大麥SERK基因家族cDNA克隆及生物信息學分析

楊沙沙，李穎波，譚何新，郭桂梅，何 婷，陳志偉，劉成洪*，黃劍華*

（1上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106；3第二軍醫(yī)大學藥學院，上海200433）

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大麥SERK基因家族cDNA克隆及生物信息學分析

楊沙沙1，2，3，李穎波2，譚何新3，郭桂梅2，何 婷2，陳志偉2，劉成洪2*，黃劍華2*

（1上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106；3第二軍醫(yī)大學藥學院，上海200433）

摘 要：通過對大麥體細胞胚胎發(fā)生受體類蛋白激酶SERK（Somatic embryogenesis receptor-like kinases）基因家族進行注釋和基因克隆，得到3條大麥序列，即HvSERK1、HvSERK2和HvSERK3，其中基因HvSERK3與相應已有參考序列（Accession：AK374641）相比，編碼氨基酸有所改變。生物信息學分析表明：3條大麥SERK基因都具有1 870 bp左右的開放閱讀框，620 aa左右的氨基酸殘基數(shù)，69 kD左右的相對分子質(zhì)量大小，平均理論等電點5.5，說明SERK為酸性蛋白；大麥SERK蛋白具有強烈的親水性，且存在N端信號肽和跨膜螺旋區(qū)，二級結(jié)構(gòu)組件主要是環(huán)（loop）。本研究為進一步探討大麥中SERK基因家族的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大麥；SERK；注釋；克??；生物信息學分析

體細胞胚胎發(fā)生受體類蛋白激酶（Somatic embryogenesis receptor-like kinases，SERKs）廣泛存在于植物體內(nèi)，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和各類脅迫響應過程［1］。有關(guān)SERK基因的功能已在模式植物擬南芥［2-8］和一些重要禾本科作物如水稻［9-11］、小麥［12］和玉米［13］中都有研究報道，但大麥中有關(guān)SERK基因家族的信息還有待研究。

大麥（Hordeum vulgare L.）是僅次于水稻、小麥和玉米的第四大谷類作物，普遍用作麥芽制造、啤酒釀造、飼料生產(chǎn)和食品加工，其適應性廣泛，具有較強的耐旱、耐寒和耐鹽特性，近年來已成為重要的遺傳和生理模式作物［14］。因此，對大麥中的耐逆性相關(guān)的基因開展深入研究，將有助于揭示大麥對環(huán)境較強適應性的分子機制，為禾谷類作物的耐逆性育種研究提供基礎(chǔ)。

在前期研究工作中，Gao等［15］利用Affymetrix基因芯片，對大麥鹽脅迫響應基因的表達水平進行了轉(zhuǎn)錄譜分析，獲得了3 326個差異表達基因，其中探針contig5422_at在大麥耐鹽性較強的品種中檢測到，注釋為Brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1 precursor，進一步序列比對分析確認該基因?qū)儆赟ERKs基因家族。本研究在此基礎(chǔ)上對大麥中SERKs基因家族的cDNA進行了全長克隆、驗證和生物信息學分析，以便進一步開展大麥中SERKs基因功能研究。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料為大麥品種‘花30’，由上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所提供。

用濕潤紗布包裹種子于28℃恒溫條件下催芽，至種子露白后移種到營養(yǎng)土中，人工氣候室中培養(yǎng)至兩葉一心期時，取新鮮葉片液氮速凍于-70℃，用于總RNA提取。

1.2方法

1.2.1大麥SERK家族基因的注釋及同源性分析

在PLEXdb網(wǎng)站（http://www.plexdb.org/modules/PD_probeset/annotation.php）中檢索獲得contig5422_ at探針序列；以contig5422_at探針序列為參照，利用大麥全基因組數(shù)據(jù)庫IPK（http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php）進行BLAST分析［16］，Database設(shè)為“full length cDNA”；利用ClustalX2軟件進行多序列比對并用GeneDoc軟件對比對結(jié)果進行編輯，從而顯示序列間相似性和特征性保守區(qū)段；利用MEGA 5.0軟件，對部分禾本科植物的SERK家族基因及8個大麥序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；禾本科植物SERK蛋白序列同源比對采用NCBI上的Blastp程序完成。

1.2.2總RNA提取和cDNA合成

利用TRNzol試劑（北京天根生化科技有限公司）提取大麥‘花30’葉片的總RNA；RNA質(zhì)量檢測采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳的方法，RNA濃度［C（μg/μL）= A260×40×稀釋倍數(shù)/1 000］采用紫外分光光度計來測定；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3基因克隆及測序驗證

根據(jù)目標研究基因在GeneBank中已知的cDNA序列，利用Vector NTI軟件設(shè)計特異性引物（表1），確保引物無回文結(jié)構(gòu)（Palindromes）和重復序列（Repeats）等。以RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行RT-PCR反應，用于擴增基因全長并測序驗證。

表1　引物設(shè)計Table 1 Design of primers

1.2.4生物信息學分析

利用網(wǎng)站PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）在線預測SERK蛋白二級結(jié)構(gòu)；其他所用生物信息學軟件和網(wǎng)站參照參考文獻［17］。

2　結(jié)果與分析

2.1大麥SERK家族基因的注釋及同源性分析

在IPK數(shù)據(jù)庫中比對后，得到8個與探針contig5422_at相似性較高的全長cDNA序列，即AK372118 （99%）、AK252995（83%）、AK374641（78%）、AK371411（68%）、AK251794（68%）、AK358689（68%）、AK363516（68%）和AK360261（69%）。其中前3個序列的同源性明顯高于其他5個基因，且E-value值為0.0，本研究將這3個大麥序列分別暫命名為HvSERK1（AK372118）、HvSERK2（AK252995）和HvSERK3 （AK374641）。

圖1　8個大麥氨基酸序列和5個擬南芥SERK蛋白序列的多重比對Fig.1 Multiple alignment of 8 barley amino acid sequences and 5 Arabidopsis SERK protein sequences

上述8個大麥氨基酸序列和5個擬南芥SERK蛋白序列（AtSERK1—5）的多重比對，結(jié)果顯示（圖1）：Leucine zipper結(jié)構(gòu)域中，擬南芥AtSERK1—3和大麥HvSERK1—3都具有完整的“Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu”共識序列，而擬南芥AtSERK4、AtSERK5和其他5個大麥序列只具有“Leu-X6-Leu-X6-Leu/Leu-X6-Leu”的不完整結(jié)構(gòu)。除了5個大麥序列的LRR5結(jié)構(gòu)域變化較大，所有參與比對的SERK序列LRR1—LRR5結(jié)構(gòu)域都具有很高的一致性。SPP結(jié)構(gòu)域是SERK蛋白區(qū)別于其他LRR-RLKⅡ成員的特征性結(jié)構(gòu)域［18］，大麥HvSERK1—3和擬南芥AtSERK1—3都具有此結(jié)構(gòu)域，而擬南芥AtSERK4、AtSERK5和其他5個大麥序列缺失，且5個大麥序列與其他所有SERK基因的同源性最低。

圖2　大麥及其他禾本科植物SERK蛋白序列的NJ樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of SERK protein sequences in barley and other grasses

2.1.1禾本科植物SERK家族基因的進化樹

為進一步確認大麥SERK基因家族成員和物種進化，該試驗對常見禾本科植物水稻、小麥、玉米以及菠蘿中的已知SERK蛋白［19］進行了多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析。

圖2顯示，整個進化樹由2個進化分支構(gòu)成：3個大麥SERK序列HvSERK1 （AK372118）、HvSERK2（AK252995）和HvSERK3（AK374641）與其他禾本科植物的SERK蛋白序列同位于1個分支，即分支Ⅰ。其中，禾本科植物的SERK又可分為3組：大麥HvSERK1與小麥TaSERK1、水稻OsSERK1、玉米ZmSERK1聚為一類，HvSERK1與TaSERK1同源性最高；大麥HvSERK2與小麥TaSERK2以及玉米ZmSERK2、ZmSERK3聚為一類，HvSERK2與TaSERK2同源性最高；大麥HvSERK3與水稻OsbiSERK1以及菠蘿AcSERK1、AcSERK2和AcSERK3聚為一類，HvSERK3與OsbiSERK1同源性最高。分支Ⅱ中包含了其他的5個大麥序列（AK358689、AK363516、AK371411、AK360261和AK251794），與禾本科植物的SERK序列位于不同分支，遺傳距離較遠，可能屬于其他類型的RLK基因。

2.1.2序列同源性分析

根據(jù)系統(tǒng)進化樹結(jié)果，對分支Ⅰ中所有禾本科植物和大麥中的3個SERK蛋白序列進行了同源性比對（表2），結(jié)果表明：大麥HvSERK1蛋白與TaSERK1、OsSERK1和TaSERK2具有較高同源性，分別為98%、94%和92%；大麥HvSERK2蛋白與TaSERK2、OsSERK1和TaSERK1具有較高同源性，分別為99%、91%和91%；大麥HvSERK3蛋白與OsbiSERK1、AcSERK1具有較高同源性，分別為93%、91%。3條大麥SERK蛋白之間的同源性在87%—91%。

表2　大麥與其他禾本科植物SERK蛋白同源性比較Table 2 Homology comparison of SERK proteins in barley and other grasses

2.2大麥SERK基因克隆

通過PCR擴增后經(jīng)測序驗證得到了3條與預期片斷大小（2 077 bp、1 929 bp和1 896 bp）一致的目的條帶。使用Vector NTI Advance11軟件包中的AlignX軟件和NCBI中的BLAST程序?qū)y序結(jié)果與已有參考序列的ORF區(qū)域及其翻譯的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，與相應的已有參考序列（Accession：AK374641）相比，大麥HvSERK3基因的測序序列存在3個堿基位點（160、941和1113）的突變和3組密碼子（TGC→CGC、TAC→TTC、CTT→CTC）的改變，其中密碼子TGC→CGC和TAC→TTC分別導致了編碼氨基酸的突變：半胱氨酸（C）→精氨酸（R），酪氨酸（Y）→苯丙氨酸（F），屬于非同義突變（圖3）。其他2個克隆序列與參考序列都是完全一致，未發(fā)現(xiàn)任何核苷酸和氨基酸的突變。

圖3　大麥HvSERK3基因ORF區(qū)核苷酸及氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence in ORF region of barley HvSERK3 gene

2.3大麥SERK蛋白序列理化參數(shù)的檢索和分析

對大麥及模式植物擬南芥SERK蛋白序列的理化參數(shù)進行分析比較，結(jié)果顯示（表3），大麥和擬南芥SERK基因的蛋白參數(shù)基本一致。理論等電點（pI）值均為5.5左右，所帶氨基酸殘基比例都是酸性大于堿性，表明SERK蛋白呈弱酸性。大麥和擬南芥SERK蛋白所含主要氨基酸中，Leu的含量始終最高（13.7%），亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）和絲氨酸（Ser）等其次。不同的是，大麥和擬南芥SERK蛋白均為不穩(wěn)定蛋白，除了大麥HvSERK1的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白?？偲骄杷跃鶠樨撝?，說明大麥和擬南芥SERK蛋白具有很強親水性，均屬于親水性蛋白。

表3　SERK蛋白序列的理化參數(shù)分析Table 3 Analysis of SERK protein sequences’physicochemical parameters

2.4大麥SERK蛋白親疏水性的預測和分析

蛋白質(zhì)折疊過程中會形成疏水內(nèi)核和親水表面，其折疊情況和相應的親疏水性序列譜（Profile）可以由ProtScale程序繪制完成［20］。大麥SERK蛋白親疏水性預測結(jié)果顯示（圖4），分值（Score）越低，表明此區(qū)域親水性越強；反之，疏水性則越強。HvSERK1蛋白在第255位氨基酸處具有最高分2.126，第399位氨基酸處具有最低分-2.089；HvSERK2在第23位具有的最高分2.142，第400位具有最低分-2.321；HvSERK3在第245位具有最高分值2.089，第393位具有最低分值-2.021；3條序列的親水區(qū)域都要大于疏水區(qū)域，均為親水性蛋白。對擬南芥SERK蛋白序列進行分析，結(jié)果與大麥SERK蛋白一致。結(jié)合上述ProtPram預測的結(jié)果可知，大麥SERK蛋白是親水性蛋白，表現(xiàn)為親水性。

圖4　大麥SERK蛋白親疏水性的預測Fig.4 Prediction of barley SERK proteins’hydrophobicity and hydrophilicity

2.5大麥SERK蛋白導肽的預測和分析

利用工具“TargetP 1.1 Server”在線預測大麥和擬南芥SERK蛋白序列，將置信區(qū)間設(shè)為0.95。結(jié)果顯示（表4），HvSERK1、HvSERK2和HvSERK3三條大麥SERK蛋白的導肽預測可靠性分別為IV級、IV級、V級，HvSERK1可能具有分泌途徑信號肽，且在蛋白序列第30位存在一個導肽分裂位點，無法確定HvSERK2、HvSERK3是否具有導肽，也未發(fā)現(xiàn)其導肽分裂位點。AtSERK1、AtSERK2、AtSERK3、AtSERK4 4條擬南芥SERK蛋白的導肽預測可靠性均為Ⅰ級，說明可靠性很大，很可能都具有分泌途徑信號肽，且分別在蛋白序列第23位、第29位、第25位、第33位存在一個導肽分裂位點；AtSERK5蛋白的導肽預測可靠性為Ⅲ級，也可能具有分泌途徑信號肽，且導肽分裂位點位于第24位氨基酸。

表4　SERK蛋白的導肽預測Table 4 Prediction of SERK proteins’leader peptide

2.6大麥SERK蛋白信號肽的預測和分析

信號肽（Signal peptide）是蛋白質(zhì)肽鏈N端包含16—30個氨基酸的一段多肽，可以引導蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移到特定亞細胞結(jié)構(gòu)或分泌到胞外［20］。為了驗證和進一步確認上述導肽預測結(jié)果，利用SignalP 4.1 Server工具在線預測和分析大麥SERK蛋白信號肽（圖5）?；赮-max和S-mean值判定，3條大麥SERK蛋白N末端均存在信號肽：HvSERK1和HvSERK2剪切位點在第30位點和第31位點間，成熟蛋白啟動（包括）的位點是31，信號肽區(qū)為前30個氨基酸；HvSERK3剪切位點在第22位點和第23位點間，成熟蛋白啟動（包括）的位置是23，信號肽區(qū)為前22個氨基酸。對擬南芥SERK蛋白序列預測，也獲得到相似結(jié)果：AtSERK1信號肽區(qū)為前27個氨基酸；AtSERK2信號肽區(qū)為前28個氨基酸；AtSERK3信號肽區(qū)為前26個氨基酸；AtSERK4信號肽區(qū)為前30個氨基酸；AtSERK5信號肽區(qū)為前25個氨基酸?；赟-mean和D值，進一步說明大麥SERK蛋白是分泌蛋白，可能被跨膜分泌到特定亞細胞結(jié)構(gòu)或細胞外起作用。

圖5　大麥SERK蛋白的信號肽預測分析Fig.5 Prediction and analysis of barley SERK proteins’signal peptide

2.7大麥SERK蛋白的跨膜區(qū)預測和分析

跨膜蛋白通過與胞外信號分子結(jié)合，從而轉(zhuǎn)導胞外信號［20］。利用TMHMM服務器在線預測和分析大麥SERK蛋白的跨膜區(qū)（圖6），結(jié)果表明：對于HvSERK1蛋白，跨膜螺旋（TMhelix）區(qū)預測位置位于243—265處的氨基酸殘基處，構(gòu)成了一個跨膜區(qū)；對于HvSERK2蛋白，跨膜螺旋（TMhelix）區(qū)預測位置位于10—32和244—266處的氨基酸殘基處，構(gòu)成了2個跨膜區(qū)；對于HvSERK3蛋白，跨膜螺旋（TMhelix）區(qū)預測位置位于237—259處的氨基酸殘基處，構(gòu)成了一個跨膜區(qū)。對擬南芥SERK蛋白的跨膜區(qū)進行分析，結(jié)果與大麥相似：除AtSERK1蛋白具有2個跨膜螺旋區(qū)外，AtSERK2、AtSERK3、AtSERK4和AtSERK5蛋白均具有一個跨膜螺旋區(qū)。因此可確定大麥SERK蛋白是一個跨膜蛋白，具有轉(zhuǎn)導細胞信號的功能。

圖6　大麥SERK蛋白的跨膜區(qū)預測Fig.6 Prediction of barley SERK proteins’membrane-spanning region

2.8大麥SERK蛋白二級結(jié)構(gòu)的預測和分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（Secondary structure）組件包括α-螺旋（α-helix）、β-折疊（β-sheet）、無規(guī)則卷曲（coil）及模體（motif）等［20］。利用PredictProtein預測大麥SERK蛋白二級結(jié)構(gòu)（表5），結(jié)果顯示：環(huán)狀結(jié)構(gòu)（loop）是大麥SERK蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組件；所含氨基酸殘基中，暴露氨基酸和包埋氨基酸等此外全部的氨基酸的比例基本一致。對擬南芥SERK蛋白進行同樣預測，結(jié)果與大麥SERK蛋白一致，即蛋白二級結(jié)構(gòu)中都是富含環(huán)狀結(jié)構(gòu)（loop）。

表5　SERK蛋白的二級結(jié)構(gòu)和溶劑可及性預測Table 5 Prediction of SERK proteins’secondary structure and solvent accessibility

2.9大麥SERK蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測和分析

2個或多個結(jié)構(gòu)域組合并折疊成的三維結(jié)構(gòu)，即蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)（Tertiary structure）［20］。利用Phyre2線串法預測蛋白質(zhì)折疊，運算模式設(shè)為“Normal”，結(jié)果如圖7所示。

圖7　大麥SERK蛋白三維結(jié)構(gòu)預測Fig.7 Prediction of barley SERK proteins’three-dimensional structure

利用基于PROCHECK程序的在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗工具“PDBsum Generate”，從多個角度對預測蛋白模型的健康度進行評估，得到Ramachandran圖（圖8）和G-Factors值。大麥HvSERK1、HvSERK2和HvSERK3蛋白氨基酸殘基落在最佳區(qū)（紅色）的比例為85.0%、86.8%和87.2%，小于90%，說明3條大麥SERK蛋白的空間構(gòu)象需要進一步優(yōu)化，并沒有落在最有利區(qū)；但是最佳區(qū)和次允許區(qū)（棕色）的總比例均大于90%，說明3條大麥SERK蛋白具有相對合理的空間結(jié)構(gòu)；大麥HvSERK2和HvSERK3不允許區(qū)（淺色）的比例分別為0.9%和0.4%（低于1%），大麥HvSERK1不允許區(qū)比例為1.3%（高于1%），說明HvSERK2和HvSERK3的蛋白結(jié)構(gòu)模型穩(wěn)定性較好，HvSERK1穩(wěn)定性較差。3條大麥SERK蛋白的GFactors值分別為0.05、0.06和0.04，大于-0.5，說明它們的空間結(jié)構(gòu)屬于正常范圍內(nèi)，是常見結(jié)構(gòu)。

圖8　大麥SERK蛋白Ramachandran圖Fig.8 Ramachandran map of barley SERK proteins

3　結(jié)論與討論

該研究以自主育成的啤酒大麥品種‘花30’為材料，通過同源克隆方法獲得了大麥SERK家族3個基因的cDNA全長序列，其中2個基因的cDNA全長序列與國際大麥測序聯(lián)盟（IBSC）公布的序列完全一致，而另一個基因HvSERK3與相應已有參考序列（Accession：AK374641）對比，有3個核苷酸的非同義突變以及編碼氨基酸的變化。推測該序列變化可能是與克隆所用大麥材料不同有關(guān)，是否有功能上的差別還有待于深入研究。

SERKs具有多重作用，且家族成員間同時存在功能冗余和分化的現(xiàn)象。如，在模式植物擬南芥中，At-SERK1和AtSERK2參與植物花粉發(fā)育過程［2-3］；AtSERK1、AtSERK3/BAK1和AtSERK4/BKK1參與植物BR信號通路［4，8］；AtSERK3/BAK1和AtSERK4/BKK1參與植物先天免疫反應［5，7］；AtSERK3/BAK1和AtSERK4/BKK1參與調(diào)節(jié)細胞死亡［4，6］。常見禾本科植物水稻的SERK基因家族中，只有OsSERK2基因參與水稻對白葉枯?。?1］和稻瘟?。?-10］的免疫反應。本研究對大麥SERK家族基因的核苷酸及氨基酸序列的理化特征、結(jié)構(gòu)特點和功能等預測和分析，其中可以發(fā)現(xiàn)大麥中的3個SERK基因在一些理化特征上仍然存在差別：如HvSERK1為穩(wěn)定蛋白，而HvSERK2和HvSERK3為不穩(wěn)定蛋白；HvSERK1和HvSERK3具有一個跨膜區(qū)域，HvSERK2具有2個跨膜區(qū)域等。大麥中這3個SERK基因在功能上，特別是對外界環(huán)境中生物脅迫和非生物脅迫響應是否存在差異，還有待于在本研究基礎(chǔ)上展開深入研究。

參 考 文 獻

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（責任編輯：程智強）

Cloning and bioinformatics analysis of SERK gene family in barley（Hordeum vulgare L.）

YANG Sha-sha1，2，3，LI Ying-bo2，TAN He-xin3，GUO Gui-mei2，HE Ting2，CHEN Zhi-wei2，LIU Cheng-hong2*，HUANG Jian-hua2*
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding/Biotech Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；3School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China）

Abstract：By annotation and cloning of barley SERK gene family，three barley sequences（HvSERK1，HvSERK2 and HvSERK3）were obtained，and the alignment with the corresponding reference sequence（Accession：AK374641）showed that the HvSERK3 gene’s amino acid sequence somewhat varied.The bioinformatics analysis indicated that the 3 barley SERK genes have the open reading frame（ORF）of about 1 870 bp，the amino acid residues of some 620 aa and the molecular weight of approximately 69 kD，and their theoretic isoelectric point is averagely 5.5，showing that the SERK are acidic proteins；The SERK are high in hydrophilicity and have signal peptide at N-terminus and transmembrane helix region，and the predicted secondary structures are mainly “l(fā)oop”.This research has laid the basis for further functional study of barley SERK gene family.

Key words：Barley（Hordeum vulgare L.）；SERK；Annotation；Cloning；Bioinformatics analysis

中圖分類號：S512.3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-005-09

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.02

收稿日期：2016-03-28

基金項目：上海市自然科學基金（15ZR1436600）；上海市種業(yè)發(fā)展項目［滬農(nóng)科種字（2016）第1-1號］；大麥青稞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-05）

作者簡介：楊沙沙（1990—），女，在讀碩士，研究方向：大麥分子育種。E-mail：ayxyss0915@163.com

*通信作者：黃劍華，E-mail：sw1@saas.sh.cn；劉成洪，E-mail：liuchenghong@saas.sh.cn