(jié)果與王世林等［11］的研究結(jié)果有所差異。本研究分離得到的滇重樓內(nèi)生真菌的數(shù)量和歸屬較孫桂麗等研究少，可能原因：一方面分離的滇重樓樣本差異，另一方面分離滇重樓內(nèi)生菌的培養(yǎng)基比較單一。盡管分離得到的滇重樓內(nèi)生真菌與前人的研究有所差異，但也在一定程度上反映了滇重樓內(nèi)生真菌的多樣性較豐富。此外，要充分研究滇重樓內(nèi)生真菌多樣性，需要采集不同年份和不同生境的滇重樓樣本，同時采用多種培養(yǎng)基配方進行分離。對于滇重樓內(nèi)生真菌抑菌的原理，需要進一步研究滇重樓內(nèi)生真菌與病原菌的營養(yǎng)競爭和生態(tài)位競爭等關(guān)系，同時研究內(nèi)生真菌代謝物的抑菌活性以及在不同培養(yǎng)條件下代謝物的活性大小。

通過對峙試驗，98株滇重樓內(nèi)生真菌中，對植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有抑菌效果的共有8株，編號分別是PPC－03、PPC－21、PPC－25、PPC－32、PPC－43、PPC－71、PPC－73 和PPC－78，其中PPC－78和PPC－43對供試病原菌的抑菌效果最強，抑菌效果均在82.31%以上，且PPC－78的抑制率均在90%以上。

［1］Petrini O.Fungal endophytes of tree leaves［C］／／Andrews J H，Hirano S S.Microbial Ecology of Leaves.New York：Springer Verlag，1991：179－197.

［2］Stone J K，Bacon C W，White J F.An overview of endophytic microbes：endophytian defined［C］／／Bacon C W，White J F.Microbial Endophytea.New York：Marcel Dekker，2000：3－29.

［3］孔慶科，丁愛云.內(nèi)生細菌作為生防因子的研究進展［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2001，32（2）：256－260.

［4］衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：183.

［5］李 恒.重樓屬植物［M］.北京：科學(xué)出版，1998.

［6］任安芝，高玉葆.植物內(nèi)生真菌一類應(yīng)用前景廣闊的資源微生物［J］.微生物學(xué)通報，2001，28（6）：90－93.

［7］王麗萍，趙學(xué)偉.云南重樓野生馴化及栽培技術(shù)研究初探［J］.中國野生植物資源，2002，21（1）：62.

［8］巴尼特，亨 特.半知菌屬圖解［M］.沈崇堯，譯.北京：科學(xué)出版社，1997.

［9］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

［10］孫桂麗，陳有為，夏國興，等.云南重樓植物內(nèi)生真菌的分離及抗菌活性篩選［J］.微生物學(xué)雜志，2005，25 （6）：59－62.

［11］王世林，周立剛，李 英，等.滇重樓寄生菌的研究［J］.微生物學(xué)報，1999，39（2）：160－163.

（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Separation and Antimicrobial Activity of Endophytic Fungi in Paris polyphylla

SHI Rui1，XIA Jing1，WANG Juan2，YE Min3，ZHAO Yihe1，LI Biao3，4＊

（1.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Foresty Adiministration，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224；2.Key Laboratory of Conservation of Rare，Endangered and Endemic Forest Plants，State Forestry Administration，Kunming，Yunnan650204；3.Key Laboratory of the Ministry of Education for Agro－Biodiversity and Pest Management，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201；4.Yunnan Honglv Capsacin Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650500，China）

In order to research endophytic fungi diversity of P.polyphyllaand their inhibition activity.The endophytic fungi were isolated from tuber of P.polyphylla and identified by using morphological method，the inhibition activity were tested by the dural culture method.Results：98endophytic fungi were collected from tuber of P.polyphylla，through morphologic observation of microbiology，they were belonged to four orders，six family and twelve genera，which were Rhizopus，F(xiàn)usarium，Rhizoctonia，Ozonium，Sclerotium，Penicillium，Cephalosporium，Kickxella，Cylindrium，Pleiochaete，Acremoniella，Gilmaniella，respectively.Eight of all endophytic fungus had antimicrobial activity on Rhizoctoniasolani，F(xiàn)usariumoxysporum，Phytophtoraparasitica var.nicotianae，which were pathogenic and could infect plant via soil.The fungi marked PPC－78and PPC－43have strong inhibiting effect on tested pathogenic fungi，inhibition ratio of PPC－43on Rhizoctoniasolani，F(xiàn)usariumoxysporum，Phytophtoraparasiticavar.nicotianae were 88.76%，93.67%，2.31%，and inhibition ratio of PPC－78were 93.55%，100.00%，95.88%respectively.

Paris polyphylla；endophytic fungi；antimicrobial activity

Q939.5

A

1001－3601（2016）07－0301－0069－03

2015－01－15；2016－07－02修回

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項項目“高產(chǎn)脂思茅松良種選育及功能基因克隆與鑒定”（201304105）；云南省科技計劃對外科技合作計劃－國際科技合作項目“滇牡丹重要經(jīng)濟性狀研究與綜合利用技術(shù)引進”（2015IA005）；云南生物資源保護與利用國家重點實驗室開放基金項目“牡丹油化妝品在天然化妝品中的應(yīng)用研究”（2015）；云南省科技計劃重點新產(chǎn)品開發(fā)項目“蒜頭果新品種選育及其神經(jīng)酸產(chǎn)品開發(fā)研究”（2015BB018）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目“竹子花青素生物合成途徑及其基因調(diào)控機理研究”（2013FA054）

施 蕊（1982－），女，講師，博士，從事民族藥用植物資源的開發(fā)利用工作。E－mail：shirui0227＠163.com

＊通訊作者：李 彪（1987－），男，工程師，博士，從事生物多樣性保護、生物農(nóng)藥研發(fā)工作。E－mail：biaobiao201＠163.com